微生物工程工艺原理 第四篇 发酵产物的提取与精制

❖ 2、絮凝作用 ❖ 絮凝是指使用絮凝剂（通常是天然或合成的大分子
量聚电解质），在悬浮粒子之间产生架桥作用而使 胶粒形成粗大的絮凝团的过程。
❖ 常用的絮凝剂 ❖ 聚丙烯酰胺、聚乙烯亚胺、聚胺衍生物、氯化钙、
磷酸氢二钠
❖ 絮凝技术预处理发酵液的优点不仅在于过滤 速度的提高，还在于能有效地去除杂蛋白质 和固体杂质，如菌体、细胞和细胞碎片等， 提高了滤液质量
（一）凝聚和絮凝技术
❖ 凝聚和絮凝能有效改变细胞、菌体和蛋白质 等胶体粒子的分散状态，破坏其稳定性，使 它们聚集成可分离的絮凝体，再进行分离。
❖ 常用于细小菌体或细胞（分泌胞外产物）、 细胞的（分泌胞内产物）碎片以及蛋白质等 胶体粒子的去除。
❖ 但是应当注意，凝聚和絮凝是两种方法，两 个概念，其具体处理过程也是有差别的。
菌种对过滤速度影响
❖ 真菌的菌丝比较粗大，如青霉菌的菌丝直径可 达10μm，发酵液容易过滤，不需特殊处理。 其滤渣呈紧密饼状物，很容易从滤布上刮下来， 故可采用鼓式真空过滤机过滤。
❖ 放线菌发酵液菌丝细而分枝，交织成网络状。 如链霉素发酵液菌丝仅0.5~1.0μm左右，还含 有很多多糖类物质，粘性强，过滤较困难，一 般需经预处理，以凝固蛋白质等胶体。
✓该法不适于大规模操作，因为放大后，要输入
很高的能量来提供必要的冷却，这是困难的。
• 撞击破碎法
✓一种改进的高压方法是将浓缩的菌体悬
浮液冷却至-25˚C至-30 ˚C形成冰晶体， 利用500 MPa以上的高压冲击，冷冻细 胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由 于冰晶体的磨损，包埋在冰中的微生物 的变形所引起的。
一般工艺过程
❖ 一般说来，下游加工过程可分为4个 阶段：培养液(发酵液)的预处理和固 液分离；初步纯化(提取)；高度纯化 (精制)；成品加工。

提取与精制的常用技术
蒸发浓缩技术是使溶剂蒸发而达到提高溶质浓度目的的操作。
蒸发 浓缩
常压蒸发浓缩 减压蒸发浓缩
提取与精制的常用技术
结晶技术是利用溶液达到过饱和状态而使溶质以结晶形式析出的操作。
结晶
降温结晶法 加热结晶法
提取与精制工艺的设计原则
1. 工艺设计须满足产品的纯度要求
例如：赖氨酸的生产
3. 工艺设计须尽可能降低生产成本 例如：耐高温淀粉酶的提取
喷雾干燥 固体酶制剂
淀粉酶发酵液 超滤除菌 超滤浓缩 液体酶制剂
沉淀法提取 冷冻干燥 固体酶制剂
提取与精制工艺的设计原则
4. 工艺设计须尽可能提高得率
例如：谷氨酸的生产
谷氨酸发酵液 分批等电点提取
离心分离 干燥 谷氨酸
谷氨酸发酵液 超滤除菌 真空浓缩
赖氨酸发酵液 超滤除菌
离子交换提取 真空浓缩
喷雾干燥 食品级赖氨酸
溶解 调节pH至5.0
脱色 重结晶 分离与干燥 医药级赖氨酸
提取与精制工艺的设计原则
2. 工艺设计须满足产品的稳定性要求 例如：活性干酵母的生产
干燥
加热干燥 冷冻干燥
为了保证活性干酵母的活性，须选择冷冻干燥工艺。
提取与精制工艺的设计原则
提取与精制的目的 提取与精制的常用技术 提取与精制工艺的设计原则
提取与精制的目的
利用分离技术，从发 酵醪中获得目标产物 粗品的过程。
提取
精制
目 的
利用分离技术，将目 标产物粗品进一步纯 化，获得较高纯度产 品的过程。
根据产品规格要求，采用各种分离技术，获得所需要的产品。
提取与精制的常用技术
提取 精制
等电点 沉淀法

