梗阻性黄疸患者血清对人肺微血管内皮细胞肌样分化的影响要点

㊃重症医学㊃梗阻性黄疸患者血清对人肺微血管内皮细胞肌样分化的影响陈啟炜㊀杨勇㊀陈兵㊀陈杨㊀李胜㊀王桂兰㊀吴玉龙㊀陈崇会㊀祖宝利㊀易斌鲁开智㊀廖林４０１４２０㊀重庆市綦江区人民医院麻醉科（陈啟炜㊁李胜㊁王桂兰㊁吴玉龙㊁陈崇会㊁廖林）；４０００３８㊀重庆市，第三军医大学附属西南医院麻醉科（杨勇㊁陈兵㊁陈杨㊁祖宝利㊁易斌㊁鲁开智）通信作者：廖林，Ｅｍａｉｌ：ｌｉａｏｌｉｎｍｚ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍＤＯＩ：１０．３７６０∕ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．０２５４⁃１４１６．２０１６．０９．０２７ʌ摘要ɔ㊀目的㊀评价梗阻性黄疸患者血清对人肺微血管内皮细胞（ＰＭＶＥＣｓ）肌样分化的影响㊂方法㊀分离人ＰＭＶＥＣｓ，并传代培养，将培养的人ＰＭＶＥＣｓ分别采用梗阻性黄疸患者血清和健康志愿者血清孵育，于孵育２４㊁４８和７２ｈ（Ｔ１ ３）时在倒置显微镜下观察原代ＰＭＶＥＣｓ形态，采用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测ＰＭＶＥＣｓ肌性蛋白（α⁃ＳＭＡ㊁ＳＭ⁃ＭＨＣ㊁ｃａｐｏｌｎｉｎ）的表达㊂结果㊀健康志愿者血清孵育ＰＭ⁃ＶＥＣｓｃａｌｐｏｎｉｎ㊁α⁃ＳＭＡ蛋白表达阴性，出现少量ＳＭ⁃ＭＨＣ表达，梗阻性黄疸患者血清孵育ＰＭＶＥＣｓｃａｌｐｏｎｉｎ㊁α⁃ＳＭＡ和ＳＭ⁃ＭＨＣ表达阳性㊂与健康志愿者血清比较，梗阻性患者黄疸血清孵育ＰＭＶＥＣｓＳＭ⁃ＭＨＣ表达上调（Ｐ＜０．０５）；与Ｔ１时比较，Ｔ２，３时梗阻性黄疸血清孵育ＰＭＶＥＣｓｃａｌｐｏｎｉｎ㊁α⁃ＳＭＡ和ＳＭ⁃ＭＨＣ表达上调（Ｐ＜０．０５）；与Ｔ２时比较，Ｔ３时梗阻性黄疸患者血清孵育ＰＭＶＥＣｓｃａｌｐｏｎｉｎ㊁α⁃ＳＭＡ和ＳＭ⁃ＭＨＣ表达上调（Ｐ＜０．０５）㊂结论㊀梗阻性黄疸患者血清促进ＰＭＶＥＣｓ肌样分化，可能是肺微血管扩张机制之一㊂ʌ关键词ɔ㊀黄疸，阻塞性；㊀血清；㊀肺；㊀内皮，血管；㊀细胞分化基金项目：国家自然科学基金（８１１７００５３，８１１７０４１４）Ｅｆｆｅｃｔｏｆｓｅｒｕｍｏｆｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅｊａｕｎｄｉｃｅｏｎｍｙｏｇｅｎｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｐｕｌｍｏｎａ⁃ｒｙｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ㊀ＣｈｅｎＱｉｗｅｉ，ＹａｎｇＹｏｎｇ，ＣｈｅｎＢｉｎｇ，ＣｈｅｎＹａｎｇ，ＬｉＳｈｅｎｇ，ＷａｎｇＧｕｉｌａｎ，ＷｕＹｕｌｏｎｇ，ＣｈｅｎＣｈｏｎｇｈｕｉ，ＺｕＢａｏｌｉ，ＹｉＢｉｎ，ＬｕＫａｉｚｈｉ，ＬｉａｏＬｉｎＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＡｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ，ＱｉｊｉａｎｇＤｉｓｔｒｉｃｔＰｅｏｐｌｅᶄｓＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ４０１４２０，Ｃｈｉｎａ（ＣｈｅｎＱＷ，ＬｉＳ，ＷａｎｇＧＬ，ＷｕＹＬ，ＣｈｅｎＣＨ，ＬｉａｏＬ）；ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＡｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ，ＳｏｕｔｈｗｅｓｔＨｏｓｐｉｔａｌ，ＴｈｉｒｄＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ４０００３８，Ｃｈｉｎａ（ＹａｎｇＹ，ＣｈｅｎＢ，ＣｈｅｎＹ，ＺｕＢＬ，ＹｉＢ，ＬｕＫＺ）Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＬｉａｏＬｉｎ，Ｅｍａｉｌ：ｌｉａｏｌｉｎｍｚ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍʌＡｂｓｔｒａｃｔɔ㊀Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ㊀Ｔｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｔｈｅｓｅｒｕｍｏｆｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅｊａｕｎｄｉｃｅｏｎｍｙｏｇｅｎｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｐｕｌｍｏｎａｒｙｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ（ＰＭＶＥＣｓ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ㊀Ｈｕ⁃ｍａｎＰＭＶＥＣｓｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｔｈｅｎｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅｄ．ＴｈｅｃｕｌｔｕｒｅｄＰＭＶＥＣｓｗｅｒｅｉｎｃｕｂａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｓｅｒｕｍｏｆｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅｊａｕｎｄｉｃｅｏｒｗｉｔｈｔｈｅｓｅｒｕｍｏｆｈｅａｌｔｈｙｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ．Ａｔ２４，４８ａｎｄ７２ｈｏｆｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ（Ｔ１⁃３），ｔｈｅｉｎｖｅｒｔｅｄｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｗａｓｕｓｅｄｔｏｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆｐｒｉｍａｒｙＰＭＶＥＣｓ．Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｕｓｃｕｌａｒｐｒｏｔｅｉｎｓ（ａｌｐｈａ⁃ｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅａｃｔｉｎ［α⁃ＳＭＡ］，ｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅ⁃ｍｙｓｉｏｎｈｅａｖｙｃｈａｉｎ［ＳＭ⁃ＭＨＣ］，ｃａｐｏｌｎｉｎ）ｉｎＰＭＶＥＣｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｕｓｉｎｇＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ㊀Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃａｌ⁃ｐｏｎｉｎａｎｄα⁃ＳＭＡｗａｓｎｅｇａｔｉｖｅ，ａｎｄａｆｅｗＳＭ⁃ＭＨＣｐｒｏｔｅｉｎｓｗｅｒｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄｗｈｅｎＰＭＶＥＣｓｗｅｒｅｉｎｃｕｂａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｓｅｒｕｍｏｆｈｅａｌｔｈｙｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ；ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃａｌｐｏｎｉｎ，α⁃ＳＭＡａｎｄＳＭ⁃ＭＨＣｗａｓｐｏｓｉｔｉｖｅｗｈｅｎＰＭＶＥＣｓｗｅｒｅｉｎｃｕｂａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｓｅｒｕｍｏｆｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅｊａｕｎｄｉｃｅ．