下载文档原格式
第1节大肠杆菌的培养和分离一、培养基的配置：我们用牛肉膏蛋白胨培养基来培养大肠杆菌。
配置1000ml的培养基（可由教师在实验前配置好，也可由学生分小组后在实验课上操作）。
1、配方：牛肉膏 5g蛋白胨 10gNacl 5g琼脂 20g2、称量：准确称取各成分。
3、溶化：加热熔化，用蒸馏水定容到1000mL。
整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。
4、调pH：用1mol/L NaOH溶液调节pH至7.0——7.2。
5、灭菌：将配置好的培养基转移到锥形瓶中，加上棉塞，包上牛皮纸，用皮筋勒紧，集中放入高压灭菌锅内，121摄氏度、100千帕压力下灭菌15min。
5——8套培养皿用旧报纸包作一包，于干热灭菌锅内160——170℃条件下灭菌2小时。
6、倒平板：灭菌后，待固体培养基冷却至50℃左右时在酒精灯火焰附近操作进行。
其过程是：①将灭过菌的培养皿放在火焰旁，右手拿装有培养基的三角瓶，左手拔出棉塞；②右手拿三角瓶，使三角瓶的瓶口迅速通过火焰；③用左手将培养皿打开一条稍大于三角瓶口的缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖；④待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。
倒过来放置的目的是防止培养基冷却过程中形成的水滴落到培养基表面。
向培养皿中转移已灭菌的培养基时，也不要把培养基沾在皿壁上。
否则，空气中杂菌会在这些粘附培养基上繁殖，并污染皿内培养基。
二、大肠杆菌的接种、培养：1、接种常用的方法有平板划线法和稀释涂布平板法。
（1）平板划线法：①操作步骤：将培养皿底部用拇指和无名指固定成倾斜状态，在火焰旁将培养皿稍微打开。
在此同时，用环状接种针在火焰旁取少许菌悬液，迅速送入培养皿内，在平板培养基的一边，作第1次平行划线 3～5条，转动培养皿约70°角，用烧过冷却的接种针，通过第1次划线部分作第2次平行划线，然后再用同样方法，通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。
实验1 大肠杆菌的培养和别离高二年级班学号：实验日期：____月日【知识准备】1．背景知识：大肠杆菌〔Escherichia coli，E.coli〕是微生物学和遗传学常用的实验材料，为单细胞原核生物，宽约0.5×1～3微米；具有由肽聚糖组成的细胞壁；周身具鞭毛，能运动。
大肠杆菌是在人和动物肠道中生活的、不会致病的正常栖居菌，但假设进入胆囊、膀胱等处也会引起炎症。
它能利用多种糖类物质产酸、产气，其代谢类型为异养兼性厌氧型；其代谢活动能产生大肠杆菌素〔抑制肠道内其他分解蛋白质的微生物生长〕，还能合成维生素B和K。
它们在肠道中大量繁殖，几乎占粪便干重的1/3。
实验室中用于培养微生物的营养物质称为培养基。
按培养基的物理状态可分为：液体培养基和固体培养基。
将已知的菌种引入新配制的培养基的过程称为接种。
而在固体培养基外表用蘸有菌种的接种环连续划线，既可以到达接种的目的，又可以实现别离菌种的目的。
这是因为划线过程中接种环与培养基外表接触，接种环上的菌液逐渐减少，因此划线最后部分细菌间的距离加大，经过培养后可出现由单个细菌细胞形成单菌落，这样就到达了别离细菌的目的。
2．实验原理：使用通用的细菌培养基〔如LB液体培养基〕可扩大培养大肠杆菌，使大肠杆菌迅速扩增。
在LB固体平面培养基上对大肠杆菌进行划线别离，经培养后培养基上每一个菌体会形成一个单独的菌落。
这是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选突变菌株的最简便方法之一。
为保证配制的培养基上只生长大肠杆菌，而不被其他微生物污染，实验过程中要进行无菌操作。
