SDS-PAGE蛋白质胶内酶切

蛋白质肽谱制备1．凝胶，用解剖刀将胶带切成1-2mm2大小的胶片放入小管中。

★凝胶染色分为：A:硝酸银染色 B:考马斯亮蓝染色 C:胶体蓝染色★胶粒分为：A:一维SDS-Page胶粒 B:二维双向电泳胶粒2．凝胶加入脱色液100ul浸泡，振荡20min，弃取溶液，重复1-2次直至蓝色褪尽,乙腈100ul,弃废液。

★如果为二维双向电泳胶粒，直接进行第3步骤。

★如果为一维SDS-Page胶粒，需要加两个步骤：①加入50uLDTT还原液,30min,56度,弃废液,加100ul乙腈脱水5-10min②加入50ul碘乙酰胺烷基化，于暗处30min（开冻干机）3．凝胶加100ul脱色液，洗5-10min，乙腈100ul,弃废液，冰冻干燥20min.4. 凝胶加入15-20ul酶液（0.01ug/ul），置于4度放置30min，待酶液完全被吸收，补充酶解缓冲液(25mMNH4HCO3)15-20ul，使胶完全浸没，37度保温15小时以上或过夜。

★如果一管中的胶粒很多，15-20ul酶液不足让所有胶粒都吸涨，可视情况多加酶液。

补同体积酶解缓冲液后，胶粒刚好被液体浸住。

（后边提取液I、提取液II也可相应多加，且提取时间也可相应增长。

）5．加提取液I(5%TFA)100ul,40度加热水浴1小时，每30min，超声一次，3min左右。

6．将提取液吸到另一干净的管中，冰冻干燥；向胶块中加入提取II(50%乙腈，2.5%TFA)100ul,30度保温1小时，每30min，超声一次，3min左右。

7. 将提取液合并，氮气吹干乙腈后，冰冻干燥。

（冻干的肽段放-20度冰箱保存）8．向冻干肽段加入2~10ul（根据未脱色以前胶粒的颜色深浅，判断样品的量多少）的0.1%TFA溶液混匀。

（如果不能及时上质谱检测，建议不要复溶冻干肽段。

）9. 取0.5ul~0.8ul样品点靶。

待干，再点0.5ul基质，上质谱。

溶液配制1．100mMNH4HCO3:称取1.975gNH4HCO3溶于250ml的去离子水中2．脱色液配方乙腈：50mMNH4HCO3=1:13. 10mmol/LDTT还原液：称取1.54mg溶于1ml100mMNH4HCO3中4．55mmol/L烷基化溶液：称取10.2mg碘乙酰胺溶于1mL100mMNH4HCO3中5．酶解贮液：Trypsin(Promega,V5111)制备为0.5ug/ul水溶液，分装1-3ug-20度保存(粉末+40ul水——>2~6ul分装。

SDS-PAGE电泳法测定蛋白质相对分子质量实验目的了解SDS-PAGE垂直板型电泳法的基本原理及操作技术学习SDS-PAGE法测定蛋白质相对分子量的技术实验原理SDS-PAGE即十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)：1. 在混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷量。

2. 在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入适量SDS (阴离子表面活性剂)，使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上(一定条件下，大多数蛋白质与之结合比为1.4g SDS/1g protein)，使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质之间原有的电荷差别。

此时特定蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于其分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。

3. 蛋白质分子量在15,000～200,000之间时，其电泳迁移率与分子量的对数值线性相关：若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可以获得一条标准曲线，而从未知蛋白质在相同电泳条件下的迁移率即可在标准曲线上求得其分子量。

实验设备与试剂垂直板型电泳槽直流稳压电源微量注射器移液器水浴锅染色槽烧杯试管滴管分离胶缓冲液(1.5 mol/L Tris-HCl, pH8.8)：称取Tris 18.15g，加约80ml 无离子水，用1 mol/L HCl调pH至8.8，无离子水定容至100ml，4℃保存浓缩胶缓冲液(0.5 mol/L Tris-HCl液, pH6.8)：称取Tris 6g，加约60ml 无离子水，用1 mol/L HCl调pH至6.8，无离子水定容至100ml，4℃保存凝胶贮液：称取丙烯酰胺(Acr) 29.2g及N,N’-甲叉双丙烯酰胺(Bis)0.8g，重蒸水定容至100ml，过滤后置棕色试剂瓶于4℃保存10%浓缩胶贮液：称Acr 10g及Bis 0.5g，溶于重蒸水中并定容至100ml，过滤后置棕色试剂瓶于4℃保存10%SDS溶液：10g SDS加重蒸水定容至100ml，室温保存(低温下易析出结晶，用前微热，使其完全溶解)1%TEMED (四甲基二乙胺)10%过硫酸铵(AP)：配制后分装，-20℃保存电泳缓冲液(Tris-Gly缓冲液pH8.3)：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g, SDS 1.0g, 用无离子水溶解后定容至1L染色液：0.25g考马斯亮蓝G-250，加入454ml 50%甲醇溶液和46ml冰乙酸即可脱色液：75ml冰乙酸，875ml重蒸水与50ml甲醇混匀实验步骤1. 安装夹心式垂直板电泳槽：夹心式垂直板电泳槽有很多型号，主要结构相同，且操作简单，不易泄漏。

不连续SDS—PAGE测定蛋白质变性实验操作原理：蛋白质是两性电解质在一定的PH条件下解离而带电。

当溶液的PH大于蛋白质的等电点（PI）时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正级移动；当溶液的PH小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的静电荷的多少，蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。

一、主要仪器设备1、 DYY-8C电泳仪2、 DYCZ-24E型电泳槽（垂直板式）3、 WD-9410平板凝胶真空干燥器（配有抽气速率1升/秒，极限压力6×10-2帕真空泵）4、 TDL-40B及TGL-16G型高速离心机5、分析天平（1/1000）6、 50微升及100微量加样器7、 FJ-200高速分散均质机8、棕色玻璃真空干燥器及棕色小口瓶等玻璃实验仪器一宗二、化学试剂及溶液的配制：1、主要的化学试剂：（1）高纯度丙烯酰胺（Acr）（2）高纯度N，N-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）（3）三羟甲基氨基甲烷（Tris）纯度≧99、5%（4）十二烷基硫酸钠（SDS）（5）过硫酸铵（AP）（6） N，N，N’，N’-四甲基乙二胺（TEMED）（7）溴酚蓝（8）甘氨酸（GLY）（9）考马斯亮蓝R250或考马斯亮蓝G250（10）冰醋酸 AR（11）甲醇 AR（12）甘油 AR（13）无水乙醇 AR（14）琼脂糖 CR（15）盐酸 AR2、溶液的配制：（1） 30%丙烯酰胺贮存液：Acr：3g，Bis：0、08g，先加8ml去离子水溶解，最后定容至10ml（2）分离胶缓冲液（1、5mol/l Tris-Hcl PH8、8）Tris：1、815g，先加8ml去离子水溶解后，再用浓盐酸调PH8、8，定容至10ml（3）浓缩胶缓冲液（0、5mol/l Tris-Hcl PH6、8）Tris：0、6g，先加6ml去离子水溶解后，再用浓盐酸调PH6、8，最后定容至10ml （4）电极缓冲液（PH8、3）Tris：6g，GLY：28、8g，SDS：1g，加去离子水并定容至1000ml .（5）10%（W/V）十二烷基硫酸钠（SDS）在10ml容量瓶中，称取1gSDS，加水溶解后定容至10ml（6）10%（W/V）过硫酸铵（AP）（现用现配）称取1gAP置于10ml棕色容量瓶中，加水溶解后定容至10ml（7）1%TEMED量取0、1mlTEMED加水溶解后定容至10ml（8）0.1%溴酚蓝称取0、01g溴酚蓝加水溶解后定容至10ml（9）样品溶解液量取0、5mol/lTris-Hcl（PH6、8）1、25ml，50%甘油4ml，10%SDS2ml，0．1%溴酚蓝2ml，加水定容至10ml。

SDS－PAGE测定蛋白质相对分子质量一、前言聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称PAGE，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。

聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。

催化聚合的常用方法有两种:化学聚合法和光聚合法。

化学聚合以过硫酸铵(APS)为催化剂，以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。

在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。

PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。

不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。

不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。

浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCl。

分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCl。

电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。

2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。

SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。

而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。

在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。

SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。

双向电泳的全套实验步骤及其注意事项本手册向您提供双向电泳实验过程中从样品制备、IEF电泳、胶条平衡、SDS-PAGE、凝胶染色脱色、胶内蛋白质点的切取、胶内胰酶消化以及质谱样品的制备等全部实验步骤，为您的实验提供全流程的帮助。

