葡萄茎尖培养脱毒与快繁技术研究

葡萄茎尖超低温保存及超低温疗法脱毒研究葡萄(Vitis)是世界范围内最具经济价值的果树之一,城市化、工业化、土壤盐碱化和沙漠化等原因导致葡萄许多野生种与栽培种濒临灭绝。

建立高效、简易的种质资源长期保存技术能有效地保护种质资源的多样性。

超低温保存是目前植物种质资源长期保存最为理想的方法。

病毒病是制约葡萄与葡萄酒产业发展的主要因素之一。

栽培无毒苗是生产上防治病毒病害最为有效的措施。

生产无毒苗是栽培无毒苗的核心技术。

近年来建立的超低温疗法,为葡萄无毒苗生产提供了一种新技术。

本研究以葡萄(Vitis)试管苗为试材,建立了茎尖小滴-玻璃化法超低温保存体系,为葡萄种植资源超低温库的建立提供了高效、广谱的超低温保存方法。

建立了超低温疗法,有效的脱除了葡萄卷叶相关病毒-3(Grapevineleafroll-associated virus 3,GLRaV-3),为葡萄脱毒苗的生产提供了核心技术。

同时,试管指示植物法、微样直接RT-PCR、免疫组织化学定位病毒检测为脱毒和病毒检疫提供技术支撑。

本研究主要结果如下:1.通过优化影响葡萄茎尖超低温保存的关键因素,建立了简易、高效、光谱的葡萄茎尖小滴-玻璃化法超低温保存体系。

含5-6片叶原基的腋芽(尺寸约1.0 mm)取自8周苗龄欧洲葡萄‘赤霞珠’(Vitis vinifera‘Cabernet Sauvignon’)试管苗,在预培养基(0.3 M蔗糖+0.16μM还原型谷胱甘肽+0.14μM L-抗坏血酸,pH=5.7)上暗培养3 d。

加载液(2 M甘油+0.4 M蔗糖)常温处理20 min,再用1/2浓度植物玻璃化溶液(PVS2)和全浓度PVS2冰上分别处理30 min和25-50 min,然后将茎尖放置于铝箔条上的PVS2小滴(2.5μL)中,直接投入液氮中保存。

保存后的携带茎尖的铝箔条迅速转移到卸载液(1.2 M蔗糖)中常温解冻20 min,培养于含0.6 M蔗糖的恢复培养基中恢复24 h。

葡萄的组织培养技术湖北第二师范学院1.葡萄外植体的采集和消毒1.1外植体是从植物体上分离下来的用于离体培养的材料。

在该组织培养中，用的培养材料是茎尖，通常切块在0.5厘米左右，如果为培养无病毒苗而采用的培养材料通常仅取茎尖的分生组织部分，其长度在0.1毫米以下。

葡萄脱毒过程中，外植体的大小与脱毒率高低成相关性。

所以选取外植体的大小适宜在葡萄脱毒过程中应要掌握好.葡萄在茎尖培养中，光的效果通常要比暗培养好。

一般多采用光培养的方式，试管苗培养适宜的温度是25+/-2度1.2防止外植体带菌1.2.1选择好外植体采集时期和采集部位1.2.1.1外植体采集以春秋为宜；1.2.1.2优先选择地上部分作为外植体；1.2.1.3阴雨天勿采，晴天下午采集；1.2.1.4采前喷杀虫剂、杀菌剂或套塑料袋。

1.2.2室内或无菌条件下进行预培养。

1.2.3外植体严格灭菌灭菌效果实验多次灭菌和交替灭菌1.3培养材料的消毒1.3.1先将材料用流水冲洗干净，最后一遍用蒸馏水冲洗，再用无菌纱布或吸水将材料上的水分吸干，并用消毒刀片切成小块。

1.3.2在无菌坏境中将材料放入70％洒精中浸泡30－60秒。

1.3.3再将材料移入漂白粉的饱和液或0.01％升汞水消毒10分钟。

1.3.4取出后用无菌水冲洗三、四次。

1.4制备外植体将已消毒的材料，用无菌刀、剪、镊等，在无菌的环境下，剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮和种皮胚乳等，叶片则不需剥皮。