3．思考题〔1〕为什么培养过程中会出现被其他微生物污染的现象？〔2〕进行了无菌操作是否肯定就不会出现被其他微生物污染的现象吗？〔3〕本实验的关键步骤——划线别离的目的是什么？〔4〕在做第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线?在操作过程中应注意什么？【实验目的】1．利用液体培养基进行大肠杆菌的扩增2．用固体平面培养基进行大肠杆菌的划线别离3．了解微生物实验的操作原理和培养条件【材料用具】大肠杆菌菌种装有固体培养基的、已灭菌培养皿；装有LB液体培养基的、已灭菌的250ml三角瓶封口膜和橡皮圈酒精灯接种环镊子装有酒精棉球的广口瓶恒温培养箱摇床【操作流程】灭菌、消毒划线、接种培养、观察【实验步骤】1．接种前的准备进行接种操作前，应先洗手，再用70%的酒精棉球擦拭双手和桌面。
![[配套K12]2017-2018年高中生物 第1部分 微生物的利用 实验1 大肠杆菌的培养和分离学案](https://img.taocdn.com/s1/m/988f90107375a417866f8ff3.png)
实验1 大肠杆菌的培养和分离一、大肠杆菌 1．大肠杆菌是革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌。
2．在肠道中，大肠杆菌一般对人无害，但也有一些菌株可以侵袭肠黏膜并产生毒素，任何大肠杆菌如果进入人的泌尿系统，都会对人体产生危害。
3．大肠杆菌是基因工程技术中被广泛采用的工具。
二、实验内容1．本实验的内容是将大肠杆菌扩大培养和划线分离。
分离后，一个菌体便会形成一个菌落，这是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。
2．本实验用LB 液体培养基(通用的细菌培养基)扩大培养大肠杆菌。
培养后再在LB 固体平面培养基上划线进行分离，随后培养基上便会形成一个个单独的菌落。
三、细菌的培养和分离1．细菌以分裂的方式繁殖，分裂速度很快，约20分钟分裂一次。
人们在培养细菌时，一般用接种环转移带菌的培养物。
接种时，先将接种环在明火上烧红后冷却，再操作。
2．细菌的分离(1)划线分离法：在液体培养基中，只要接种后培养8 h ，每毫升培养基中就有几亿个细菌。
可用接种环蘸菌液在含有固体培养基的培养皿平板上划线，在划线过程中接种环上的菌液逐渐减少，因此，划线到最后，可使细菌间的距离加大。
在固体培养基培养10～20 h 后，可由一个细菌产生单菌落，菌落不会重叠。
如果再将每个菌落分别接种至含有固体培养基的试管斜面上，在斜面上划线，则每个斜面的菌群就是由一个细菌产生的后代。
这种方法也可用于分离细菌，将污染的杂菌除去。
接种环在取菌种前和划线前都要灼烧、而后都要冷却、操作完毕后又要灼烧的原因是什么？【提示】取菌种前灼烧接种环的目的是消灭接种环上的微生物；除第一次划线外，其余划线前都要灼烧接种环的目的是消灭接种环上残留菌种；取菌种和划线前都要求接种环冷却后进行，目的是防止高温杀死菌种；最后灼烧接种环的目的是防止细菌污染环境和操作者。
(2)涂布分离法：先将培养的菌液稀释，通常稀释10－5～10－7倍，然后取0.1 mL不同稀释度的稀释菌液加在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基平面上进行培养，在适当的稀释度下，可产生相互分开的菌落。
学业达标测评 ( 一)大肠杆菌的培育和分别1．要从多种细菌中分别某种细菌，培育基要用()A．固体培育基B．液体培育基C．加青霉素的培育基D．加入高浓度食盐的培育基【分析】分别微生物应使用固体培育基。
【答案】A2．涂布平板操作需要用到()A．接种环、滴管、酒精灯B．接种环、移液管、酒精灯C．涂布器、移液管、酒精灯D．涂布器、接种环、酒精灯【分析】涂布平板操作过程中不需要接种环。
【答案】C3．采纳干热灭菌、灼烧灭菌、高压蒸汽灭菌、紫外线照耀等几种方法，可分别杀死哪些部位的杂菌()A．接种环、吸管、培育基、接种室B．吸管、接种环、培育基、接种箱C．培育基、接种环、吸管、接种箱D．培育皿、吸管、培育基、双手【分析】干热灭菌主要对玻璃器皿进行灭菌，紫外线主要对接种室和接种箱进行空气和表面灭菌。
【答案】B4．以下操作错误的选项是()A．用酒精擦抹双手B．用氯气消毒水源C．实验室用紫外线进行消毒D．玻璃器皿 ( 吸管、培育皿 ) 用酒精直接擦抹即可达到完全灭菌的目的【分析】玻璃器皿应用干热无菌箱在160～170 ℃加热 1～ 2 h 才能达到无菌目的。