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｓｅｒｕｍｏｆ万方数据ｈｅａｌｔｈｙｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳＭ⁃ＭＨＣｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｕｐ⁃ｒｅｇｕｌａｔｅｄｗｈｅｎＰＭＶＥＣｓｗｅｒｅｉｎｃｕｂａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｓｅｒｕｍｏｆｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅｊａｕｎｄｉｃｅ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃａｌｐｏｎｉｎ，α⁃ＳＭＡａｎｄＳＭ⁃ＭＨＣｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｕｐ⁃ｒｅｇｕｌａｔｅｄａｔＴ２，３ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈａｔａｔＴ１，ａｎｄａｔＴ３ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈａｔａｔＴ２ｗｈｅｎＰＭＶＥＣｓｗｅｒｅｉｎｃｕｂａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｓｅｒｕｍｏｆｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅｊａｕｎｄｉｃｅ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ㊀ＴｈｅｓｅｒｕｍｏｆｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅｊａｕｎｄｉｃｅｐｒｏｍｏｔｅｓｍｙｏｇｅｎｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎＰＭＶＥＣｓ，ｗｈｉｃｈｉｓｐｒｏｂａｂｌｙｏｎｅｏｆｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇｉｎｔｒａｐｕｌｍｏｎａｒｙｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒｄｉｌａｔａｔｉｏｎ．ʌＫｅｙｗｏｒｄｓɔ㊀Ｊａｕｎｄｉｃｅ，ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ；㊀Ｓｅｒｕｍ；㊀Ｌｕｎｇ；㊀Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ，ｖａｓｃｕｌａｒ；㊀Ｃｅｌｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ⁃ｔｉｏｎＦｕｎｄｐｒｏｇｒａｍ：ＮａｔｉｏｎａｌＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎａ（８１１７００５３，８１１７０４１４）㊀㊀肝肺综合征是一种由严重肝病导致的肺血管疾病，主要表现为：肺内微血管扩张㊁气体交换障碍㊁动脉血氧和作用异常，在肝硬化患者中发病率高达３０％，也可导致围术期肝移植无功能和术后病死率的增加［１⁃３］㊂肺血管重塑可能是其主要发病机制之一［４⁃５］㊂肺微血管内皮细胞（ＰＭＶＥＣｓ）和肺动脉平滑肌细胞（ＰＡＳＭＣｓ）在肺血管重塑的形成过程中起到很重要的作用［６⁃７］㊂对肺血管重塑的病理生理及分子机制的研究主要为动物实验［８⁃９］㊂本研究拟评价梗阻性黄疸患者血清对人ＰＭＶＥＣｓ肌样分化的影响，对肺源性肺血管重塑的研究提供参考㊂材料与方法材料和主要试剂㊀优等胎牛血清（Ｇｉｂｃｏ公司，美国），青霉素⁃链霉素溶液和兔ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ⁃ＨＲＰ试剂盒（带ＤＡＢ试剂盒，碧云天生物技术研究所），０．