“然后切成0.2－0.5厘米厚的小片，这就是外植体。

2.培养基的成分及制备2.1培养基的成分组织培养过程中，外植体生长所需的营养和生长因子，主要是由培养基供应的。

因此，培养基中应包括植物生长必需的16种营养元素和某些生理活性物质。

所有这些物质，可概括为5大类：2.1.1无机营养物培养基的各种盐类中均含有氮、磷、钾、钙、镁、硫、铁、硼、锰、铜、锌、钼、氯。

无机氮可以两种形式供应，即硝态氮和铵态氮。

有些培养基以硝态氮为主，另一些以铵态氮为主，多数二者兼而有之。

《常见植物的脱毒与快速繁殖技术》一、常见植物培养方式：1、草莓脱毒苗的培养方式主要有微茎尖培养和花粉培养两种。

2、马铃薯病毒鉴定的方法主要有指示植物法、症状鉴定法。

3、通过组织培养获得微型薯的技术关键有两个：单茎节扩大繁殖；微型薯诱导。

4、在葡萄栽培架式，棚架是应用最广泛的类型。

5、草莓脱毒苗的培养方式主要有微茎尖培养和花粉培养两种。

6、菊花生根能力比较强，有两种方法：嫩茎试管生根；无根嫩茎的扦插。

7、菊花的继代增殖有多种技术，多数是诱导愈伤组织产生丛生芽而获得大量的试管苗。

8、百合经茎尖培养脱毒、鉴定合格后，可通过两种继代增殖方式：①经愈伤组织增殖；②诱导分化不定芽。

二、提问：对马铃薯脱毒苗的培养大致分几个阶段？各阶段是怎样操作的？马铃薯茎尖培养脱毒程序：①取材；②消毒；③接种；④培养基；⑤病毒鉴定。

影响脱毒效果的因素：外植体大小；茎尖所处部位；病毒种类及复合感染。

简述苹果花粉培养的过程。

①选取适期花蕾；②花蕾预处理和消毒；③诱导胚状体形成；④诱导生根；⑤移栽。

苹果的栽培管理过程中应注意哪几个问题？①育苗技术；②土壤改良；③施肥方法；④灌溉时期；⑤整形和修剪技术。

草莓无毒苗的繁殖程序分哪几步？草莓无毒苗的繁殖程序可以发为五步，即鉴定出无毒苗、原种种苗培养、原种种苗繁殖、良种种苗繁殖和生产用苗繁殖。

蝴蝶兰怎样用花梗组织培养方法繁殖?蝴蝶兰脱毒：花梗侧芽的消毒与培养——茎尖培养——原球茎诱导——继代培养——原球茎增殖——生根炼苗。

通过原球茎增殖的方法，可大大提高繁殖速度，实现蝴蝶兰生产的工厂化育苗。

香石竹的茎尖脱毒培养操作技术。

香石竹的茎尖脱毒培养操作技术：一般结合热处理：将带毒植株进行盆栽，放入人工控制箱内，采用38-40℃高温处理6-8周，再切1mm 大小的茎尖培养。

说明甘薯脱毒快繁技术的工艺流程。

（1）脱毒：优良品种母株选择；材料消毒；茎尖剥离；茎尖培养；茎尖苗的初级快繁；脱毒鉴定。

（2）快繁：脱毒苗的快繁；原原种的繁育；原种的繁育；种薯的繁育三、甘薯脱毒试管苗栽培管理注意哪些问题？培育壮苗；适当炼苗；精心移栽；控制湿、温、光等条件；适时定植；严防病虫害。

2、指示植物鉴定法：利用特定的易于感染某些 病毒的指示植物的特征进行病毒鉴定。
指示植物
CMV病毒感染的植株叶片
3、抗血清鉴定法：利用抗原和抗体的特异性反应原理 进行病毒鉴定。用已知病毒的抗血清（antiserum）鉴 定未知病毒。
近年来又在此基础上发展出酶联免疫法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA），方法是将抗 原固定在支持物上，加入待检血清，然后加入酶（过氧 化物酶或碱性磷酸酶）标记的抗体，使待检血清与对应 抗原的特异性抗体结合，最后用分光光度计进行诊断。
二、脱毒方法：
（一）茎尖分生组织培养脱毒： 1. 脱毒原理：病毒在植物体内的分布不均匀，越靠近
顶端区域，带毒越少，顶端分生组织（0.2-0.5 mm）不带 病毒或含病毒量极低。因此，分离分生组织细胞进行培 养，可以获得无病毒种苗。
2. 茎尖分生组织培养脱毒的基本程序：
一般包括培养基选择和制备、带脱毒材料的表面、灭 菌、茎尖分生组织分离、接种和培养、诱导芽分化和小 植株增殖、诱导生根、驯化移栽等环节。 茎尖分生组织的分离需要在超净工作台上借助体视显 微镜进行。茎尖放在培养皿内进行解剖，一只手用镊子 固定，另一手用解剖针将叶片和叶原基层层剥掉，当露 出半圆形顶端分生组织时，将分生组织切下，接种与培 养基上。
（四）其他脱毒方法：
1. 花器官培养脱毒：由植物的花器官培养脱分化形成愈伤 组织，然后再分化不定芽，可以获得无毒苗。如草莓花 药培养。 2. 珠心胚培养脱毒：柑橘类珠心胚与微管组织没有联系，一 般不带毒，可以利用珠心胚进行培养获得。
3.化学脱毒:采用病毒唑等试剂处理材料或添加到培养基中可 以钝化病毒，达到一定的脱毒效果。
（2）茎尖嫁接：在超净工作台上，将幼苗的上胚轴和子叶去掉， 根系截短，在离上胚轴顶端越0.5cm处斜向下切一深达木质 部，长2-3cm的切口，在斜切口末端横切一刀，用去掉切下 部分。在体视显微镜下，从待脱毒样品上切取0.2mm的茎尖 分生组织，小心放于切口的水平面上，切面向下并与砧木切 口形成层组织紧密贴合，然后接于培养基上。