【答案】D5．在涂布平板操作时错误的选项是()A．将涂布器在酒精灯火焰上灼烧，直到烧红B．取少许菌液滴加在培育基表面C．将沾有少许酒精的涂布器在火焰上引燃待酒精燃尽后，冷却8～ 10 s再用D．涂布时可转动培育皿，使涂布平均【分析】涂布平板所用涂布器是玻璃器皿，不可以在酒精灯火焰上灼烧，不然会变形，正确方法是沾取少许酒精，引燃。
【答案】A6．利用涂布分别法纯化的大肠杆菌，经培育后发现培育基上出现了多种菌落，不行能的原由是 ()A．培育基制备过程中被杂菌污染B．接种过程中，无菌操作不切合要求C．系列稀释时，无菌操作不切合要求D．由大肠杆菌的种类不一样造成的【分析】大肠杆菌培育基中出现了多种菌落，说明污染了杂菌，杂菌可能来自培育基，也可能是由于操作过程中无菌操作不切合要求。
实验1 大肠杆菌的培养和分离【学习目标】1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作。
2.进行大肠杆菌的分离，用固体平面培养基进行细菌的化纤培养。
3.说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原理。
【教学重点】大肠杆菌的划线分离；大肠杆菌的无菌操作和灭菌技术；大肠杆菌的特点及实验室应注意的安全事项。
【教学难点】大肠杆菌的划线分离；大肠杆菌实验的无菌操作技术及实验室安全事项的解读。
【实验教材分析】本节内容选自浙科版生物选修1第1部分实验1大肠杆菌的分离和培养。
本次课程主要包括了本次实验的目的、大肠杆菌的特点、无菌操作和灭菌的方法、仪器设备和实验材料、实验步骤等内容。
在前一节介绍了实验室规则和生物技术概况的基础上，进行具体的实验操作。
并且经过生物必修三册书本的学习，学生已经掌握了一定的细菌的相关知识，并对一些特殊细菌的筛选和鉴别有了一定的了解。
故本次实验教学既是对学生前面学的理论知识的深化，同时也为学生将要学到的分离以尿素为氮源的微生物等内容奠定了比较重要的基础。
因此，本节课起着承前启后的重要作用。
【学情分析】本节课的教授对象是选了选修1这门课的高二学生，在实验前，学生已经学习过了革兰氏阳性菌与阴性菌的相关知识，本次实验主要是学生在掌握细菌的相关知识后学习大肠杆菌的分离与鉴定，很好地实现了将所学知识与实践相联系，易引起学生的兴趣，学生的积极性较高，从而有利于实验教学的展开。
但学生对于实验原理、实验方法和实验技术等方面还不熟悉，需要教师对此进行详细的讲解，在讲解过程中注意运用适宜的教学方法，引导学生将所学知识运用到具体的实验实践中。
同时，教师需严格要求学生在操作上符合实验室规范，将实验操作过程中的注意事项对学生进行逐一说明，保证实验的有序性与安全性。
【实验教学过程】（一）创设情境，导入新知【教师活动】教师展示饮用水净化、消毒灭菌、检测、出品的简略过程，抛出在检测这一过程中主要是以某一微生物作为指标来进行检测，从而引出本次实验的材料—大肠杆菌（展示图片）。
高中生物第一部分《实验一大肠杆菌的培养和分离》学案1 浙科版选修1微生物的利用大肠杆菌的培养和分离学案一、课标内容：进行微生物的分离和培养二、教学要求：基本要求1，进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作。
2，进行大肠杆菌的分离，用固体平面培养基进行细菌的划线培养。
发展要求说明大肠杆菌培养的条件和实验原理。
说明实验2和实验3不作要求。
三、知识要点：1、微生物是指结构、形体的细胞、细胞或细胞结构的生物，如。
绝大多数微生物与传染病无关，对人类，有多种用途。
2、细菌是单细胞的生物，从形态上分为菌、菌、菌（弧菌）。
细菌结构上，有，无，只有一环状。
有些细菌外有荚膜和鞭毛。
有些细菌在不良的环境条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做。
当环境适宜时，休眠体又可以萌发，形成一个细菌。
细菌繁殖方式: 繁殖，速度很快。
单个细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做。
他是的重要依据。
细菌在基因工程中应用广泛，可为其提供载体，也可作为细胞。
细菌用革兰氏染色法分为革兰氏菌和菌两大类，区别在的成分不同。