三、分离纯化方法的综合运用与工艺优化
应作好工序间的衔接工作，从加工产物质量、 产物收率与纯度的平衡、时间与经济性等角度出 发，对影响工艺流程整体纯化效果的加工条件进 行优化：
1 收率与纯度之间的平衡 2 经济性考虑 3 工艺放大 4 纯化过程中对产品的检测
1 收率与纯度之间的平衡
发酵产品有效成分分离纯化过程中，产品的 纯度与产率之间是一对矛盾的关系。比如，微生 物发酵产物为药品时，其有效成分的纯度是衡量 其质量优劣的重要指标，特别是非肠道药物，其 纯度的高低直接关乎用药的安全性。纯化产品产 率的提高往往伴随着纯度的下降，反之对产品纯 度要求的提高意味着纯化成本的提高和产物收率 的降低。
微生物发酵产物的分离纯化
第二节 分离纯化技术
一、细胞破碎技术 二、沉淀分离纯化技术 三、离心分离纯化技术 四、膜分离纯化技术 五、层析分离纯化技术 六、萃取技术 七、冷冻干燥技术
第二节 分离纯化技术
一、细胞破碎技术
（一）发酵液的预处理和固液分离 目的：分离菌体和其他悬浮颗粒(细胞碎片、核 酸和蛋白质的沉淀物)；除去部分可溶性杂质和 改变滤液性质，以利于提取和精制的顺利进行。 方法：高价无机离子的去除方法，杂蛋白质的去 除，发酵液的凝聚和絮凝。
一、建立分离纯化工艺的根据
1.微生物发酵产物的特点
➢另一个特点是欲提取的生物物质通常很不 稳定，遇热、极端pH、有机溶剂会引起失 活或分解。
➢发酵或培养都是分批操作、生物变异性大， 各批发酵液不尽相同，要求下游加工有一 定的弹性。
一、建立分离纯化工艺的根据
2.原理
（1）物理性质 ① 力学性质：重力、离心力、筛分； ② 热力学性质：状态变化、相平衡； ③ 传质性质：粘度、扩散、热扩散； ④ 电磁性质：电泳、电渗析、磁化；

葡聚糖、甘露聚糖和蛋白质等。
• ③其他真菌细胞壁主要由多糖组成，如几 丁质或纤维素强度比细菌和酵母菌高。
（2）常用的细胞破碎方法
• 细胞破碎的方法很多，根据外加作用力的 方式可分为机械法和非机械法两大类。
• 前者有珠磨法、高压匀浆法、超声波法、 X-press法；
• 后者有酶解法、化学法、物理法、干燥法 等。
• 滤饼过滤中，过滤介质为滤布。悬浮液通过 滤布时，固体颗粒被滤布阻挡而逐渐形成滤 饼。滤饼至一定厚度时即起过滤作用。
（1）影响发酵液过滤的因素
• 发酵液属非牛顿性液体，粘度大，过滤速 度慢。
• 过滤速度与菌体细胞体积、发酵条件、未 利用完的培养基浓度、消沫剂、发酵周期 等有关。
（2）改善发酵液过滤性能的方法
• ④助滤剂法：助滤剂如硅藻土吸附细菌细胞 改变滤饼结构，降低过滤阻力，加快过滤速 度。
• ⑤反应剂法：
3．细胞破碎与分离
• 微生物的代谢产物如果是胞内物质（如有 些酶制剂、干扰素、胰岛素等），那么首 先要收集菌体，进行细胞破碎。
• （1）微生物细胞壁的组成与结构： • ①细菌细胞壁： • ②酵母菌细胞壁比G+菌稍厚，主要成分是
• （3）含有色素、热源物质、毒性物质等有 机杂质。
• （4）发酵产物稳定性低，对热、酸、碱、 有机溶剂、酶、机械力等敏感，不适宜条件 下易失活或分解。
2．提取和精制
• 提取和精制是为了从发酵液中获得高纯度 的、符合质量标淮要求的发酵成品。
• 发酵产物存在形式不同，用途各异，产品 质量要求不同，分离纯化步骤有所不同。
• ②变性法：加热变性、酸碱变性、有机溶 剂变性等。
• ③吸附法：吸附剂和沉淀剂的吸附作用。
• （3）色素及其他物质的去除