０１ｍｏｌ∕ＬＰＢＳ（北京中杉金桥生物技术公司），低糖ＤＭＥＭ（Ｈｙｃｌｏｎｅ公司，美国），ＥＤＴＡ㊃２Ｎａ和胰蛋白酶（Ａｍｒｅｓｃｏ公司，美国），兔抗人Ⅷ因子相关抗原多克隆抗体和兔抗大鼠ＣＤ３４多克隆抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司，美国），ＦＩＴＣ标记植物凝集素ＢＳＩ（Ｓｉｇｍａ公司，美国），ＴｒｉｔｏｎＸ⁃１００（北京索莱宝科技有限公司），平滑肌⁃α⁃肌动蛋白（α⁃ＳＭＡ）和ｃａｌｐｏｎｉｎ单克隆抗体（Ａｂｃａｍ公司，英国），ＧＡＰＤＨ一抗（武汉博士德生物工程有限公司），ＨＲＰ二抗（武汉博士德生物工程有限公司），ＦＩＴＣ标记山羊抗兔ＩｇＧ和ＤＡ⁃ＰＩ㊁抗荧光淬灭封片液（上海碧云天生物技术公司），生物安全操作柜㊁ＣＯ２细胞培养箱㊁振荡器（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ公司，美国），低温离心机（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司，德国），电控恒温水浴箱（天津市泰斯特有限公司），ＢＸ５１荧光显微镜（Ｏｌｙｍｐｕｓ公司，日本）㊂人ＰＭＶＥＣｓ的分离与培养㊀人肺组织取自第三军医大学附属第一医院，在获得患者知情并同意的情况下取良性病变肺叶切除的患者，无内分泌㊁血液㊁生殖等疾病，无菌条件下取胸膜下肺组织，切成约１ｍｍˑ１ｍｍˑ１ｍｍ大小的组织碎片，采用无血清ＤＭＥＭ培养基洗涤，贴入预先用明胶包被的培养瓶中，加入配置好的ＤＭＥＭ培养液∕胎牛血清（４ʒ１）４ｍｌ，置于３７ħＣＯ２孵箱静置培养（动作轻柔以避免组织块漂浮）㊂于倒置显微镜下观察，见有细胞从组织块边缘游离后即可吸除组织块，一般在３ｄ后，继续培养，每３ｄ换液培养㊂细胞铺满至培养瓶８５％以上时，用ＥＤＴＡ和已配胰蛋白酶１ʒ１混合消化液进行消化，按１ʒ２比例进行传代㊂鉴定原代培养的人ＰＭＶＥＣｓ㊀形态学观察：倒置显微镜下观察细胞形态变化㊂其他实验：（１）植物凝集素ＢＳＩ结合实验：采用２代细胞进行实验，先将贴壁细胞制备成细胞悬液，接种，加入ＤＭＥＭ∕胎牛血清混合液培养（４ʒ１），待细胞贴壁生长后进行细胞鉴定，ＰＢＳ洗涤细胞爬片３次ˑ５ｍｉｎ；用０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ⁃１００覆盖细胞浸润１５ｍｉｎ；于细胞爬片上滴加内源性过氧化物酶封闭液，室温下孵育１０ｍｉｎ；湿盒内ＰＢＳ充分洗３次ˑ５ｍｉｎ；适量滴加封闭用正常羊血清工作液，孵育１０ｍｉｎ（室温），勿洗；ＦＩＴＣ⁃ＢＳＩ（２５μｇ∕ｍｌ）滴加细胞爬片；室温下避光孵育３０ｍｉｎ；ＰＢＳ漂洗３次ˑ３ｍｉｎ；用缓冲甘油（５０％）封片置荧光显微镜下观察ＦＩＴＣ⁃ＢＳＩ结合情况；（２）Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学染色，细胞爬片处理同上；滴加１００μｌ兔抗人Ⅷ因子相关抗原多克隆抗体（１ʒ５０），４ħ冰箱孵育过夜；ＰＢＳ平衡液洗涤３次，每次５ｍｉｎ；适量滴加生物素标记羊抗兔二抗工作液，孵育１０ｍｉｎ（室温），用ＰＢＳ平衡液洗涤细胞爬片３次，每次５ｍｉｎ；适量滴加ＨＲＰ标记的链霉亲和素，孵育１０ｍｉｎ（室温）后用ＰＢＳ充分冲洗；ＤＡＢ显色：根据需要，将试剂Ａ和试剂Ｂ以１ʒ１９的比例混匀后滴加在细胞爬片上，显色完全后用自来水冲洗终止；用苏木素进行复染４０ｓ，蒸馏水再次冲洗；室温下进行封片，观察并拍照㊂（３）ＣＤ３４免疫细胞化学染色（步骤同Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学染色）㊂血清的收集㊀选择梗阻性黄疸患者１０例和健康志愿者１０名，并获得其知情同意（伦理注册号：ＣｈｉＣＴＲ⁃ＯＣＨ⁃１２００２１２８）㊂梗阻性黄疸患者年龄万方数据１８ ６０岁，性别不限，结合胆红素１０２．