大肠杆菌是革兰氏、厌氧的肠道菌。
3、培养基按物理状态分：培养基、培养基、培养基。
其中液体培养基常用于，半固体培养基可观察微生物的，固体培养基用于。
细菌扩大培养要用培养基，细菌分离要用培养基。
细菌的分离方法有两种：和。
是消除的通用方法，也是用于高表达量菌株的最简便方法之一。
划线分离法，方法；涂布分离法，单菌落，但操作。
不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方，细菌，霉菌。
通常细菌培养基要用和提取物来配制，还要加入一定的，以维持一定的渗透压；霉菌培养基一般用配制或豆芽汁即可。
尽管培养基的配方各不相同，但一般都含有、、和等营养物质。
另外还需要满足微生物生长对、、等的要求。
如细菌需要环境，霉菌需要环境；厌氧生物需要控制含量。
有的还需要在培养基中加入特殊营养物质。
4、在培养微生物时，必须进行。
实验1 大肠杆菌的培养和分离一、大肠杆菌 1．大肠杆菌是革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌。
2．在肠道中，大肠杆菌一般对人无害，但也有一些菌株可以侵袭肠黏膜并产生毒素，任何大肠杆菌如果进入人的泌尿系统，都会对人体产生危害。
3．大肠杆菌是基因工程技术中被广泛采用的工具。
二、实验内容1．本实验的内容是将大肠杆菌扩大培养和划线分离。
分离后，一个菌体便会形成一个菌落，这是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。
2．本实验用LB 液体培养基(通用的细菌培养基)扩大培养大肠杆菌。
培养后再在LB 固体平面培养基上划线进行分离，随后培养基上便会形成一个个单独的菌落。
三、细菌的培养和分离1．细菌以分裂的方式繁殖，分裂速度很快，约20分钟分裂一次。
人们在培养细菌时，一般用接种环转移带菌的培养物。
接种时，先将接种环在明火上烧红后冷却，再操作。
2．细菌的分离(1)划线分离法：在液体培养基中，只要接种后培养8 h ，每毫升培养基中就有几亿个细菌。
可用接种环蘸菌液在含有固体培养基的培养皿平板上划线，在划线过程中接种环上的菌液逐渐减少，因此，划线到最后，可使细菌间的距离加大。
在固体培养基培养10～20 h 后，可由一个细菌产生单菌落，菌落不会重叠。
如果再将每个菌落分别接种至含有固体培养基的试管斜面上，在斜面上划线，则每个斜面的菌群就是由一个细菌产生的后代。
这种方法也可用于分离细菌，将污染的杂菌除去。
接种环在取菌种前和划线前都要灼烧、而后都要冷却、操作完毕后又要灼烧的原因是什么？【提示】取菌种前灼烧接种环的目的是消灭接种环上的微生物；除第一次划线外，其余划线前都要灼烧接种环的目的是消灭接种环上残留菌种；取菌种和划线前都要求接种环冷却后进行，目的是防止高温杀死菌种；最后灼烧接种环的目的是防止细菌污染环境和操作者。
(2)涂布分离法：先将培养的菌液稀释，通常稀释10－5～10－7倍，然后取0.1 mL不同稀释度的稀释菌液加在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基平面上进行培养，在适当的稀释度下，可产生相互分开的菌落。
通常每个培养皿有20个以内的单菌落最为适合。
将每个菌落分别接种在斜面上扩增培养后，再做功能性实验。
细菌的两种分离法各有优点，都可采用。
划线分离法，方法简单；涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂些。
四、灭菌操作1．各种器皿必须是无菌的：实验用具用牛皮纸或报纸包好，所有容器都先封口，然后进行高压蒸汽灭菌(1 kg/cm2压力、121 ℃、15 min)处理，并在超净台上使用。
注意：实验中所需棉花不能用脱脂棉，因为脱脂棉易吸水。
2．各种培养基必须是无菌的。
3．细菌转移过程要避免杂菌污染和菌种外泄。
注意：培养皿需倒置，防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基，冲散菌落。
五、大肠杆菌培养与分离的实验步骤1．在两个250 mL三角瓶中分别装入50 mL LB液体培养基和50 mL LB固体培养基，加上封口膜。