率高于60 %。

提取抗生素和分离生物粒子
采用PEG/ Na2HPO4 体系提取丙酰螺旋霉素，最佳 萃取条件是pH= 8. 0～8. 5 ， PEG2000 (14 %) / Na2HPO4 (18 %) ,小试收率达69. 2 % ,对照的乙酸丁 酯萃取工艺的收率为53. 4 %



双水相和其他方法的集成

(4) 目标产物的分配系数一般大于3 ,大多数情况下,目标产
物有较高的收率。

(5) 大量杂质能够与所有固体物质一起去掉,与其它常用固 液分离方法相比,双水相分配技术可省去1～2 个分离步骤, 使整个分离过程更经济。

(6) 设备投资费用少,操作简单,不存在有机溶剂残留问题。


6、双水相萃取的工艺流程
双水相萃取技术的工艺流程主要由三部分构成:目的产 物的萃取; PEG的循环; 无机盐的循环。


7、双水相的应用举例
分离和提纯各种蛋白质(酶） 用PEG/ -(NH4) 2SO4 双水相体系,经一次萃取从α- 淀粉 酶发酵液中分离提取α - 淀粉酶和蛋白酶, 萃取最适宜条件 为PEG1000 ( 15 %) -(NH4) 2SO4 (20 %) ,pH = 8 ,α- 淀粉 酶收率为90 % ,分配系数为19. 6 ,蛋白酶的分离系数高达 15. 1。比活率为原发酵液的1. 5 倍,蛋白酶在水相中的收
(2-7) ×10-4
由以上特性可以看出，超临界流体兼有液体和气体的双 重特性，扩散系数大，粘度小，渗透性好，与液体溶剂相 比，可以更快地完成传质，达到平衡，促进高效分离过程 的实现。
2、超临界流体萃取原理
超临界萃取是利用SCF作为萃取剂，从液体和固体中萃取出

溶性络合物，可消除对离子交换的影响。 • F3+离用黄血盐反应生成普鲁士监沉淀除去。
发酵产物的提取和精制工作
（2）杂蛋白的去除：
• ①沉淀法：利用蛋白质等电点进行沉淀， 或在酸碱性条件下加入阴离子阳离子进行 沉淀，或加入中性盐破坏蛋白质水化层进 行沉淀。
• ②变性法：加热变性、酸碱变性、有机溶 剂变性等。
丁质或纤维素强度比细菌和酵母菌高。
发酵产物的提取和精制工作
（2）常用的细胞破碎方法
• 细胞破碎的方法很多，根据外加作用力的 方式可分为机械法和非机械法两大类。
• 前者有珠磨法、高压匀浆法、超声波法、 X-press法；
• 后者有酶解法、化学法、物理法、干燥法 等。
发酵产物的提取和精制工作
• ①机械法：
• （3）含有色素、热源物质、毒性物质等有 机杂质。
• （4）发酵产物稳定性低，对热、酸、碱、 有机溶剂、酶、机械力等敏感，不适宜条件 下易失活或分解。
发酵产物的提取和精制工作
2．提取和精制
• 提取和精制是为了从发酵液中获得高纯度 的、符合质量标淮要求的发酵成品。
• 发酵产物存在形式不同，用途各异，产品 质量要求不同，分离纯化步骤有所不同。
• 发酵液属非牛顿性液体，粘度大，过滤速 度慢。
• 过滤速度与菌体细胞体积、发酵条件、未 利用完的培养基浓度、消沫剂、发酵周期 等有关。
发酵产物的提取和精制工作
（2）改善发酵液过滤性能的方法
• 发酵液难过滤时，需改善过滤性能，降低 滤饼比阻，提高过滤与分离的速率。
• 改善发酵液性能的方法有调酸、热处理、 添加凝聚剂、反应剂、助滤剂等。
活性炭、烧结陶瓷、烧结金属等，它们填充 在过滤器内构成过滤层，悬浮液通过滤层时， 固体颗粒被滤层颗粒阻拦或吸附，滤液得以 澄清。 • 滤饼过滤中，过滤介质为滤布。悬浮液通过 滤布时，固体颗粒被滤布阻挡而逐渐形成滤 饼。滤饼至一定厚度时即起过滤作用。

