酒精中毒研究方法进展

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酒精中毒研究方法进展

胡力文;严纯;许欣

【摘 要】Alcoholism is a serious global public health problem that has

received widespread attention from society.Due to ethical

issues,alcoholism researches mainly adopt the rodent models.The

alcoholism research direction is approximately divided into three

categories :ethology, pathology and genetics ,involving kinds of

methods.Meanwhile, with the progress of science and technology ,high-throughput and automated methods have been widely used in the study

of alcoholism , such as gene expression profile analysis and flow

cytometry.At present,with the deepening of the research on

alcoholism ,the tradi-tional behavioral epigenetic method cannot fully

meet the needs of the scientific research ,acute and chronic alcohol intake

research is gradually focusing on the mRNA and protein expression

level ,so genomics methods, suitable for complex disease traits, are

receiving increasing attention.%酒精中毒是严重的全球公共卫生问题,受到社会各界的广泛关注.由于伦理问题,酒精中毒研究主要采用啮齿动物模型.酒精中毒机制复杂,主要研究方向包括行为学、病理学和基因学三类,因此涉及的研究方法众多,而且科技的不断进步使基因表达谱分析、流式细胞术等高通量、自动化的方法逐渐广泛应用于酒精中毒研究.目前,随着对酒精中毒研究的深入,传统的行为表观学等方法已不能完全满足科研需求,急性到慢性酒精摄入的研究重心也逐渐聚焦到mRNA及蛋白表达水平,因此适用于复杂疾病性状研究的基因学方法愈发受到关注. 【期刊名称】《医学综述》

【年(卷),期】2018(024)011

【总页数】6页(P2181-2186)

【关键词】酒精中毒;动物模型;行为学实验;病理损伤;基因表达

【作 者】胡力文;严纯;许欣

【作者单位】四川大学华西公共卫生学院,成都610041;四川大学华西公共卫生学院,成都610041;四川大学华西公共卫生学院,成都610041

【正文语种】中 文

【中图分类】R115

酒精中毒是指乙醇饮用过量而导致的机体损伤,尤其是神经系统和肝脏。按照暴露方式不同可分为急性酒精中毒(醉酒)和慢性酒精中毒(酒精依赖症)。随着人们生活水平的提高,酒精消费呈上涨趋势,酒精中毒患者比例增大,已引起社会的广泛关注。考虑到伦理要求,酒精中毒等相关研究多以动物模型为基础。人类与啮齿动物同源,基因相似度高(与小鼠可达80%)[1],且经济实用,故酒精中毒动物模型常采用啮齿动物,如C57BL/6J小鼠、BALB/c小鼠、昆明小鼠、SD大鼠等。

酒精中毒的研究方向大致可分为三类:①行为学研究,如共济失调现象等;②病理学研究,如乙醇代谢酶(乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶等)、神经递质(多巴胺、阿片肽等)等变化与机体损伤;③基因学研究,如肝、脑基因表达改变等。酒精中毒机制复杂,涉及的研究方法繁多,如数据自动采集分析仪、流式细胞术(flow

cytometry,FCM)、宏基因组等。目前国内外关于酒精中毒研究方法的总结少见报道,现结合国内外文献以及自身研究方向对酒精中毒的研究方法进展进行综述,为相关领域学者提供参考。

1 行为学研究

行为学研究通过不同的行为学方法量化酒精中毒动物模型的行为表现,能更加直观地比较分析动物个体或社群间的差异。急性酒精中毒动物模型的研究常采用此类方法。根据急性酒精中毒过程常分为3个阶段:①兴奋期,表现为欣快、兴奋等;②共济失调期,表现为步履不稳、肢体摇晃、言语含糊等;③昏睡期,表现为昏睡不醒等,故每个阶段采用的研究方法有所不同,见表1。

表1 酒精中毒行为学研究方法阶段实验方法应用兴奋期旷场实验探究药物(包括乙醇)镇静、毒性或兴奋性作用的机制共济 失调期平衡木实验、后肢滑落实验、转棒实验、网屏实验、共济失调量表等评估小鼠或大鼠肢体平衡以及肌肉运动协调能力昏睡期翻正反射实验观察判断药物(包括乙醇)的麻醉程度

1.1 旷场实验(open-field test,OFT) OFT是研究啮齿动物自主活动及探索行为的常用行为学方法。传统的OFT通常采用木板或聚氯乙烯塑料板自制旷场(空间为25~250 cm3),观察与记录一定时间内(一般为2~10 min)实验动物的活动情况,包括活动时间、静止时间、垂直站立、理毛行为、排便排尿等行为学参数,方法简单直观,经济适用[2],如张凤杰等[3]通过记录自制旷场中小鼠的站立次数发现了酒中生物胺的致兴奋作用。但由于是人工采集数据,故误差较大,可重复性低。目前,随着技术的进步,高通量的自动数据采集仪器及分析系统逐渐应用于OFT,如OFT视频分析系统、OFT-100大小鼠开场活动实验系统等,采用的视频摄像跟踪技术可对动物进行长时间的观察,避免人工计数引入的主观误差以及对实验动物造成的干扰,增加实验结果的可靠性。刘建兴等[4]采用自主活动仪记录小鼠酒后不同时间段的活动次数,发现葛根总黄酮能降低醉酒后小鼠的兴奋性。不仅如此,此类系统操作简单,且自动化采集的数据指标,如总路程、平均速度、路程轨迹、不同区域活动时间等也更加客观灵敏,买文丽等[5]也通过实验证实上述指标能有效反映小鼠的自主活动改变。