将培养皿包好，连同培养基一同灭菌15 min。
2．灭菌后待培养基冷却至60 ℃时，关闭紫外灯，点燃酒精灯，并用酒精棉球擦拭桌面和实验者的手。
在酒精灯火焰旁用右手持盛有固体培养基的三角瓶，左手拿培养皿，并将培养基倒入4个培养皿中，将培养皿置于水平位置上，待其凝固。
为什么要在酒精灯火焰旁进行操作？【提示】酒精灯火焰旁约10 cm的空间是一个无菌区，在酒精灯火焰旁操作能防止杂菌污染。
3．扩大培养先将接种环在酒精灯火焰上烧红，再深入到大肠杆菌斜面，使环冷却后，取菌体，并将菌体放入三角瓶液体培养基中，封瓶后在37 ℃每分钟200转的摇床上振荡培养12 h。
4．划线分离用在酒精灯火焰上灼烧后的接种环深入到摇床上培养后的菌液中，然后在固体培养基的平板上连续划线，接种环需蘸菌液1次，划线后盖好皿盖，将培养皿倒置，在37 ℃，恒温培养箱中培养12～24 h后，可在划线的末端出现不连续的单个菌落，表明菌已被分离。
5. 在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在斜面上，37 ℃培养24 h 后，置于4 ℃冰箱中保存。
1.(1)培养基：①概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，此即培养基。
②作用：在提供主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质及O2的需求，如培养乳酸杆菌时需在培养基中添加维生素，培养霉菌时需将pH调至酸性，培养厌氧型微生物需给予无氧条件等。
(2)培养基的种类进行微生物培养获得纯净培养物的关键是防止杂菌污染，无菌技术即围绕着如何避免杂菌的污染展开，主要包括以下几个方面：(1)对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。
(2)将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。
(3)为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。
(4)实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。
3．消毒和灭菌的比较基、灭菌、接种及培养、菌落观察计数。
请回答与此实验相关的问题。
(1)制备培养基：根据物理性质的不同，可以将培养基分为液体、半固体和固体培养基。
对细菌进行大量的扩增，用________培养基进行培养；对细菌进行分离，用________培养基进行培养。
(2)灭菌：在培养微生物时必须进行无菌操作，包括各种________都必须是无菌的。
对它们进行灭菌，通常用________法灭菌。
(3)接种及培养：接种时常用的工具是________和玻璃三角刮刀。
为了尽快观察到细菌培养的实验结果，应将接种了湖水样品的平板置于________中培养，培养的温度设定在37 ℃。
要使该实验所得结果可靠，还应该同时在另一平板上接种________作为对照进行实验。
(4)菌落观察计数：培养20小时后，观察到平板上有形态和颜色不同的菌落，这说明湖水样品中有________种细菌。
一般说来，菌落总数越多，湖水遭受细菌污染的程度越________。
(5)选择培养基是在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长。
如果提高培养基中NaCl的浓度，可以用于筛选耐________细菌。
【思路点拨】(1)细菌扩大培养用液体培养基，分离用固体培养基。
(2)无菌操作包括所有的器皿要无菌，所有的培养基要无菌，接种过程要防止杂菌污染。
实验室中常用高压蒸汽灭菌法。
(3)接种时常用接种环，用恒温培养箱保持温度。
在实验过程中，除实验变量以外的其他各变量应适宜且相同，以利于更好地实现实验目的。
(4)不同的菌落具有各自不同的菌落特征(如硬度、颜色、透明度、光滑度等。
)(5)选择培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。