电泳
凝胶电泳 等电点电泳 等速电泳 区带电泳
筛分、电荷
蛋白质、核酸
筛分、电荷、浓度差 蛋白质、氨基酸
筛分、电荷、浓度差 蛋白质、氨基酸
筛分、电荷、浓度差 蛋白质、核酸
离心 离心过滤 离心沉降 超离心
离心力、筛分 离心力 离心力
菌体、菌体碎片 菌体、细胞 蛋白质、核酸、糖类
二、分离纯化的基本过程
1.一般工艺过程
三、分离纯化方法的综合运用与工艺优化
应作好工序间的衔接工作，从加工产物质量、 产物收率与纯度的平衡、时间与经济性等角度出 发，对影响工艺流程整体纯化效果的加工条件进 行优化：
1 收率与纯度之间的平衡 2 经济性考虑 3 工艺放大 4 纯化过程中对产品的检测
1 收率与纯度之间的平衡
发酵产品有效成分分离纯化过程中，产品的 纯度与产率之间是一对矛盾的关系。比如，微生 物发酵产物为药品时，其有效成分的纯度是衡量 其质量优劣的重要指标，特别是非肠道药物，其 纯度的高低直接关乎用药的安全性。纯化产品产 率的提高往往伴随着纯度的下降，反之对产品纯 度要求的提高意味着纯化成本的提高和产物收率 的降低。
一、建立分离纯化工艺的根据
1.微生物发酵产物的特点
➢另一个特点是欲提取的生物物质通常很不 稳定，遇热、极端pH、有机溶剂会引起失 活或分解。
➢发酵或培养都是分批操作、生物变异性大， 各批发酵液不尽相同，要求下游加工有一 定的弹性。
一、建立分离纯化工艺的根据
2.原理
（1）物理性质 ① 力学性质：重力、离心力、筛分； ② 热力学性质：状态变化、相平衡； ③ 传质性质：粘度、扩散、热扩散； ④ 电磁性质：电泳、电渗析、磁化；
三、分离纯化方法的综合运用与工艺优化

固，提高滤液质量。但草酸价格较贵，应注意回收。
②要除去铁离子，可加入黄血盐，与铁离子形成普鲁士蓝沉淀。
内容
1.概述 2.原料与预处理 3.固液分离 4.细胞破碎 5.初步纯化 6.精细纯化 7.成品加工
发酵液或多或少存在悬浮固体，需要使 用固液分离手段使清液和固态物质得到 很好的分离。常用的方法是过滤和离心 分离。
分离因数的极限值取决于转鼓材料的机械强度， 一般超高速离心机的结构特点是特性来选择离心机。
0.01 μm
0.1 μm
10 μm
100 μm
1 mm
10 mm
胶体
微粒
细粒
中等颗粒 过滤离心机
大颗粒
卧螺沉降离心机
超滤+微滤 离心机
碟式或管式离心机
副产物
干燥
细胞产品
目标产物
图5-1 目的产物提取与精制过程的一般工艺流程
整个分离路线一般可分为以下五个主要 步骤：预处理、固液分离、初步纯化、 精细纯化、成品加工。
预处理：采用加热、调整pH、絮凝等措施和单元操作改变 发酵液的理化性质，为固液分离作准备。
固液分离：采用珠磨、匀浆、酶溶、过滤、离心等单元操 作除去固相，获得包含目的产物的液相，供进一步分离纯 化用。
通过有效地改变菌体细胞和蛋白质等胶体粒子的分散状态，使其 凝聚成较大的颗粒，便于过滤。
（1）凝聚：在中性盐的作用下，由于胶体粒子之间双电子层排斥电 位的降低，而使胶体体系不稳定出现聚集的现象。
发酵液中的菌体细胞或蛋白质等胶体粒子的表面，一般都带有电 荷。在生理pH下，发酵液中的菌体或蛋白质常常带有负电荷，由 于静电吸引作用，在界面上形成了双电层，这种双电层的结构使 胶粒间不容易聚集而保持稳定的分散状态。

