酶活力测定方法

酶活力的测定

实验26 过氧化氢酶活力的测定（必修）

[目的与原理]

掌握过氧化氢酶活力的测定原理和比色测定方法，并用此方法测定水产动物血清中过氧化氢酶的活力。

血清中的过氧化氢酶（CAT）分解H2O2的反应，可通过加入钼酸铵而迅速中止，剩余的H2O2与钼酸铵产生一种淡黄色的络合物，在405nm处测定其生成量，即可计算出CAT的活力，CAT活力单位定义为：每1分钟分解1μmol的过氧化氢即为1个酶活力单位（U）。 [试剂与器材] 试剂：

1、磷酸盐缓冲液（67mmol / l，pH=7.4）：取Na2HP04 7.60g，KH2P041.82g，溶于1L蒸馏水中，调pH至7.4。

2、基质液（65μmol/ l, H2O2）：取30% H2O2 3.69 ml加pH7.4磷酸盐缓冲液至500ml。 3、钼酸铵：称取［(NH4)6Mo7O24］20.2g溶于500ml蒸馏水中。 器材：

721分光光度计 , 0.5cm比色杯，恒温水箱（37℃±0.5℃），试管 16mm×100mm，移液管，吸耳球，可调微量进样器。 [实验步骤]

1、样品测定：基质液置于37℃水浴 5 min，然后按下列步骤操作 试剂 基质液 钼酸铵 缓冲液 血清

对照管 1.0ml 1.0ml ― 0.2ml

标准管 1.0ml 1.0ml 0.2ml ―

测定管 1.0ml ― ― 0.2ml

37℃水浴准确温育60s后，立即加入钼酸铵1.0ml摇匀，10min后于405nm以蒸馏水调零比色。记录各管吸光度值（A）

2、计算：

过氧化氢酶活力(U/ L)= [(A对－A测)/ A标] ×（65×1×1000/0.2 ×1000）

= [(A对－A测)/ A标]×325

生化实验报告 1 山东大学实验报告 2011年4月20日 姓名 张行润 系年级 2009级生科4班 学号 200900140177 同组者 于潜 科目 生物化学实验 题目纤维素酶活力测定—3,5-二硝基水杨酸法 仪器编号 105 一、 实验目的 1、 学会并掌握用3、5—二硝基水杨酸法测定酶活力方法 2、 巩固使用分光光度计 二、 实验原理 纤维素酶是一种多组分酶，包括C1酶、CX酶和β-葡萄糖苷酶三种主要组分。其中C1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素，CX酶的作用是将无定形纤维素继续水解成纤维寡糖，β-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在550nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。 酶活力（enzyme activity）也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适。 本实验中酶活力定义：1mg酶每分钟水解生成1微克葡萄糖的量定义为一个活力单位。由此定义我们可以计算本实验中的纤维素酶活力。 三、 实验器材 （1）722型分光光度计 （2）恒温水浴 （3）沸水浴锅 （4）电炉子 （5）剪刀 （6）分析天平 （7）试管架 （8）胶头滴管 （9）具塞比色管（25mL×10） （10）移液管 （2mL；5mL） （11）烧杯 （500mL×3） （12）洗耳球 四、 实验材料 （1） 纤维素酶：0.05g酶溶解定容至50ml，取1ml再定容至100ml待测（用PH4.5乙酸-乙酸钠缓冲液配制）； （2） 3、5—二硝基水杨酸显色液； （3） 0．5%羧甲基纤维素钠水溶液（CMC）：用0.1mol/LPH4.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液配置； （4） 标准葡萄糖溶液（1mg/mL）； （5） 蒸馏水。 