６ ２５２．２μｍｏｌ∕Ｌ，总胆红素１７１ ３４２μｍｏｌ∕Ｌ，结合胆红素∕总胆红素比值５０％ ７０％，尿胆红素阳性，尿胆原阴性；谷丙转氨酶４０ ２００Ｕ∕Ｌ，谷草转氨酶４０ ２００Ｕ∕Ｌ，碱性磷酸酶２００ ８００Ｕ∕Ｌ，γ⁃谷氨酰转移酶１００ ８００，阻塞性脂蛋白Ｘ３００ ８００ｇ∕Ｌ，有梗阻近端胆管扩张的表现（Ｂ超㊁ＣＴ㊁ＭＲＩ或ＭＲＣＰ等影像学检查）㊂采血前禁食１２ｈ，避免剧烈运动，采血前４ｈ禁茶㊁咖啡和酒，于肘静脉处采血，收集静脉血样约５ｍｌ，置３７ħ保温１ｈ，然后于３０００转∕ｍｉｎ，４ħ离心１５ｍｉｎ（离心半径４ｃｍ），在无菌生物安全操作柜下，取上清，经无菌过滤器获取血清约２ｍｌ，置于－８０ħ冰箱保存待用㊂Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测人ＰＭＶＥＣｓ肌性蛋白（ｃａｌ⁃ｐｏｎｉｎ㊁α⁃ＳＭＡ和ＳＭ⁃ＭＨＣ）的表达㊀将消化后人ＰＭＶＥＣｓ等份接种于培养瓶内，待细胞长到培养瓶底部面积８０％作用，分别加入含１０％梗阻性黄疸患者血清或健康志愿者血清的ＤＭＥＭ培养基，孵育２４㊁４８和７２ｈ（Ｔ１ ３）后随机取不同时点２组细胞３瓶，弃掉上清，在冰上加入蛋白裂解液进行裂解，１２０００ˑｇ离心１０ｍｉｎ，取上清并用分光光度计定量㊂取３０μｇ蛋白进行电泳后开始转膜（恒压１２Ｖ，转膜６０ｍｉｎ），转好的ＰＶＤＦ膜浸入含５％脱脂奶粉的溶液封闭２ｈ，４ħ冰箱封闭过夜，分别加入兔抗大鼠α⁃ＳＭＡ一抗（１ʒ１０００）㊁兔抗大鼠ｃａｌｐｏｎｉｎ一抗（１ʒ２００００）孵育过夜，取出ＰＶＤＦ膜，用ＴＢＳＴ洗膜３次，将膜置于二氨基联苯胺显色液中显色，出现清洗条带时用清水终止反应，图像分析仪定量分析蛋白的表达水平㊂统计学处理㊀采用ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍ统计学软件进行分析，正态分布的计量资料以均数ʃ标准差（ｘʃｓ）表示，２种血清孵育后各指标的比较采用成组ｔ检验，不同时点各指标比较采用单因素方差分析，Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义㊂结㊀㊀果在倒置显微镜下观察原代培养的人ＰＭＶＥＣｓ，单层贴壁生长，状如短梭形或类圆形，大小均匀，胞浆丰富，胞核清晰，呈卵圆形㊂通过植物凝集素ＢＳＩ结合实验㊁Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学染色和ＣＤ３４免疫细胞化学染色鉴定为ＰＭＶＥＣｓ㊂健康志愿者血清刺激细胞在倒置显微镜下单层贴壁生长，状如梭形或三角形，呈鹅软石镶嵌状排列，胞核清晰，胞浆丰富，呈卵圆形；实验组培养细胞呈长梭状排列，核呈杆状或椭圆状㊂健康志愿者血清孵育ＰＭＶＥＣｓｃａｌｐｏｎｉｎ㊁α⁃ＳＭＡ蛋白表达阴性，出现少量ＳＭ⁃ＭＨＣ表达；梗阻性黄疸患者血清孵育ＰＭＶＥＣｓｃａｌｐｏｎｉｎ㊁α⁃ＳＭＡ和ＳＭ⁃ＭＨＣ表达阳性㊂与健康志愿者血清比较，梗阻性患者黄疸血清孵育ＰＭＶＥＣｓＳＭ⁃ＭＨＣ表达上调（Ｐ＜０．０５）；与Ｔ１时比较，Ｔ２，３时梗阻性黄疸血清孵育ＰＭ⁃ＶＥＣｓｃａｌｐｏｎｉｎ㊁α⁃ＳＭＡ和ＳＭ⁃ＭＨＣ表达上调（Ｐ＜０．０５）；与Ｔ２时比较，Ｔ３时梗阻性黄疸患者血清孵育ＰＭＶＥＣｓｃａｌｐｏｎｉｎ㊁α⁃ＳＭＡ和ＳＭ⁃ＭＨＣ表达上调（Ｐ＜０．０５）㊂见表１㊂表１㊀两组人ＰＭＶＥＣｓｃａｌｐｏｎｉｎ㊁α⁃ＳＭＡ和ＳＭ⁃ＭＨＣ表达的比较（ｎ＝３）血清种类指标Ｔ１Ｔ２Ｔ３健康志愿者血清ｃａｌｐｏｎｉｎ１２．１ʃ２．１１５．７ʃ３．４１３．１ʃ２．５梗阻性黄疸患者血清２６．５ʃ５．１ａ３５．７ʃ３．９ａｂ４６．１ʃ４．７ａｂｃ健康志愿者血清α⁃ＳＭＡ２２．１ʃ２．５１６．８ʃ１．９２５．４ʃ２．９梗阻性黄疸患者血清４３．２ʃ４．８ａ５４．４ʃ４．１ａｂ７６．４ʃ６．４ａｂｃ健康志愿者血清ＳＭ⁃ＭＨＣ７．