物 些目标产物存在于细胞内部。目前重组
的 提
DNA技术表达的产品（如肤岛素、干扰素、
取 白细胞介素等），都是胞内产物。首先必
与 精 制
须将细胞破碎，使产物得以释放，才能进 一步提取。
概
论
第四篇 发酵产物的提取与精制
第
十
二 章
（一）细胞壁的组成与结构
发 酵
细胞破碎 用物理、化学、酶或机械的方
产 法来破坏细胞壁或细胞膜。细胞壁的破碎
制 温度；细胞的变化(因处理时间的不同面引起
概 论
的)也同样影响着对破碎的敏感度。
第四篇 发酵产物的提取与精制
第
十
二 章
破碎方法
发 酵 产
细胞的破碎按照是否外加作用力可分为机 械法与非机械法两大类；机械法中高压匀
物 浆器和珠磨机在工业上得到应用，超声波
的 提
法和非机械法大多处在实验室应用阶段。
取
与
发 酵
（1）特点
产
物 ①自动化程度高、操作连续、处理量大；
的 提 取
②适合于固体含量较大（＞10%）的悬浮液 的分离；
与 ③一般不适合于菌体较小和粘度较大的细菌
精 制 概
发酵液的过滤。（可以离心） ④所得固相的干度较差。
论
第四篇 发酵产物的提取与精制
第 十 （2）工作过程 二 章
发 酵 产 物 的 提 取 与 精 制 概 论
第
十 三、菌体分离方法
二
章 （一）菌体和发酵醪的分离方法
发 酵
离心 过滤
产 物
（二）离心分离
的 提
离心分离可分为以下三种形式：
取 ①离心沉降
与 精 制
②离心过滤 ③离心分离和超离心

• 澄清过滤，也称为深层过滤，指颗粒沉积在床层内部的孔道壁上 而并不形成滤饼的过滤方式。
• （2）过滤介质
• 工业上常用的过滤介质有织物状介质、粒状介质 和多孔固体介质等类型。
• 织物状介质包括天然或合成纤维、金属丝等编织 而成的滤布或滤网，是工业生产中最常用的过滤 介质
• 粒状介质有硅藻土、石砾、细砂、锯屑、活性炭、 玻璃渣等，常用于过滤固体含量较少的悬浮液。
• 1.蒸馏 ：蒸馏可分为简单蒸馏和精馏。
• 拉乌尔定律指出：混合液中蒸汽压高（沸点低） 的组分，在气相中的含量总是比液相中高；反之， 蒸汽压低（沸点高）的组分，在液相中含量总是 比气相中高。一般把气相中酒精含量与液相中酒 精含量的比值称为酒精的挥发系数（用K表示）。 实验数据表明，在酒精浓度达到97.6%（体积分数） 前，酒精的挥发系数总是大于1，用常规的蒸馏方 法可以使酒精变浓。
括物理法（超声破碎、渗透压冲击、冻结融 化等）、化学法和酶溶法等
分类
作用机理
研磨法 固体剪切作用 机 械 法 高压匀浆法 液体剪切作用
撞击破碎法 固体剪切作用
特点
可达较高破碎率，可较大规模操作，大分子目的产物易失活 ，浆液分离困难
可达较高破碎率，可较大规模操作，不适合革兰氏阳性菌和 丝状菌
破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感产物不适应
• 多孔固体介质有多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料 等。
• （3）过滤设备 • 目前生物工程行业，常用于液-固过滤分离的设备有板框压滤机、
叶片过滤机及真空转鼓过滤机
板框压滤机结构 1-压紧装置；2-可动头；3-滤框；4-滤板；5 固定头；6-滤液出口；7-滤液进口；8-滤布
• 板框压滤机由滤板、滤框和压紧装置及支架等部分组成，许多块 滤板和滤框交替排列，滤板两侧过滤面上罩有滤布。