植物组织培养脱毒快繁技术的综述李西雁（广西职业技术学院农业技术工程系2002级应用生物技术专业）摘要：脱除病毒是植物组织培养深入探讨研究中的一个技术难题。

本文结合在桂林莱茵生物科技股份有限公司的实践情况，简要介绍植物组织培养的基本原理和方法，综述植物脱除病毒的热处理、茎尖培养和抗病毒药剂三种方法的原理、发展史和技术方法，并介绍了几种常用的病毒检测方法。

本文以马铃薯为例，重点介绍了利用热处理加茎尖组织培养法获得马铃薯脱毒苗的具体技术方法，脱毒率可达100%。

同时还对植物组织培养脱毒快繁技术的应用前景作了分析。

关键词：茎尖培养，组织培养，快繁脱毒技术，病毒检测，应用前景1 植物组织培养研究概况1.1 研究简史自从1943年怀特（White）提出植物细胞“全能性”（Totipotency）学说及诸多后学者（Steward，1958，Guha和Marteshwari，1964）相继证实后，引发植物组织和细胞培养快繁技术的勃然兴起。

我国的专家学者在20世纪70年代后也在此领域做了大量的研究和开发工作，创造了很多新方法、新技术，提出不少新成果，开拓了植物组织培养快繁技术的新局面[1]。

目前采用组织培养脱病毒快繁及离体快繁生产株苗的技术已发展相当成熟[2]。

脱毒株苗具有无杂菌、适应能力较强、繁育较快、质量优、抗性好、分蘖性强、繁殖系数高、大批量生产、周年供应、便于运输等优点，已得到有关专家的鉴定及高度评价和种植试验区、种植产区果农的认可。

例如脱毒马铃薯、脱毒红薯、脱毒生姜、脱毒大蒜、脱毒草莓、脱毒苗木、脱毒花卉等等，已成为现代农民致富的新宠[2]。

1.2 植物组织培养和脱毒快繁的定义植物组织培养（Plant tissue culture）是指在无菌的条件下，将离体的植物（根、茎、叶、花、果实、种子等）、组织（形成层、花药组织、胚乳、皮层等）、细胞（体细胞和生殖细胞）以及原生质体，培养在人工配制的培养基上，给予适当的培养条件，使其长成完整的植株。

7.3 快速繁殖技术（micropropagation ） 快速繁殖技术（
3. 快繁的一般步骤：
③ 试管苗的壮苗与生根：
• 一般要分成单苗 ， 转移到盐浓度较低 、 不含细 一般要分成单苗， 转移到盐浓度较低、 胞分裂素， 含低浓度生长素的生根壮苗培养基， 胞分裂素 ， 含低浓度生长素的生根壮苗培养基 ， 至根、茎长到合适的长度，即可锻炼出瓶。 至根、茎长到合适的长度，即可锻炼出瓶。 • 问题：不易生根 （ 延长时间、 继代 ） ；易生根： 问题：不易生根（ 延长时间 、 继代） 壮苗阶段不加生长素， 壮苗阶段不加生长素 ， 试管外生根可减少费用； • 特殊方法：如马铃薯的小球茎法。 特殊方法：如马铃薯的小球茎法。
7.3 快速繁殖技术（micropropagation ） 快速繁殖技术（
4. 提高试管苗繁殖速度的措施：
① 选择合适的繁殖途径 ② 改良培养基： 激素 （腋芽 、 不定芽 、 胚状体 ） 等； 激素（ 腋芽、 不定芽、 胚状体） ③ 改良培养条件 ： 温 、光 、 湿度、 气体（有利气体、 湿度 、 气体 （ 有利气体、
7.1 茎尖培养
3. 茎尖培养技术： • 培养方法：固体培养、液体纸 桥培养（易愈伤化时）
7.1 茎尖培养
3. 茎尖培养技术： • 对培养基和培养条件的要求： • 一般可用MS培养基，加少量的生长素（不 用2,4-D）和细胞分裂素；GA3有时对抑制 愈伤等有一定的效果。
7.2 脱毒技术： 脱毒技术：
3. 茎尖培养技术： • 材料消毒：在温室种植或田间种植的健康植 株上取枝条，必要时母株可用杀菌剂处理； 在实验室切取2-3cm长的芽，去掉较大的叶 片，进行常规的表面灭菌；
7.1 茎尖培养
3. 茎尖培养技术： • 茎尖分离：将灭菌的芽置放有湿滤纸的无菌 培养皿中，置体视显微镜下，依次用镊子或 解剖刀剥去叶片直至露出生长点，用锋利的 解剖刀片把带或不带叶原基的分生组织切下 来，直接接种到培养基上；