２ʃ１．３９．８ʃ１．５１０．１ʃ１．６梗阻性黄疸患者血清７．６ʃ１．７１０．６ʃ１．５ａｂ１３．４ʃ１．７ａｂｃ㊀㊀注：与健康志愿者血清比较，ａＰ＜０．０５㊀与Ｔ１时比较，Ｐ＜０．０５㊀与Ｔ２时比较，Ｐ＜０．０５讨㊀㊀论肝肺综合征的主要病理改变是肺微血管的扩张，扩张血管导致血红蛋白的氧合困难，并进一步加重了低氧血症［１０］㊂梗阻性黄疸患者血清可增强人ＰＡＳＭＣｓ增殖和迁移能力，并促进其向合成表型的转换㊂微血管的重要构成细胞为肺微血管内皮细胞㊂肺微血管扩张主要是由ＰＭＶＥＣｓ异常增殖㊁肌样分化引起［１１］㊂在肝肺综合征的患者中，主要是由慢性肝病导致多种细胞因子（内毒素㊁内皮素⁃１㊁ＣＯ㊁ＮＯ和ＴＮＦ⁃α等）来通过血液循环作用于ＰＭ⁃ＶＥＣｓ，进而引起其发生异常增殖和肌样分化㊂临床中采集的梗阻性黄疸患者的血清可很好模拟肝肺综合征患者的内环境㊂本研究采用梗阻性黄疸患者血清刺激离体后培养的ＰＭＶＥＣｓ，并在倒置显微镜下观察细胞形态及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测ＰＭＶＥＣｓ肌样分化的情况㊂常用肌样分化的标志性蛋白ｃａｌｐｏｎｉｎ㊁α⁃ＳＭＡ和ＳＭ⁃ＭＨＣ，经常用于内皮细胞及成纤维细胞的肌样分化检测㊂本研究结果显示，与正常人血清比较，梗阻性黄疸血清孵育ＰＭＶＥＣｓ形态出现了变化，呈长梭状样排列，核呈杆状或椭圆状，而正常人血清孵育ＰＭＶＥＣｓ呈梭形或多角形，单层性贴壁生长，呈万方数据铺路石样 的排列，大小均匀，胞核清晰，呈卵圆形且胞浆丰富㊂Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果提示：健康志愿者血清孵育ＰＭＶＥＣｓｃａｌｐｏｎｉｎ㊁α⁃ＳＭＡ蛋白表达阴性，出现少量ＳＭ⁃ＭＨＣ表达，梗阻性黄疸患者血清孵育ＰＭＶＥＣｓｃａｌｐｏｎｉｎ㊁α⁃ＳＭＡ和ＳＭ⁃ＭＨＣ蛋白表达阳性；与健康志愿者血清比较，梗阻性患者黄疸血清孵育ＰＭＶＥＣｓＳＭ⁃ＭＨＣ表达上调；与Ｔ１时比较，Ｔ２，３时梗阻性黄疸血清孵育ＰＭＶＥＣｓｃａｌｐｏｎｉｎ㊁α⁃ＳＭＡ和ＳＭ⁃ＭＨＣ表达上调；与Ｔ２时比较，Ｔ３时梗阻性黄疸患者血清孵育ＰＭＶＥＣｓｃａｌｐｏｎｉｎ㊁α⁃ＳＭＡ和ＳＭ⁃ＭＨＣ表达上调㊂这与本研究前期动物实验结果［１２］存在一定差异，即梗阻性黄疸患者血清导致的ＰＭＶＥＣｓ肌样分化标志蛋白表达在Ｔ２时已达到平台期，其后表达维持在较高水平，但并未显著增加，其具体原因尚待进一步明确㊂综上所述，梗阻性黄疸患者血清促进ＰＭＶＥＣｓ肌样分化，可能是肺微血管扩张机制之一㊂参㊀考㊀文㊀献［１］㊀ＳｐａｇｎｏｌｏＰ，ＺｅｕｚｅｍＳ，ＲｉｃｈｅｌｄｉＬ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｃｏｍｐｌｅｘｉｎｔｅｒ⁃ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓｂｅｔｗｅｅｎｃｈｒｏｎｉｃｌｕｎｇａｎｄｌｉｖｅｒｄｉｓｅａｓｅ：ａｒｅｖｉｅｗ［Ｊ］．ＪＶｉｒａｌＨｅｐａｔ，２０１０，１７（６）：３８１⁃３９０．ＤＯＩ：１０．１１１１∕ｊ．１３６５⁃２８９３．２０１０．０１３０７．ｘ．［２］㊀ＭａｇａｎｔｙＫ，ＧｈａｎｔａＲ，ＢｅｊａｒａｎｏＰ，ｅｔａｌ．Ｌｉｖｅｒｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｆｏｒｈｅｐａｔｏｐｕｌｍｏｎａｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅｄｕｅｔｏｎｏｎｃｉｒｒｈｏｔｉｃｐｏｒｔａｌｈｙｐｅｒ⁃ｔｅｎｓｉｏｎ［Ｊ］．ＴｒａｎｓｐｌａｎｔＰｒｏｃ，２０１１，４３（７）：２８１４⁃２８１６．ＤＯＩ：１０．１０１６∕ｊ．ｔｒａｎｓｐｒｏｃｅｅｄ．２０１１．０７．００３．［３］㊀ＭｏｒｉｋａｗａＮ，ＨｏｎｎａＴ，ＫｕｒｏｄａＴ，ｅｔａｌ．Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｏｆｈｅｐａ⁃ｔｏｐｕｌｍｏｎａｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅａｆｔｅｒｌｉｇａｔｉｏｎｏｆａｐｏｒｔｏｓｙｓｔｅｍｉｃｓｈｕｎｔｉｎａｐｅｄｉａｔｒｉｃｐａｔｉｅｎｔｗｉｔｈａｎＡｂｅｒｎｅｔｈｙｍａｌｆｏｒｍａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＪＰｅｄｉａｔｒＳｕｒｇ，２００８，４３（２）：ｅ３５⁃ｅ３８．ＤＯＩ：１０．１０１６∕ｊ．ｊｐｅｄｓｕｒｇ．２００７．１１．００１．［４］㊀ＺｅｎｇＪ，ＹｉＢ，ＷａｎｇＺ，ｅｔａｌ．ＥｆｆｅｃｔｏｆａｎｎｅｘｉｎＡ２ｏｎｈｅｐａｔｏｐ⁃ｕｌｍｏｎａｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅｒａｔｓｅｒｕｍ⁃ｉｎｄｕｃｅｄｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｐｕｌｍｏｎａｒｙａｒｔｅｒｉａｌｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＲｅｓｐｉｒＰｈｙｓｉｏｌＮｅｕｒｏｂｉｏｌ，２０１３，１８５（２）：３３２⁃３３８．ＤＯＩ：１０．１０１６∕ｊ．ｒｅｓｐ．２０１２．０９．００９．［５］㊀ＡｌｄｅｎｋｏｒｔｔＦ，ＡｌｄｅｎｋｏｒｔｔＭ，ＣａｖｉｅｚｅｌＬ，ｅｔａｌ．Ｐｏｒｔｏｐｕｌｍｏｎａｒｙｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎａｎｄｈｅｐａｔｏｐｕｌｍｏｎａｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅ［Ｊ］．ＷｏｒｌｄＪＧａｓ⁃ｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，２０１４，２０（２５）：８０７２⁃８０８１．ＤＯＩ：１０．３７４８∕ｗｊｇ．ｖ２０．ｉ２５．８０７２．［６］㊀ＨａｇａｎＮ，Ｂｅｎ⁃ＺｖｉＡ．Ｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒ，ｃｅｌｌｕｌａｒ，ａｎｄｍｏｒｐｈｏｌｏｇ⁃ｉｃａｌｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆｂｌｏｏｄ⁃ｂｒａｉｎｂａｒｒｉｅｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｄｕｒｉｎｇｅｍｂｒｙ⁃ｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］．ＳｅｍｉｎＣｅｌｌＤｅｖＢｉｏｌ，２０１５，３８：７⁃１５．ＤＯＩ：１０．１０１６∕ｊ．ｓｅｍｃｄｂ．２０１４．１２．００６．［７］㊀ＦｏｎｓＰ，Ｇｕｅｇｕｅｎ⁃ＤｏｒｂｅｓＧ，ＨｅｒａｕｌｔＪＰ，ｅｔａｌ．Ｔｕｍｏｒｖａｓｃｕｌａ⁃ｔｕｒｅｉｓｒｅｇｕｌａｔｅｄｂｙＦＧＦ∕ＦＧＦＲｓｉｇｎａｌｉｎｇ⁃ｍｅｄｉａｔｅｄａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ⁃ｄｅｒｉｖｅｄｃｅｌｌｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ：Ｔｈｉｓｍｅｃｈａｎｉｓｍｉｓｉｎ⁃ｈｉｂｉｔｅｄｂｙＳＳＲ１２８１２９Ｅ，ｔｈｅｆｉｒｓｔａｌｌｏｓｔｅｒｉｃａｎｔａｇｏｎｉｓｔｏｆＦＧＦＲｓ［Ｊ］．ＪＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ，２０１５，２３０（１）：４３⁃５１．ＤＯＩ：１０．１００２∕ｊｃｐ．２４６５６．［８］㊀ＭａｒｔｉｓＮ，ＰｏｍａｒｅｓＣ，ＪｅａｎｄｅｌＰＹ，ｅｔａｌ．Ｈｅｐａｔｏｐｕｌｍｏｎａｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｖｉｓｃｅｒａｌｌｅｉｓｈｍａｎｉａｓｉｓ［Ｊ］．ＩｍｍｕｎｏｌＲｅｓ，２０１５，６１（１⁃２）：１６９⁃１７１．