除此之外,关于OFT测定时间长短选择的研究显示,短时间测量更强调动物的探索活动及应激反应[6],而长时间测量(≥24 h)则更适用于基线活动水平的探索[7]。

1.2 转棒实验 转棒实验是研究评估大小鼠肢体平衡以及肌肉运动协调能力的方法,常用于评价酒精性共济失调。包勒朝鲁等[8]通过转棒实验发现蒙药抗急性酒精中毒运动失调的作用;宋莎莎等[9]也利用转棒实验探究了中药复方制剂能否改善乙醇诱导的共济失调现象。早期由于技术条件限制,研究者多采用由马达控制速度的木质转棒进行实验,可测量停留时间、掉落次数等指标[10],但是通量小,即一次实验能测评动物数量太少,故相对耗时费力。近年来,自动化的大小鼠转棒仪逐渐广泛应用于共济失调研究。由于此装置是通过微处理器控制,所以不仅具有能精确计时和控制转棒速度的优点,而且能同时测定4~5只实验动物,实验效率较高。王玲等[11]利用大小鼠转棒仪检测了50只小鼠在5个时点的平衡失调情况。

1.3 共济失调量表 酒精中毒诱导的共济失调现象复杂,常用的测定方法,如平衡木实验、转棒实验等均是通过观察记录动物肢体滑落实验装置(如转棒仪、平衡木)的次数、时间等参数进行共济失调的评估。由于实验数据对于共济失调现象的反映过于局限,因此有学者采用临床上经常使用的量表法进行酒精中毒研究。量表法可通过对实验动物的不同行为表现进行评分,由于将行为细致划分,能更全面地反映复杂的共济失调现象。Metten等[12]将酒精中毒小鼠的行为表现分为后腿张开、步态晃动、鼻子拖地、腹部负重4个方面进行评分。

1.4 翻正反射消失实验(loss of righting reflex test,LORRT) LORRT是通过观察处于异常体位的动物是否能恢复正常体位来确定动物的反射状况,可用于检查麻醉程度,也是判断动物是否醉酒的经典方法[1]。乙醇暴露后,将实验动物背部朝下呈仰位姿势,若30 s内未能翻转身体,则判断为翻正反射消失和醉酒,国内外学者均常使用此法进行酒精中毒研究,但区别在于实验装置的使用。国外文献报道中LORRT是需要将实验动物背部放置于V形槽中进行观察[13-15],而国内相关研究则是采用平板装置进行实验[16-17]。根据实际情况来看,相较于置于平面上动物躯体由于惯性出现向一侧倾倒的现象,将动物背部置于V形槽上观察其翻正反射消失更为准确。

通过LORRT,研究者通常能获取醉酒时间(翻正反射消失时间)、醒酒时间(翻正反射恢复时间)及睡眠时间(翻正反射消失持续时间)三项指标,但不同测定指标的应用有所不同,前者适用于实验动物乙醇敏感性的评价[18];而醒酒时间和睡眠时间则更适用于动物乙醇耐受性的评估[19]。除此之外,关于翻正反射恢复的判断标准,Jury等[20]相关研究中认为实验动物在30 s内翻转身体2次可视为翻正反射恢复;而Carter等[21]则通过观察实验动物1 min内是否能翻转身体3次来进行判定。因此,为确保动物翻正反射恢复,可适当延长观察时间。

2 病理学研究

过量乙醇的暴露,不仅会导致机体功能紊乱,还会产生一系列损伤反应。目前酒精中毒相关病理学研究主要分为肝脏损伤和脑损伤两个方向,因研究侧重点不同,故检测指标与方法的选择不同,见表2。

表2 酒精中毒病理学研究方法部位及机制检测指标方法选择肝脏 氧化损伤超氧化物歧化酶、还原性谷胱甘肽、丙二醛等酶联免疫吸附法 组织、细胞损伤天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、细胞病变(如脂肪变性等)、细胞凋亡酶联免疫吸附法、苏木精-伊红染色法、免疫组织化学法、TUNEL法、胱天蛋白酶活性检测法、FCM等脑 氧化损伤乙醛、超氧化物歧化酶、还原性谷胱甘肽、丙二醛等高效液相色谱法(需衍生化)、酶联免疫吸附法 组织、细胞损伤细胞病变、细胞凋亡苏木精-伊红染色法、免疫组织化学法、TUNEL法胱天蛋白酶活性检测法、FCM等 神经损伤降钙素基因相关肽、内皮素、血栓素B2、β-内啡肽、谷氨酸、γ-氨基丁酸、神经肽Y等酶联免疫吸附法、放射免疫法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法

TUNEL:脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法

2.1 生物活性物质 酒精中毒会影响机体内生物分子的分泌与功能活性(如酶类、神经递质等),进而导致机体损伤。

2.1.1 放射免疫法 放射免疫法具有放射性核素的敏感性和抗原抗体反应的特异性,能精确测定生物体液中的各种微量免疫活性物质,而且需要的样本量少,已广泛应用于生物医学研究的各个领域。研究显示,酒精中毒诱导的脑损伤(中枢神经系统、头痛等)指标,如β-内啡肽、内皮素、降钙素基因相关肽、P物质等含量水平多在ng/L或pg/mg水平[22-24],因此为保证实验结果的准确性,研究者更倾向于采用精密度更高的放射免疫法进行测定。但是由于放射免疫法存在放射性核素的污染,成本较高,目前已有逐渐被其他免疫标记技术取代的趋势。