文档：酶活测定方法

已有研究表明，PBDEs可以诱导动物体活性氧的产生，因而可以将抗氧化酶作为PBDEs的生物标记物()

研究发现，多数海洋发光菌中有SOD酶()

污染物进入生物体后，可能导致生物体产生一系列生理生化特征变化，因此，

测定生物体生理生化指标及酶活性变化有助于揭示毒性作用机制。对于混合物

暴露时，氧化应激机制与单一污染物暴露是否相似？联合毒性效应变化与氧化

应激机制有何内在关系？是这一部分要关注的主要内容。本研究拟采用扫描电

子显微镜（SEM）观察混合暴露后生物体细胞性状的变化；采用Bradford 法考

察生物体蛋白含量变化情况；用分光光度法测定斜生栅藻暴露于混合物后叶绿

素a 含量变化情况。超氧化物歧化酶（SOD）的活性采用氮蓝四唑（NBT）光化

还原法测定；脂质过氧化产物丙二醛（MDA）的含量用TBA 比色法测定[7,14,26]。

为了分析联合毒性机制，我们在测定筛选出的6 组加和、协同、拮抗混合

物的剂量——效应曲线的同时，设置与剂量——效应曲线浓度系列一致、染毒

时间相同的一系列混合体系样品，测定它们的叶绿素a 含量、SOD 活性、MDA

含量变化情况，绘制出剂量——效应——叶绿素a 含量、剂量——效应——SOD

活性、剂量——效应——MDA 含量三维关系图，考察混合体系联合毒性效应变

化与生理生化指标变化之间的关系，并与单一化合物的相应结果进行比对，结

1、粗酶液的提取()

方法1()：参照孙利芹等［19］的方法，量取待测藻液50 mL，4 000 r /min 下离心15 min，收集藻细胞沉淀物，加入适量0． 05 mol /L 磷酸缓冲液，置于冰水浴中超声波破碎藻细胞，超声功率为150 W，超声时间20 min，镜检无完整细胞后，4 ℃下离心15 min，取上清液用于酶活性分析。

方法2：取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入2ml

50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。

2、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）

2.1、试剂的配制

（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：

A母液：0.2mol/L溶液: 取Na2HPO4•12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4•2H2O（分子量156.01）31.2g。分别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。

（2）14.5mM甲硫氨酸Met溶液：取2.1637g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至1000ml。

（3）30μM EDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。

（4）60μM核黄素溶液：取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。

（5）2.25mM 氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.1840g NBT用PBS定容至100ml，避光保存。

2、酶活性测定

（1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液0.6ml，缓冲液5.4ml，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀；

（2）分别取3ml反应混合液和30μl酶液于试管中

（3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反应20min；

同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30μl PBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。 （4）以不照光的对照管（只有缓冲液并置于暗处）调零后，避光测OD560(出现颜色即可测定)。

（5）酶活性计算：SOD活性单位以抑制NBT光化还原50％所需酶量（测的样品值要在最大管的一半左右才合适，否则要调整酶量）为1个酶活单位（u）。

SOD总活性＝ /（1/2Ack×W×Vt）

SOD比活力＝SOD总活性/蛋白质含量

SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/g FW）；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml,1.6ml，加入PBS的体积)；Vt为测定时的酶液用量（ml，30ul）；W为样品鲜重（g，测定时应换算为叶绿体的质量mg）；蛋白质含量单位为mg/g。

酶活性计算方法2():

一个酶活力单位( U) 定义为能引起反应初速度( 指不加酶提取液时) 半抑制时的酶用量，按下式计算求得:

U =（参比OD 值-样品OD 值）/50%参比OD 值

二、MDA 含量的测定

方法1()：

MDA 含量测定采用硫代巴比妥酸法［21］，MDA 可与硫代巴比妥酸( TBA) 形成红棕色的三甲川( trimethine) 。取适量藻细胞粗酶液，加入含0． 5%硫代巴比妥酸的20%的三氯乙酸溶液，混合物于100 ℃水浴加热30 min，迅速冷却，4 000 r /min 离心10 min，分别在532 nm 和600 nm波长下测定上清液的吸光度。MDA 含量以μmol /细胞数