ＤＯＩ：１０．１００７∕ｓ１２０２６⁃０１４⁃８５９２⁃２．［９］㊀ＢｌｏｏｍＳ，ＫｅｍｐＷ，ＬｕｂｅｌＪ．Ｐｏｒｔａｌｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ：Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉ⁃ｏｌｏｇｙ，ｄｉａｇｎｏｓｉｓａｎｄｍａｎａｇｅｍｅｎｔ［Ｊ］．ＩｎｔｅｒｎＭｅｄＪ，２０１５，４５（１）：１６⁃２６．ＤＯＩ：１０．１１１１∕ｉｍｊ．１２５９０．［１０］㊀ＤｅＱｕｅｉｒｏｓＡＳ，ＢｒａｎｄａｏＳＣ，ＭａｃｅｄｏＬＧ，ｅｔａｌ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｎｏｒｍａｌｉｔｙａｎｄｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙｐａｒａｍｅｔｅｒｓｏｆｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙｗｉｔｈ９９ｍＴｃ⁃ＭＡＡｉｎｔｈｅｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆｉｎｔｒａｐｕｌｍｏｎａｒｙｖａｓｃｕｌａｒｄｉｌａｔａ⁃ｔｉｏｎｓ［Ｊ］．ＡｎｎＮｕｃｌＭｅｄ，２０１４，２９（１）：４６⁃５１．ＤＯＩ：１０．１００７∕ｓ１２１４９⁃０１４⁃０９１５⁃９．［１１］㊀ＹｉＢ，ＺｅｎｇＪ，ＷａｎｇＧ，ｅｔａｌ．ＡｎｎｅｘｉｎＡ１ｐｒｏｔｅｉｎｒｅｇｕｌａｔｅｓｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰＭＶＥＣｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎＣＢＤＬｒａｔｓｅｒｕｍ⁃ｉｎ⁃ｄｕｃｅｄｐｕｌｍｏｎａｒｙｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ［Ｊ］．ＪＴｒａｎｓｌＭｅｄ，２０１３，１１：９８．ＤＯＩ：１０．１１８６∕１４７９⁃５８７６⁃１１⁃９８．［１２］㊀王芝，易斌，国斌，等．肝肺综合征大鼠肺微血管内皮细胞肌样分化时转化生长因子β１表达的变化［Ｊ］．中华麻醉学杂志，２０１１，３１（７）：８６２⁃８６４．ＤＯＩ：１０．３７６０∕ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．０２５４⁃１４１６．ＷａｎｇＺ，ＹｉＢ，ＧｕｏＢ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｂｅｔａ１ｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄｐｕｌｍｏｎａｒｙｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒｅｎ⁃ｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｏｆｈｅｐａｔｏｐｕｌｍｏｎａｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅｒａｔ［Ｊ］．ＣｈｉｎＪＡｎｅｓ⁃ｔｈｅｓｉｏｌ，２０１１，３１（７）：８６２⁃８６４．ＤＯＩ：１０．３７６０∕ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．０２５４⁃１４１６．（收稿日期：２０１６⁃０１⁃０６）（本文编辑：葛胜辉）更㊀㊀正本刊２０１６年第３６卷第６期６９３页发表的文章‘富氢液对神经病理性痛大鼠脊髓神经细胞自噬的影响“，作者单位更正如下：３０００５２㊀天津医科大学总医院麻醉科［王慧星（现在天津医科大学第二医院疼痛治疗中心工作）㊁于泳浩㊁陈红光㊁陈亚军㊁何颖㊁王小波］；天津医科大学第二医院疼痛治疗中心（史可梅），通信作者：于泳浩，Ｅｍａｉｌ：ｙｕｙｏｎｇｈａｏ＠１２６．ｃｏｍ㊂本刊编辑部万方数据。