5、试管苗的驯化与移栽
• 试管苗长出5~7片新叶时，把瓶子移入温室 中，即时可打开培养瓶，历时7d。把苗从 培养瓶中取出，洗净培养基，栽于经过干 热灭菌处理的蛭石内，盘上塑料薄膜罩严 ，置于阳光下，20 ℃，自然条件下锻炼 15d。移入土中。
小结：
形态特征和生物学习性
葡
选材接种
萄 的
葡萄的组织培养
培养基 苗分化
脱
根分化
毒 与
热处理脱毒
快
脱毒 茎尖培养脱毒
繁
无病毒苗的鉴定
脱毒与快繁
材料与消毒
培养条件
快繁 生长与分化
生根培养
试管苗的驯化与移栽
08生物教育 张磊蕾
3mm茎尖进行立体培养，即可获得脱毒苗。
MS+IAA 0.4mg/L+NAA 0.05mg/L
培养基中进行生根。
三、脱毒与快繁
（一）脱毒
葡萄受到26种病毒的危害,主要有卷叶 病毒、栓皮病毒、扇叶病毒、黄脉病毒和 斑点病毒等。由于病毒的危害，葡萄的长 势减弱，产量降低，果实的糖分含量减少， 风味变劣。
• 1、材料与消毒 • 取经过脱毒的枝条稍1~2cm，用5%的次
氯酸钠aq消毒2~3min，用无菌水冲洗3次， 再在0.1%升汞aq中浸泡2min，用无菌水冲 洗4次。把芽放在解剖镜下，无菌条件下， 去除幼叶和叶原基，使生长点暴露。用刀 切下含有1~2个叶原基，大小为0.2~0.3mm 的生长点接种于培养基上。
2、培养基：MS培养基，再添加6-BA 葡萄属落叶木质藤本植物，葡萄地上部分的茎细。
光照：1000lx，16小时
1～2mg/L
节6%上，具而有B卷5培须养，基可，愈向伤上N组攀织援A化。严A重，0茎.0尖生1长m不好g。 /L，LH100mg/L，蔗糖2%，琼

１ ２ 实验 方法 ．
２月份 时 ， 长约 ２ ￣４ ｍ 毛葡 萄 茎段 扦 插 于 实 验 室 沙 盆 中 ， 将 ０ ０ｃ 保持 沙 土湿 润 ， 长 出嫩 芽 ， ３ ５ 待 取 ～
ｃ 毛葡 萄嫩 芽作 为 外植体 进 行组 织 培养 ， ｍ 诱导 无 根试 管 苗 ， 取 无根 试管 苗 进行 脱 毒试 验 。 再 将 获得 的无 根试 管 苗接 种在 Ｂ ＋Ｂ ０ ５ｍｇ Ｌ ＡＡ ０ １ｍｇ Ｌ培 养基 中 ， 于光 照 培养 箱 内 （ ｓ Ａ ． ／ ＋Ｉ ． ／ 置 白天 ３ Ｃ处理 ８ｈ 光 照强 度 ４ ￣ ｌ ｍ ・ ＿， 上 ２ Ｃ处理 １ ） ７ｏ 、 ０／ ｍｏ ・ ｓ。 晚 ２。 ６ｈ 分别 进 行 变温 热处 理 ７ １ 、５ ２ 。 、 ０１ 、５ｄ
由广西 农业 科 学院 重点 实验 室用 分 子生 物学 检验 法 （ Ｔ—ｃ 检 验 毛葡 萄试 管 苗脱 毒 效果 。 Ｒ Ｐ Ｒ）
收 稿 日期 ：０ ８０ 一０ ２ ０ —４１
基金项 目： 国家 自然 科 学 基 金 项 目资 助 （０ ６ ０ ６ ３ ６０ ３ ）
通 讯 联 系 人 ： 贵 玉 （９ ３ ） 男 ， 石 １ ５一 ， 广西 百 色 人 ， 西 师 范 大 学 教 授 。Ｅ ｍａｌｇｓ ｉｙ １３ ｃｒ 广 — ｉ ｌ ｇ ＠ ６ ．ｏ ： ｈ ｎ
毛葡 萄脱 毒苗 的 技术 途 径和 植 株再 生 的较 佳 条 件 ， 以便 为 毛葡 萄建 立快 繁体 系 和 无病 毒 种 苗 的 工厂 化 生 产 提供 理论 依据 和 实验 基础 。
１ 材 料 与 方 法
１ １ 实验 材 料 ． 毛葡萄 Ｖｉｓ ｕｎ ｕ ｎ ｕａ ｉ Ｒ ｈ ｔ ｉｑ ａ ｇ ｌｒｓ ｅ ｄ品种 九龙 二号 （ ｉｑ 广西 罗城 水果 局提 供 ） 。