五、 实验操作 1. 空白管的测定： 生化实验报告 2 1毫升酶液,沸水浴5分钟，冷却加3毫升0.5%CMC； 2. 样品管测定： 取三支比色管，分别加入0.5%CMC 3毫升，酶液1毫升,混匀后与空白管一起于50℃水浴锅中水浴30分钟,取出,立即于沸水浴中煮沸10分钟使酶失活,冷却加入3毫升显色液，再沸水浴10分钟，冷却后加蒸馏水定容至25毫升，混匀，与标准曲线同时于550nm处测OD值。 3. 标准曲线绘制： 取6只25ml比色管，分别吸取0，0.2、0.4、0.6 、0.8、1.0mL的葡萄糖于,6支试管中,均用蒸馏水稀释至1mL,加3.5-二硝基水杨酸显色剂3mL,在沸水浴中煮沸显色10分钟,冷却,定容至25ml。在550nm处比色测其OD值。以光密度为纵坐标，以葡萄糖微克数为横坐标，绘出标准曲线。 4. 计算酶活力： 在上述条件下，每分钟催化纤维素水解生成１微克葡萄糖的酶量定为一个活力单位。 N ×OD值对应的葡萄糖量 纤维素酶活力单位＝——————————— `30×1 N---酶液的稀释倍数 30――糖化所用时间 １――反应酶液毫升数 六、 注意事项 1. 实验中由于比色管中溶液量过多，若用旋窝搅拌器混匀，可能使溶液溅出，可使用保鲜膜，将其覆盖在比色管口，上下摇动比色管，进行混匀； 2. 分光光度计使用前应进行预热30min，使其发光稳定，且在无样品放置时，应使试样室盖打开，此时光门自动关闭，以保护光电管； 3. 使用比色管时要将其擦拭干净，应用吸水纸吸去比色管表面溶液，用擦镜纸擦拭，以避免对比色管光滑一面造成磨损。且测量时，不可以其磨砂面正对光源； 4. 在标准曲线制作时，应从低浓度到高浓度以此测量，因为低浓度的残留液对高浓度待测液的测定不会有太大影响，所以可不用润洗比色管，但若有高浓度到低浓测定，则需要对比色管进行润洗，以消除误差，因为高浓度残留液会对低浓度的溶液浓度造成很大影响。 七、 实验结果 (一) 实验数据统计 表一 标准曲线的测定 管号 0 1 2 3 4 5 葡萄糖/mL 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水/mL 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 显色液/mL 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 沸水浴中煮沸显色10min,冷却,加蒸馏水定容至25mL A(550nm) 0.000 0.105 0.224 0.345 0.462 0.583 生化实验报告 3 样品的测定 编号 空白 样品一 样品二 样品三 酶液/mL 1(失活) 1 1 1 CMC/mL 3 3 3 3 50℃恒温30min 显色液/mL 3 3 3 3 沸水浴中煮沸显色10min,冷却,加蒸馏水至25mL A(550nm) 0.000 0．429 0.433 0.428 (二) 图表分析

淀粉酶活力的测定方法

淀粉酶是一类能够催化淀粉水解的酶，在生物体内和工业生产中都具有重要的作用。准确测定淀粉酶的活力对于研究酶的性质、生物体的代谢过程以及相关工业应用都具有重要意义。下面将介绍几种常见的淀粉酶活力测定方法。

一、碘淀粉比色法

碘淀粉比色法是一种较为经典且常用的测定方法。其原理是淀粉经淀粉酶水解后，剩余的淀粉与碘液反应生成蓝色复合物，颜色的深浅与剩余淀粉的量成正比。通过比色法测定反应后溶液的吸光度，即可计算出淀粉酶的活力。

具体操作步骤如下：

首先，准备一系列含有不同浓度淀粉溶液的试管，并向其中加入适量的淀粉酶溶液，在一定的温度和 pH 条件下反应一段时间。然后，迅速向各试管中加入碘液，使反应终止。最后，使用分光光度计在特定波长下测定各试管溶液的吸光度。