细胞样品的一般处理步骤1. 吸出培养液，用胰酶消化或细胞刮子收获细胞。

2. 加入PBS溶液，1500ｇ离心10分钟，弃上清。

重复3次。

3. 加入5倍体积裂解液，或按1×106细胞悬于60～100ｕｌ裂解液中混匀。

4. 液氮中反复冻融3次。

5. 加50ug/ml RNase及200ug/ml DNase，在4℃放置15分钟。

6. 15,000转，4℃离心15分钟。

7. 收集上清，分装分装后冻存于－70℃。

组织样品的一般处理步骤1. 碾钵碾磨组织，碾至粉末状。

2. 将适量粉末状组织转移至匀浆器，加入适量裂解液，进行匀浆。

3. 加50ug/ml RNase及200ug/ml DNase，在4℃放置15分钟。

4. 15,000转，4℃离心20分钟。

5. 收集上清，分装后冻存于－70℃。

双向电泳中溶液配制水化上样缓冲液（I）：尿素8M 4.805gCHAPS 4% 0.4gDTT 65mM 0.098g（现加）Bio-Lyte 0.2%(w/v) 50μl（40%）（现加）溴酚蓝0.001% 10μl（1% 溴酚蓝）MilliQ水定容至10ml；分装成10小管，每小管1ml，-20℃冰箱保存。

水化上样缓冲液（II）：尿素7M 4.2g硫脲2M 1.52gCHAPS 4% 0.4gDTT 65mM 0.098g（现加）Bio-Lyte 0.2%(w/v) 50μl（40%）（现加）溴酚蓝0.001% 10μl（1% 溴酚蓝）MilliQ水定容至10ml；分装成10小管，每小管1ml，-20℃冰箱保存。

水化上样缓冲液（III）：尿素5M 3.0g硫脲2M 1.52gCHAPS 2% 0.2gSB 3-10 2% 0.2gDTT 65mM 0.098g（现加）Bio-Lyte 0.2%(w/v) 50μl（40%）（现加）溴酚蓝0.001% 10μl（1% 溴酚蓝）MilliQ水定容至10ml；分装成10小管，每小管1ml，-20℃冰箱保存。

在进行SDS-PAGE蛋白凝胶电泳原理的讨论之前，我们首先需要了解蛋白质和电泳技术的基本概念。

蛋白质是生物体内功能最丰富的大分子化合物，它们参与了生命的方方面面，包括结构、酶活性、信号传导等。

而电泳技术则是一种基于电场作用将带电粒子分离的方法，它在生命科学研究中有着广泛的应用。

SDS-PAGE蛋白凝胶电泳原理是一种常用于分离和鉴定蛋白质的技术，其原理基于蛋白质在电场中的迁移速度与其分子质量成反比的关系。

现在让我们深入探讨SDS-PAGE蛋白凝胶电泳的原理和相关细节。

1. SDS-PAGE蛋白凝胶电泳的基本步骤在进行SDS-PAGE蛋白凝胶电泳实验时，首先需要将待测样品中的蛋白质在含有SDS（十二烷基硫酸钠）的缓冲液中进行变性处理，使得蛋白质呈线性结构并且带有负电荷。

之后，将处理过的蛋白样品加载到聚丙烯酰胺凝胶中，并施加电场使得蛋白质开始迁移。

根据蛋白质的分子质量，它们将在凝胶中以不同的速率迁移，最终实现分离。

2. SDS的作用原理SDS是一种带有负电荷的表面活性剂，它的主要作用是使得蛋白质呈线性构象，并且使得蛋白质的带电量与其分子质量成正比。

这样一来，不同分子质量的蛋白质在电场中受到的阻力相对应也会不同，从而实现蛋白质的分离。

3. 凝胶电泳的原理凝胶电泳是利用凝胶作为分离介质的电泳方法。

凝胶可以是聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶或者琼脂糖琼脂糖凝胶。

在SDS-PAGE蛋白凝胶电泳中，聚丙烯酰胺凝胶是最常用的分离介质。

它的基本原理是利用凝胶的孔隙大小来实现对蛋白质的分离，分子质量较大的蛋白质会受到较大的阻力从而迁移较慢，分子质量较小的蛋白质则会迁移得更快。

4. 电泳条件的影响在进行SDS-PAGE蛋白凝胶电泳实验时，电泳条件的设定对分离结果有着重要影响。

电场强度的大小、电泳时间的长短、凝胶浓度等都会影响蛋白质的迁移速度和分离效果。

总结而言，SDS-PAGE蛋白凝胶电泳原理基于蛋白质在电场中的迁移速度与其分子质量成反比的关系，通过SDS的作用使得蛋白质呈现线性构象并且带有负电荷，再利用凝胶电泳对不同分子质量的蛋白质进行分离。