1、茎尖培养脱毒原理
病毒在植物体内分布不均匀，其数量随植株 部位及年龄而异，越靠近茎顶端区域，病毒感染 的程度越低，生长点即分生组织（约0.1-1mm） 几乎不含或含病毒很少。
分生组织不带病毒，可能有4方面的原因：
1、植物体病毒的移动主要靠2条途径：一是通过维管 系统，而分生组织中尚未形成维管系统；二是通过胞间连 丝，但这条途径病毒移动速度非常慢，赶不上茎尖和根尖 细胞不断分裂和活跃的生长速度。
二、脱毒方法
(一) 热处理脱毒
（一）发现： 1889年印度尼西亚爪畦人发现，患枯萎病的甘蔗(现证
明为病毒病)，放在50-52℃的热水中保持30min，甘蔗就可 去病生长良好。以后此方法被广泛用于防治许多植物的病 毒病。
热处理又称温治疗法。
• 1、热处理脱毒原理：
①病毒是DNA大分子，病毒进入植 物细胞后，随植物细胞DNA一起复制。 热处理并不能杀死细胞，只是钝化病毒 的活性，使病毒在植物体内增殖减缓或 增殖停止，而失去病毒的侵染能力。
把抗原-抗体的免疫反应于酶的催化反应相结合而发展 起来的一种综合性技术，灵敏度高，特异性强，发展最快 应用最广的方法。
原理：采用酶标记的特异抗体指示抗原-抗体的结合， 从而检测样品中的抗原定量测定法。
操作程序：将待检植物汁液注入酶联板（聚苯乙烯多 孔微量反应板）中，使抗原吸附在它的孔壁，加入酶(
过氧化物酶或碱性磷酸酶)标记的特异抗体，抗原 -抗体充分反应后，清洗，固相载体酶联板表面只留 下以酶标记的抗原-抗体复合物。加入酶嘚无色底物
葡萄扇叶病毒
苹果花叶病毒
（二）茎尖培养脱毒
1、茎尖培养脱毒原理 2、培养基 3、茎尖培养方法 4、影响微茎尖培养的因素
①外植体大小 ②培养条件 ③外植体的生理状态

葡萄脱毒快繁的技术流程同学们，今天咱们一起来了解一下葡萄脱毒快繁的技术流程，这可相当有趣呢！咱们得知道为啥要给葡萄脱毒。

就像我们人生病了要治病一样，葡萄也会受到病毒的侵害，如果不把这些病毒去掉，葡萄的生长和结果都会受到很大影响。

那葡萄脱毒快繁的第一步通常是选取健康的材料。

这就好比要盖一座好房子，得先选好结实的砖头。

科研人员会从没有感染病毒的葡萄植株上，选取合适的部分，比如茎尖或者芽。

选好材料后，接下来就是进行热处理啦。

这一步就像是给葡萄“洗个热水澡”，不过这个温度和时间可得控制好，要不然葡萄就“受不了”啦。

通过热处理，可以让一些病毒变得不那么活跃。

然后呢，就是进行茎尖培养。

把之前选取的茎尖或者芽放在特殊的培养基里，让它们慢慢生长。

这个培养基就像是葡萄宝宝的“营养大餐”，能提供它们生长所需的各种养分。

举个例子啊，假如培养基里缺少了某种重要的营养成分，那葡萄的茎尖可能就长不好，脱毒快繁的效果也就大打折扣了。

再往后，就是病毒检测的环节。

这一步特别重要，就像老师检查我们的作业一样，要看看葡萄是不是真的把病毒去掉了。

如果还有病毒残留，那可不行，还得重新再来。

确定没有病毒后，就可以进行快速繁殖啦。

这时候会用到一些技术手段，比如组织培养，让一个健康的葡萄芽或者茎尖变成好多好多的小葡萄苗。

在整个过程中，环境的控制也非常关键。

温度、湿度、光照都得恰到好处。

比如说，如果温度太低，葡萄苗生长得就会很慢；如果湿度不合适，可能会导致葡萄苗生病。

操作人员还得特别细心和耐心。

就像照顾小宝宝一样，时刻关注着葡萄苗的生长情况，稍有不对劲，就得赶紧想办法解决。

当葡萄苗长得足够强壮，就可以移栽到地里啦。

这就像是孩子们长大了要离开家一样，不过在移栽后，也还得继续照顾它们，确保它们能茁壮成长。

葡萄脱毒快繁的技术流程可不简单，每一个步骤都需要精心操作和严格控制。

但是通过这样的技术，我们能够得到健康、优质的葡萄苗，为葡萄的种植和生产带来更好的保障。

05
茎尖培养脱毒技术的发展前景
技术创新与改进
自动化与智能化
通过引入机器人和人工智能技术 ，实现茎尖培养脱毒技术的自动 化和智能化，提高工作效率和准 确性。
高效快速繁殖
研究更高效的繁殖方法，缩短培 养周期，提高脱毒苗的繁殖速度 ，以满足大规模生产的需求。
基因编辑技术
利用基因编辑技术对植物进行精 确的基因改造，提高茎尖培养脱 毒技术的成功率和应用范围。
《茎尖培养脱毒技术》PPT 课件
目录
• 茎尖培养脱毒技术简介 • 茎尖培养脱毒技术的操作流程 • 茎尖培养脱毒技术的优缺点 • 茎尖培养脱毒技术的应用实例 • 茎尖培养脱毒技术的发展前景
01
茎尖培养脱毒技术简介
茎尖培养脱毒技术的定义
茎尖培养脱毒技术是一种利用植物组织培养技术，对植物的茎尖 进行离体培养，诱导产生无病毒的植株，进而实现脱除病毒的目 的。
降低技术难度
简化操作步骤，降低对操作人员的技 术要求。
增强遗传稳定性
研究如何减少茎尖培养脱毒技术获得 的植株在遗传上的变异，提高其后代 的稳定性。
扩大适用范围
进一步探索该技术在更多种类的植物 上的应用，以扩大其适用范围。
04
茎尖培养脱毒技术的应用实例
在马铃薯脱毒中的应用
总结词
茎尖培养脱毒技术在马铃薯脱毒中应用广泛，有效解决了马铃薯病毒病问题，提高了马铃薯产量和品 质。
详细描述
除了马铃薯和草莓，茎尖培养脱毒技术还可应用于其他作物的脱毒处理，如甘蔗、葡萄 、花卉等。该技术的应用能够提高这些作物的抗病性和产量，改善品质，为农业生产和 园艺产业的发展提供有力支持。随着科学技术的不断进步和应用领域的拓展，茎尖培养
脱毒技术将继续发挥重要作用，为农业和园艺产业的可持续发展做出贡献。

