酶活性的测定方法

广东饲料第１５卷第５期２００６年ｌ０月　

植酸砖活性测定方法　

谭宝玲，陈丽，冯建文　

（广东温氏食品集团有限公司，云浮５２７４３９）　

［中图分类号】Ｓ９６５．１　［文献标识码】Ｃ　［文章编号】ｌ００５—８６１３（２００６）０５一（）０４３—０２　

【摘要】饲用植酸酶酶活性的定量分析至今没有普遍公认　的检测方法．本测定方法是在ＢＡＳＦ公司１９９１提出的植酸　酶活性的测定方法的基础上进行研究改进，建立了更适合　于普通实验室条件下植酸酶产品酶活性的测定：本方法采　用绝对法，取二次曲线方程计算，其线性相关性（Ｒ２）匀能够　达到Ｏ　９９９～１，同一样品同一时间平行测定实验结果相对误　差均＜２％．同一样品不同时间　１定结果相对标准偏差　

（ＲＳＤ％）＜１０％（ｎ＝３）　［关键词】植酸酶　测定方法　植酸酶是催化植酸水解成为肌醇与磷酸的一　

类酶的总称，商品植酸酶已在饲料巾应用。植酸酶　

产品的质量鉴定和饲料中植酸酶的添加量是饲料　

生产厂家和质量检测机构都要面临的工作。商品植　

酸酶质量及在饲料中的添加量的定量分析至今没　

有世界公认的测定方法，被广泛认可和使用较多的　

方法是Ｇｉｓｔｂｒｏｃａｄｅｓ和ＢＡＳＦ公司１９９１年提出的　

植酸酶活性的测定方法，但此方法在操作上仍存在　

不简便，方法稳定性不够，测定结果误差相对较大　

等缺点。经笔者研究摸索，对ＢＡＳＦ公司的植酸酶　

活性测定方法进行改进，建立了经济、简便、快速、　

准确度较高、更适合普通实验室的植酸酶产品酶活　

性测定方法　

１酶活定义　

在３７．０℃、ｐＨ５．５０条件下．每分钟从０．Ｏ０５ｍｏｌ／Ｌ　

的植酸钠溶液中释放出１Ｉｘｍｏｌ的无机磷所需要的　

酶量，即为１个酶活单位，以ＰＦＵ／ｇ表示。　

２植酸酶样品　

本方法采用的植酸酶样品为本公司购进的罗　

氏公司乐多仙植酸酶产品和星湖科技公司星湖酶　

产品，标示量均为≥５　Ｏ００ＰｒＵ／ｇ。　

３仪器设备　

３．１分析天平（精确至０．Ｏ００１ｇ）　

吸光度计算公式测酶活性

引言。

酶是生物体内一类特殊的蛋白质，能够催化生物体内的化学反应。酶活性的测定对于研究生物体内的代谢过程、生物学功能以及药物研发具有重要意义。目前，常用的酶活性测定方法之一就是利用吸光度计算公式来测定酶活性。本文将介绍吸光度计算公式测酶活性的原理、步骤以及应用。

一、 吸光度计算公式测酶活性的原理。

吸光度法是一种常用的酶活性测定方法，其原理是通过测定反应体系中某一特定底物或产物的吸光度变化来间接测定酶的活性。当底物被酶催化反应后，产生的产物或中间体会引起溶液吸光度的变化，利用吸光度计测定这种变化，就可以计算出酶的活性。

二、 吸光度计算公式测酶活性的步骤。

1. 实验准备。

首先需要准备好实验所需的试剂和仪器设备，包括酶样品、底物、缓冲液、吸光度计等。同时，需要根据实验要求制定好实验方案，包括反应条件、测定时间等。

2. 反应体系的建立。

将酶样品、底物和缓冲液按照实验方案的要求加入反应管中，建立好反应体系。在建立反应体系的过程中，需要注意控制好反应的温度、pH值等条件，以确保实验的准确性和可重复性。

3. 吸光度测定。 将建立好的反应体系放入吸光度计中，根据实验方案的要求，在特定波长下测定反应体系的吸光度变化。通常情况下，会选择底物或产物在特定波长下的吸光度来进行测定。

4. 数据处理和计算。

根据吸光度测定的数据，可以利用吸光度计算公式来计算出酶的活性。吸光度计算公式通常是根据反应体系中产生的产物或中间体的吸光度变化与其浓度之间的关系来建立的，通过测定反应体系的吸光度变化，就可以计算出酶的活性。

三、 吸光度计算公式测酶活性的应用。

吸光度计算公式测酶活性是一种简单、快速、准确的酶活性测定方法，因此在生物学研究、生物医药和生物工程等领域得到了广泛的应用。例如，在药物研发中，可以利用吸光度计算公式测定酶的活性来评价药物对酶的抑制作用；在生物工程领域，可以利用吸光度计算公式测定酶的活性来优化发酵工艺和酶的生产过程。