SDS-PAGE检测蛋白质纯度1．电泳的基本原理许多生物分子都带有电荷，其电荷的多少取决于分子性质及其所在介质的pH及其组成。

由于混合物中各组分所带电荷性质、电荷数量以及分子量的不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速度也各异，因此，在一定时间内，由于各组分移动距离的不同，而达到分离鉴定各组分的目的。

2．影响电泳的主要因素2.1 电泳介质的pH当介质的pH等于某种两性物质的等电点时，该物质处于等电状态，即不向正极或负极移动。

当介质pH小于其等电点时，则呈正离子状态，移向负极；反之，介质pH大于其等电点时，则呈负离子状态，移向正极。

因此，任何一种两性物质的混合物电泳均受介质pH的影响，即决定两性物质的带电状态及其量，为了保持介质pH的稳定性，常用一定pH的缓冲液，如分离血清蛋白质常用pH8．6的巴比妥或三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液。

2.2 缓冲液的离子强度离子强度对电泳的影响是：离子强度低，电泳速度快，分离区带不易清晰；离子强度高，电泳速度慢，但区带分离清晰。

如离子强度过低，缓冲液的缓冲量小，不易维持pH的恒定；离子强度过高，则降低蛋白质的带电量(压缩双电层)使电脉速度减慢。

所以常用离子强度为0.02-0.2之间。

2.3 电场强度电场强度和电泳速度成正比关系。

电场强度以每厘米的电势差计算，也称电势梯度。

如纸电泳的滤纸长15cm，两端电压（电势差）为150V，则电场强度为150/15=10V/cm，电场强度愈高，则带电粒子的移动愈快。

电压增加，相应电流也增大，电流过大时易产生热效应可使蛋白质变性而不能分离。

2.4 电渗作用在电场中，液体对固体的相对移动，称为电渗。

如滤纸中含有表面带负电荷的羧基，溶液则向负极移动。

由于电渗现象与电泳同时存在，所以电泳的粒子移动距离也受电渗影响，如纸上电泳蛋白质移动的方向与电渗现象相反，则实际上蛋白质泳动的距离，等于电泳移动距离减去电渗距离。

如电泳方向和电渗方向一致，其蛋白质移动距离，等于二者相加。

蛋白质酶切技术的原理及应用随着生命科学研究的不断深入，蛋白质分析已成为科学家们关注的热点之一。

在蛋白质的研究过程中，蛋白质酶切技术是不可或缺的工具之一。

本文将从原理、基本步骤、应用等方面介绍蛋白质酶切技术。

一、原理蛋白质酶切技术指的是利用特定的蛋白酶对蛋白质分子进行酶解，得到分子量明确的特定片段，并通过其分子量和标记方法确定目标蛋白质的存在。

虽然酶法最早是在DNA测序领域中使用的，但自1980年代以来，该方法已成为纯化和鉴定蛋白质的标准技术。

二、基本步骤蛋白质酶切技术的基本步骤包括如下几个：1. 样品制备：将目标蛋白质从细胞组织或者细胞培养液中提纯出来。

2. 酶切反应：将目标蛋白质放入适当的缓冲液中，加入特定的蛋白酶，直接切割或酶促氨基酸缺失技术消除穿越的特定蛋白酶（例如，切割酶筛和活性中心物质如PMSF，EDTA或DTT）。

3. 凝胶电泳：将消解后的多肽用SDS-PAGE凝胶进行分离，使不同蛋白多肽明显分离，然后可对样品进行银染、共染或荧光染色等。

4. 单个蛋白多肽研究：使用一种或两种蛋白质酶切。

另一种酶可用于第二步检测结果以及以后的测序分析。

三、应用1. 蛋白质结构分析蛋白质酶切技术广泛应用于分析蛋白质结构。

蛋白质不同结构域的多肽易于经历显著分子量改变，因此可以进行高通量多肽片段的组合、分离和测序，以解析重要功能区域的结构和功能。

2. 生物标记功能分析生物标记从分子尺度上揭示了细胞和组织的生理状况，因此深入入手研究蛋白质生物标记功能对于疾病诊断和治疗具有重要意义。

蛋白质酶切技术可用于确定蛋白质生物标记的存在和位置。

蛋白质酶切后，使用质谱技术进行分析，可以确定片段中心的生物标记。

3、蛋白质定量与谱库建立蛋白质酶切技术还广泛应用于蛋白质定量，这是生命科学的基础之一。

通过制备多肽片段组合，观察蛋白质片段数量的变化，可以得出蛋白质量的浓度、分子多态性以及分子筛选效率等重要信息。

此外，通过大规模的蛋白质酶切及其他定量方法，可以建立大规模的谱库。