茎尖培养脱毒法概述茎尖培养脱毒就是采取茎尖分生组织离体培养的方法获取无病毒试管苗，其方法是在解剖镜下，用锋利的解剖刀进行迅速准确地茎尖剥离，因为茎尖分生组织基本不带病毒，利用植物茎尖分生组织进行离体培养，再结合病毒检测，就可以获得无病毒的植株。

茎尖培养中最主要的影响因素就是切取茎尖的大小，一般要求茎尖长度小于1mm。

技术上通常切取茎尖越小，脱毒效果越好，但是茎尖培养成活率变低。

曹为玉等研究发现葡萄茎尖长度与存活率成正相关，与脱毒率成反相关。

当切取茎尖长度为0.2~0.3mm时，存活率为21%~38%，脱毒率为91.4%~97%；当切取0.5mm以上时，存活率为75%~83%，脱毒率仅为70.6%~76.5%。

茎尖培养脱毒法脱毒率高，脱毒速度快，能在较短的时间内得到较多的原种繁殖材料，但这种方法存在的缺点是植物的存活率低。

为了克服这一缺点，现在经常是将茎尖培养与热处理相结合来使用。

茎尖培养与热处理相结合之所以能够提高脱毒效果，是由于热处理可使植物生长本身所具有的顶端免疫区得以扩大，有利于切取较大的茎尖（在1mm左右），从而能够提高培养或嫁接的成活率。

如大樱桃置于45℃的恒温培养室内，培养35天，再切取0.2~0.4mm的茎尖培养，平均脱毒率为98%。

原理茎尖培养脱毒的原理是植物体内病毒靠维管束系统移动，分生组织中没有维管束存在，病毒只靠胞间连丝移动，速度很慢，难以追上生长活跃的分生组织，所以旺盛生长的根尖、茎尖一般都无病毒或很少有病毒分布。

Shoot tip culture of virus-free method OverviewShoot tip culture of virus-free is to take tip meristem in vitro culture methods to obtain virus-free in vitro, and its approach is endoscopic anatomy, with a sharp scalpel to the tip to divest quickly and accurately as meristem tip basic non-virus, use of plant shoot tip meristem culture in vitro, combined with virus detection, it can be virus-free plants.Shoot tip culture in the most important factor is the impact of the cut tip size, tip length is less than the general requirements of 1mm. Technical tip is usually the smaller the cut, the effect of virus-free as possible, but low survival rate of shoot tip culture. Yu Cao, such as for the study found that grape shoot tip length was positively correlated with survival, and virus-free rate as the anti-related. When the cut tip length of 0.2 ~ 0.3mm, the survival rate was 21% ~ 38%, virus-free rate was 91.4% ~ 97%; when cut more than 0.5mm, the survival rate was 75% ~ 83%, virus-free rate only 70.6% ~ 76.5%.Shoot tip culture of the high rate of virus-free method of virus-free, virus-free high speed in a short period of time most of the original species of breeding material,but the existence of the shortcomings of this approach is the low survival rate of plants. In order to overcome this shortcoming, the tip is now often a combination of training and heat treatment to use. Shoot tip culture with a combination of heat treatment have been able to increase the detoxification effect of plant growth as a result of heat treatment can have their own area of the top of the expansion of immunization and is conducive to a larger cut of the tip (in 1mm or so) in order to improve the training or graft survival rate. Such as Cherry thermostat at 45 ℃for indoor training, training for 35 days, and then cut 0.2 ~ 0.4mm of shoot tip culture, with an average rate of 98% virus-free.PrincipleShoot tip culture is the principle of detoxification plant vascular system by mobile viruses, sub-vascular Health Organization does not exist, the virus only plasmodesma moving very slow, it is difficult to catch up with the growth of active meristematic tissue, so strong root growth, shoot tip is generally little or no virus, the virus distribution.。