【答案】 (1)液体 固体平面 (2)器皿和培养基 高压蒸汽灭菌 (3)接种环 恒温培养箱 无菌水 (4)多 高 (5)盐(或NaCl)1．细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、用酒精棉球擦试、火焰灼烧等几种不同的处理，这些方法依次用于杀灭哪些部位的杂菌( )A ．接种环、手、培养基B ．高压锅、手、接种环C ．培养基、手、接种环D ．接种环、手、高压锅【解析】 此题考查对无菌技术的掌握。
高压蒸汽灭菌锅是灭菌的一个设备，通常用于培养基的灭菌。
用酒精擦拭双手是消毒的一种方法。
火焰灼烧，可以迅速彻底地灭菌，适用于微生物接种工具的灭菌，如接种环。
【答案】 C1.LB (1)计算：根据LB 培养基配方的比例，计算配制50 mL 的培养基时各种成分的用量。
(2)称量：准确地称取各种成分。
即：蛋白胨0.5 g 、酵母提取物0.25 g 、氯化钠0.5 g ，加水50 mL 。
(如配LB 固体培养基，则再加1 g 琼脂)(3)制备空白斜面：将LB 液体培养基配好，加入琼脂并加热使之融化后，通过玻璃漏斗加入试管中，每试管 2 mL ，加棉塞并将试管捆在一起，上端加盖一张牛皮纸，灭菌。
灭菌后斜靠于平放的铅笔上，冷却后即成空白斜面培养基。
2．进行大肠杆菌培养与分离操作(1)灭菌⎭⎪⎬⎪⎫250 mL 三角瓶甲 →50 mL LB 液体培养基250 mL 三角瓶乙→50 mL LB 固体培养基尚未凝固牛皮纸包好的培养皿置于灭菌锅1 kg 压力灭菌15 min (2)制备LB 固体平面培养基——倒平板操作 待培养基冷却至60 ℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。
倒平板的具体操作描述如下：(3)扩大培养①左手持大肠杆菌斜面和有液体培养基的三角瓶，右手拿接种环并用无名指、小指夹住斜面的棉塞和三角瓶封口膜。
②将接种环在火焰上烧红，再深入到斜面，使其冷却后取菌体。
③将菌体放入三角瓶液体培养基中(将封口膜及斜面棉塞复原)。
④三角瓶在37 ℃摇床振荡培养12 h。
(4)划线分离①取种在酒精灯火焰上灼烧接种环，将上述培养后的菌液打开，接种环部分深入到菌液中取种。
②平板划线操作在LB固体培养基的平板上连续划线(如下图所示)，划线后盖好培养皿。
③培养将上述划线操作后的培养皿倒置放至37 ℃恒温培养箱中培养12～24 h，可看到划线的末端出现不连续的单个菌落，表明菌已被分离。
(5)菌种纯化与保藏在无菌操作下，将单菌落用接种环取出，再用划线法接种至斜面上，37 ℃培养24 h后，4 ℃冰箱保存即可。
划线的目的是将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面，以期在连续划线后，可以分离到由单个细胞繁殖而来的子细胞群体(菌落)，从而达到纯化菌种的目的，为此，在划线操作时，接种环只需在菌液中蘸取菌液一次，且作第二次及其以后的划线操作时，须从上一次划线的末端划线——如此可使菌体数量随划线次数的增加而减少，并逐步分散，最终实现在平板上得到单菌落的目的。
下图为“大肠杆菌的培养和分离”实验的基本流程：A.灭菌→B.倒平板→C.接种和培养液体培养基→D.划线分离和培养→E.菌种保存请回答：(1)灭菌常用________法，灭菌后，要待________________时才能打开锅盖。
(2)倒平板和接种前要用________擦手。
接种和划线前使用________的方法对接种环灭菌。
(3)划线分离时，接种环在菌液中蘸取________次。
下图甲表示在平板培养基上的第一次和第二次划线，请在乙图中画出第三次划线。
(4)划线后在恒温培养箱中培养时，培养皿须倒置，目的是__________________。
(5)实验完成后，接触过细菌的器皿应如何处理？____________________。
【思路点拨】此题考查大肠杆菌的培养和分离过程，具体分析如下：(1)灭菌是指对LB液体培养基和LB固体培养基进行的灭菌。
对培养基进行的灭菌应该是用灭菌锅进行高压蒸汽灭菌。
灭菌后，灭菌锅内的压力与大气压相同时，才能打开灭菌锅，否则会造成培养液溅出。
(2)在进行实验操作时，操作者的双手要用酒精棉球擦拭消毒，接种环要用火焰烧灼灭菌。