式中: ε 为吸光系数［L/( mmol·cm) ］，ε = 155; V1表示反应体系总量( mL) ; V2表示藻液总量( mL) ; S 表示粗酶提取液总量( mL) ; A 表示测定时所用提取液的量( mL) ; Nt表示t 时刻单胞藻数度( cells /mL) 。

方法2：

三、蛋白含量测定

方法1

试剂：（1）标准蛋白质溶液，用 g—球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。（2）考马斯亮兰G—250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。

2. 器材：

（1）可见光分光光度计 （2）旋涡混合器 （3）试管16支

（三）操作方法

1. 标准方法

（1）取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰G—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。

（2）加完试剂2~5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlG—250试剂。

注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。

（3）用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。

0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50。

2. 微量法

当样品中蛋白质浓度较稀时（10－100mg/ml）,可将取样量（包括补加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白对照则分别为0.5ml或1.0ml H2O, 考马斯亮蓝G－250试剂仍加5.0ml, 同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.29。

四、叶绿素a

方法1()：参照王学奎的方法［18］，取经过三氯生暴露处理0、24、48、72、96 h

后藻液，3500 × g 离心分离藻体细胞，加入5 mL 体积分数为95% 的乙醇，振荡摇匀，于黑暗处4℃ 下提取24 h。将提取液以7 000 r·min-1离心，取上清液，1cm 光径比色皿，以体积分数为95%乙醇为空白，分别在470、663 和645 nm 波长下测定吸光值，根据公式叶绿素a = 13． 95A663 －6． 88A645计算叶绿素a［18］。

1、SOD：单位○1：U/cell

单位○2：U/mg protein

POD、CAT酶活性的测定

粗酶液制备同SOD。

1、过氧化物酶（POD）活性测定（愈创木酚法）

（1）试剂配制：

0.2mol/L缓冲液(pH6.0)：分别取A母液(Na2HPO4 ) 123ml和B母液(NaH2PO4 )

877ml混匀即为1000ml PBS(0.2M，pH6.0)；

（2）反应混合液配制（以60个样为准）：

取200ml PBS(0.2M，pH6.0)，加入0.076ml液体（原液）愈创木酚（2-甲氧基酚）加热搅拌溶解，冷却后加入0.112ml 30％的H2O2，混匀后保存于冰箱中备用。

（3）样品测定：

取3ml反应液并加入30μl酶液，以PBS为对照调零，而后测定OD470值（测定40秒）。（边加样边测定，测定前等待5秒，动作要快，如果慢的话，要保证每个样品从加好样到开始记时的时间相差不大）每30S读数一次。

（4）酶活性计算：以每min OD值变化（升高）0.01为1个酶活性单位（u）。

POD=（ΔA470×Vt）/（W×Vs×0.01×t） (u/g min)

ΔA470：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml，(1.6ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml，30ul）。

2、（CAT）活性测定

（1）试剂配制：

0.15mol/L缓冲液（pH7.0）：取A母液(Na2HPO4) 457.5 ml 和B母液(NaH2PO4) 292.5 ml混合后用蒸馏水定容至1000ml。

（2）反应液配制：取200ml PBS（0.15M，pH7.0），加入0.3092ml 30%的H2O2（原液）摇匀即可。

（3）样品测定：取3ml反应液加入0.1ml（可视情况调整）酶液，以PBS为对照调零，测定OD240（紫外）（测定40s）。

（4）酶活性计算：以每min OD值减少0.01为1个酶活性单位（u）。

CAT=/（W×Vs×0.01×t） (u/g min)

ΔA240：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml， 1.6ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml, 0.1ml）。

此类方法，许多实验书上都有，药典上也有。

Puget, K. and A. M. Michelson (1974). "Iron containing superoxide dismutases from luminous

bacteria." Biochimie 56(9): 1255-1267.

李义刚, 刘滨扬, 彭颖, 廖伟,