茎尖培养脱毒
茎尖培养脱毒是一种植物组织培养技术，用于去除植物中的病毒，以获得无病毒的健康植株。

该技术的基本原理是利用植物茎尖生长点的分生组织具有较高的分裂能力和较低的病毒感染率的特点，将茎尖组织切下并进行培养，使其分化成新的植株。

在培养过程中，病毒无法复制，从而达到脱毒的目的。

茎尖培养脱毒的具体步骤如下：
1. 选择健康的植株：选择生长健康、无病虫害的植株作为培养材料。

2. 消毒处理：将植株进行消毒处理，以避免外部病菌的污染。

3. 切取茎尖：用解剖刀或显微镜下的微切割工具切取植株的茎尖生长点。

4. 培养茎尖：将切取的茎尖组织放在适宜的培养基上进行培养，提供适当的营养和环境条件，促使其分化成新的植株。

5. 鉴定和筛选：对培养出的植株进行病毒检测，筛选出无病毒的健康植株。

茎尖培养脱毒技术已广泛应用于果树、蔬菜、花卉等植物的脱毒和育种工作中，是一种有效的植物病毒防治方法。

摘
要： 以状元红葡 萄为材料 ， 选取秋季 副梢的茎尖 为外植体 ， 通过直 接诱 导丛生 芽进行快速 繁殖 ， 同时运
用热处理和茎尖培养相结合诱导葡萄脱毒苗 。脱毒技术研究结果表明 ， １ ／ ２ Ｍ Ｓ培养基 比 ＭＳ培养基的芽诱导 率高。适宜的启动培养基为 １ ／ ２ ＭＳ＋ ２ ． ０ ｍ ｇ － Ｌ ６ 一 Ｂ Ａ＋ ０ ， １ ｍ ｇ ・ Ｌ～Ｉ Ｂ Ａ， 诱 导效果最好 。无 根苗接 种于 １ ／ ２ ＭＳ＋ ０ ． ５ ｍｇ ・ Ｌ Ｉ Ｂ Ａ＋ ０ ． ２ ｍ ｇ ・ Ｌ Ｎ Ａ Ａ的培养基 中， 生根快 ， 不定根发育 良好 ， 利 于移栽 。其 中热处理时 间 以１ ０ ｄ为宜 ， 这样有利 于无根苗 的生长和脱毒 ； 经过热处理的无根苗 ， 脱毒率达 １ ０ ０ ％。 关键词 ： 葡萄； 茎尖 ； 脱毒 ； 快繁 中图分 类号 ： Ｓ ６ ６ ３ ． １ 文献标 志码 ： Ａ 文章编号 ： １ ０ ０ ４ — １ ５ ２ ４ （ ２ ０ １ ４ ） ０ １ － ０ ０ ７ ２ － － ０ ５
Ｓｔ ｕｄ ｙ ｏ ｎ ｖ ｉ ｒ ｕｓ － ｆ ｒ ｅ ｅ ａｎ ｄ ｒ ａ ｐｉ ｄ ｐｒ ｏ ｐａ ｇ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎｉ ｑ ｕｅ ｓ ｏ ｆ Ｚｈｕａ ｎ ｇ ｙ ｕａ ｎｈ ｏｎ ｇ ｇ ｒ ａ ｐｅ
Ｙ Ａ Ｎ Ｇ Ｇ ｕ ａ ｎ ｇ ， Ｊ Ｉ Ｎ Ｇ ｕ ｉ — ｈ ｕ ａ ， Ｄ Ｏ Ｎ Ｇ Ｊ ｕ ｎ ， Ｚ Ｈ Ａ Ｎ Ｇ Ｑ ｉ ｎ ｇ ， Ｇ Ｏ Ｎ Ｇ Ｎ ａ （ Ｒ ｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ Ｈ ｏ ｒ ｔ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ Ｂ ｒ ａ ｎ ｃ ｈ ， Ｌ ｉ ａ ｏ ｎ ｉ ｎ ｇ Ａ ｃ ａ ｄ ｅ ｍ ｙ ｏ ｆＡ ｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ｓ ， Ｓ ｈ ｅ ｎ ｙ ａ ｎ ｇ １ １ ０ １ ６ １ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）

微嫁接要求的剥离技术高，嫁接成活率与接 穗大小呈正相关，而脱毒率与接穗大小呈负相关
三、实验材料、药品与仪器
实验材料：选取已经脱毒的百脉根无毒
苗组织 药品：（预先配置的培养基） MS+1mg/L 6-BA+3%蔗糖+0.8%琼脂 pH 5.7
仪器：紫外超净工作台
四、操作步骤
1. 培养基的制备与高压灭菌 2. 接种 3. 观察记录实验现象与结果
3、珠心组织培养脱毒法 病毒是通过维管组织传播，而珠心组 织和维管束系统无直接联系，故可以通过 珠心组织离体培养获得无病毒植株。 缺点： 会有20%~30%左右的变异率，同时无毒 苗苗期较长。
（三）微体嫁接离体培养脱毒法
把极小的茎尖作为接穗嫁接到实生砧木上， 然后将嫁接后的砧木接种到新的培养基上培养。 接穗在砧木的饲喂下很容易成活。
（2）热空气处理脱毒法
试验母株在高温生长室中生长一段时 间，其顶端分生组织比次生分生组织生长 迅速，后切取其茎尖分生组织进行离体培 养。 生长室温度35—40℃ 光照3000—10000 lx
3、热处理的局限性
（1）并非所有病毒对热处理都敏感。一般热 处理只对等径、线状病毒和类菌质体起作用。 （2）延长热处理时间，病毒钝化效果好，同 时也可能会钝化植物组织中的抗性因子而降低 处理效果。
优缺点：
茎尖越小，去病毒机会越大，脱毒效果 就越好，但同时因为其含营养及水量太低， 故培养时对培养基的要求就越高，对剥离技 术要求也越高。
2、愈伤组织培养脱毒法 （1）原理及依据 a、病毒在植物体内分布不均匀 b、病毒复制的能力衰退或丢失 c、继代培养的愈伤组织产生抗性变异
（2）技术关键 诱导再生植株的愈伤组织 （3）操作程序 植物各种器官或组织诱导产生出愈伤组织， 愈伤组织多次继代，然后从愈伤组织再诱导分 化芽，长成植株。 愈伤组织培养脱毒法脱毒效果不定，常出 现一些变异。