根据事先绘制的标准曲线，将吸光度值转换为剩余淀粉的浓度，从而计算出淀粉酶水解淀粉的量，进而得出淀粉酶的活力。

这种方法的优点是操作相对简单、成本较低，但缺点是灵敏度相对较低，对于低活力的淀粉酶测定可能不够准确。 二、DNS 法（3,5-二硝基水杨酸法）

DNS 法是另一种常用的测定淀粉酶活力的方法。其原理是淀粉在淀粉酶的作用下水解为还原糖，还原糖能与 3,5-二硝基水杨酸在碱性条件下共热，被还原成棕红色的氨基化合物。在一定范围内，还原糖的生成量与淀粉酶的活力成正比，通过比色测定棕红色物质的吸光度，即可计算出淀粉酶的活力。

操作过程如下：

将淀粉溶液与淀粉酶溶液在适宜条件下反应一定时间后，取出适量反应液，加入 DNS 试剂，在沸水浴中加热一段时间，使反应充分进行。冷却后，使用分光光度计测定溶液在特定波长下的吸光度。

与碘淀粉比色法相比，DNS 法的灵敏度较高，能够更准确地测定低活力的淀粉酶，但操作过程相对复杂一些。

三、斐林试剂法

斐林试剂法也是基于淀粉水解产生还原糖的原理。斐林试剂由硫酸铜和酒石酸钾钠的氢氧化钠溶液组成，还原糖能将斐林试剂中的二价铜离子还原为一价铜离子，生成砖红色的氧化亚铜沉淀。通过测定生成的氧化亚铜沉淀的量或反应液中剩余的二价铜离子的量，来计算淀粉酶的活力。

1 前言

草菇是一种著名的食用菌，营养丰富，味鲜美，深受人们的喜爱。草菇子实体含有人体必需的8种氨基酸，占其他氨基酸总量得38.2%，还含有14种维生素[1]，不愧为一种比较理想的天然保健食品。草菇喜高温高湿，生长速度快，生长周期短，一糙只需25天左右，在广西每年4月至9月均可以种植，是一种很有发展前途的食用菌，生产和市场前景广阔。

栽培草菇的生物学效率比较低（鲜菇与栽培料的比值），用稻草栽培草菇 的生物学效率大都在10—15%左右。过去研究认为草菇主要利用纤维素、淀粉，不大利用半纤维素以及木质素。因为草菇的半纤维素酶活性低，又缺乏降解木质素的酶类，但是农作物秸杆中一般含有半纤维素15—30%，木质素占10—30%。为此，本试验用透明圈法、氧化圈法观测V展1、V展2、V展3、V6、V广、V11六个菌株所产的胞外酶利用分解半纤维素，木质素的能力，看是否能够从其中初步筛选出利用半纤维素、木质素较强的菌株来。探讨更合理地配制栽培料的途径对提高草菇的生物转化率有重要意义。

2 实验原理

半纤维素是由五个碳原子为主的木糖聚合的高分子化合物，经木聚糖酶降解利用之后，基质生成透明圈[2]。木质素是以苯环为基本结构的复杂大分子 的有机化合物，含碳60—66%，在多酚氧化酶、过氧化酶降解后，能与愈创木酚进行反应生成棕红色或棕褐色轮环[3]。亮兰试剂与蛋白质结合兰青色、在与过氧化酶作用则呈黄色透明圈[4]。通过相应的平板基质培养，草菇菌丝分泌的酶类降解利用后，形成的透明圈迟早、直径大小、色泽深度等初步判断是否存在半纤维素酶和木质素酶降解酶类及其活性。

3 材料与方法

3.1 材料

3.1.1 菌株

V9购至广西大学微生物研究所，V广、V11购至广西农业科学院生物技术研究所，V展1、V展2、V展3采至广西现代农业展示中心经组织培养所得。

3.1.2 试剂

可溶性淀粉、亮兰溶液自配、半纤维素自已提制、愈创木酚为国产分析纯、木聚糖为进口。