实验九 酸性磷酸（酯）酶活性测定

1．目的要求

掌握酸性磷酸（酯）酶活性测定的原理和方法。

2．方法原理

酸性磷酸（酯）酶是一种存在于生物体内水解有机磷酸酯键的酶。以对硝基酚磷酸钠作为底物，在酸性磷酸酯酶的作用下，在碱性条件下水解生成黄色的对硝基酚，可用分光光度计进行比色测定。它们在各类种子中普遍存在，且含量较多，在萌发前期，随着种子的萌发进程活性增加，通常酸性磷酸酶活性与种子活力呈正比。

3．主要实验仪器及材料

干种子或吸胀种子、电子天平、分光光度计、恒温水浴箱、带塞刻度试管、小烧杯、研钵、塑料管、剪刀。

4．掌握要点

掌握常用的测定酸性磷酸（酯）酶活性的方法——对硝基酚磷酸钠法。

5．实验内容

（1）酶液提取。称取1g样品，用5mL研磨缓冲液在研钵中冰浴研磨成浆，再用5mL研磨缓冲液冲洗，转移至离心管中，在20000rpm下离心10min。吸出上清液，即为酶粗提液。可放在冰箱中储存备用。

（2）活力测定。取酶液0.1—1mL（视酶含量多少而定），加水至1mL，然后加入缓冲液1mL和对硝基酚磷酸钠溶液0.1mL。空白对照用1mL研磨缓冲液代替酶制剂。充分混匀后，放在30℃恒温箱中保温10min，时而摇动。10min后，加入1m0.5mol/LNaOH溶液，充分混合，终止反应，并使对硝基酚呈黄色。在400nm波长下测吸光度A。

（3）计算酶活性，以每毫克种子每分钟水解底物的nmol数表示。

酶活性nmol/min.mg=）（）（试样的gWVVAmin1011.3019.0

式中0.019为pH=14时，对硝基酚的µmol吸光系数，即对硝基酚的浓度为1mol/L时，其A=0.019；

3.1为0.0031×1000，反应混合液的体积为3.1，将µmol化为nmol乘上1000；

V为酶制剂总体积；

V1为每次用酶体积。 在实验中要保持酶制剂处于低温下以免酶活性下降，可在冰箱中提取和保存。

酶活测定方法

羧甲基纤维素酶(CMC酶)活力测定

取.05%CMCNa溶液lml,加入PH4.8,0.1M乙酸缓冲溶液4mL,蒸馏水lml,酶液1mL,于50℃水浴中糖化30min,取出,立即于沸水中煮沸15 min使酶失活,得糖化液,取糖化液lml,加3,5-DNS显色剂2mL,在沸水中显色15min,冷却后加蒸馏水22ml,摇匀,在550nm处比色。

以每分钟催化CMC水解生成1微克葡萄糖的酶量为一个酶活力单位。

淀粉酶活力测定

在试管中加入1%可溶性淀粉溶液(用pH4.8,0.1M乙酸盐缓冲溶液配制)1mL,

加入pH4.8,0.1M乙酸缓冲溶液4mL,蒸馏水1mL,酶液lmL,40℃水浴中保温30min,以后操作与羧甲基纤维素酶(CMC酶)活力测定相同。

定义以每小时酶促生成lmg葡萄糖的酶量定为一个酶活力单位。

漆酶活力测定

O.1MpH4.5的乙酸缓冲液3.4ml,加入3.36mM的邻联甲苯胺1mL,再加入适当稀释的粗酶液0.5mL,25℃保温30min,756MC紫外可见分光光度计测600nm处的OD值。定义每分钟引起0.01个吸光度的增加所需的酶液量为一个酶活力单位。

超氧物歧化(SOD)酶活性的测定

1.将反应介质与核黄素按39:1比例混合。

2.在同样的六支试管,各加入反应介质与核黄素混合液4ml,再在测试管中加入酶液50ml,两支对照管中不加入酶液,可用50mL提取介质代替酶液。

3.照光1小时后测定样品在560nm处吸光度。

4.定义将硝基四哇蓝的还原抑制到对照一半(50%)时所需的酶量为一个酶活力单位。

过氧化物酶(POD)活性测定

取光径1cm比色杯两只,在一只中加入反应混合液3 mL,以KH2PO41 mL作为校零对照,另一只比色杯中加入反应混合液3 mL。酶液l mL(如酶活性过高可稀释之),立即开启秒表记录时间,反应20分钟后,于分光光度计上测量吸光度值,读数于波长47Omn下进行。