鉴定方法：
抗原的制备 →→抗血清的采收，分离→→ 把稀释的抗血清与未知的病毒植物的汁液在小 试管内混合→→根据沉淀反应来鉴定病毒种类。
植物无病毒苗的培育
3. 特点：
特异性高（这种抗血清是高度专一 性的试剂），测定速度快，一般几小时甚 至几分钟就可以完成。所以抗血清法成为 植物病毒鉴定中最有用的方法之一。
葡萄扇叶病毒
苹果花叶病毒
（二）茎尖培养脱毒
1、茎尖培养脱毒原理 2、培养基 3、茎尖培养方法 4、影响微茎尖培养的因素
①外植体大小 ②培养条件 ③外植体的生理状态
植物的去病毒技术，实质上就是采取不含 病毒颗粒或病毒颗粒含量甚少的0.1～0.5mm 带1～2个叶原基的茎尖作为外植体，进行微繁 殖，使其培养成完整的无病毒小植株的技术。
1、茎尖培养脱毒原理
病毒在植物体内分布不均匀，其数量随植株 部位及年龄而异，越靠近茎顶端区域，病毒感染 的程度越低，生长点即分生组织（约0.1-1mm） 几乎不含或含病毒很少。
分生组织不带病毒，可能有4方面的原因：
1、植物体病毒的移动主要靠2条途径：一是通过维管 系统，而分生组织中尚未形成维管系统；二是通过胞间连 丝，但这条途径病毒移动速度非常慢，赶不上茎尖和根尖 细胞不断分裂和活跃的生长速度。
活，并加快分裂和生长。
A
B
C
低 温 生长区
热处理区 高 温
寄主无损伤
病原微生物被消除 寄主被杀死
2、热处理脱毒方法
(1)温汤浸渍处理 (2)热空气处理
（1）. 温汤浸渍处理 适用：休眠器官、剪下的接穗或种植的
材料
方法：50℃左右的温水中浸渍10min
至数小时
特点：方法简便易行，但易使材料受伤。

• 有性生殖退化、仅用无性繁殖方法繁殖的 植物，极易受病毒病的侵染。
• 大多植物病毒不经种子传播（专化性强的 病毒除外）。
• 病毒在生长旺盛的部位繁殖速度慢.
三、传统的植物脱毒技术简介
• 物理方法：X射线、紫外线、超短波、高温 热处理等
– 原理：钝化病毒，从而达到抑制病毒蔓延的目 的。
• 化学方法：采用化学抑制剂，干扰病毒在 植物体内的复制。
第一节 植物脱毒（virus elimination)培养
一、概念 • 利用植物组织培养技术，脱除植物细胞
中的病毒，生产健康的繁殖材料。
二、植物病毒病简介
• 定义：由植物病毒寄生引起的病害。
• 症状：
– ①变色，叶片的叶绿素形成受阻或积聚，从而产 生花叶、斑点、环斑、脉带和黄化等。花朵的花 青素也可因而改变,使花色变成绿色或杂色等,常 见的症状为深绿与浅绿相间的花叶症如烟草花叶 病。
ISEM
• 脱毒苗的保存与快速繁殖
• 脱毒苗的离体保存与繁殖，建立脱毒种苗 生产繁殖网络体系，木本植物建立隔离的 脱毒苗母本园。
Proliferation medium
Rooting medium
六、植物脱毒培养的意义
• 能够有效地保持优良品种的特性； • 生产无病毒种苗，防止品种退化； • 快速繁殖新品种，使优良品种迅速应用； • 节约耕地，提高农产品的商品率；
五、脱毒植物的鉴定方法
指示植物 (test plants)鉴定——利用病毒在其他植 物上出现症状的特征，作为鉴别种类的标准。这种 专用以产生症状的（寄主）植物就是指示植物。寄 主植物能够辨别某种病毒的专化性症状。 方法：将待测植物的汁液接种到指示植物，如果 待测植株带毒，则指示植物上会出现特定症状。 由于病毒的寄生范围不同，所以应根据不同的病 毒选择适合的指示植物。