汉恒-自噬及其研究方法第三版

自噬研究方法工具汇总---BIO-RAD细胞自噬细胞自噬（autophagy）是依赖溶酶体途径对胞质蛋白和细胞器进行降解的一种过程。

这个过程可以清除功能异常的细胞器、细胞内病原体以及再循环细胞组分。

尽管自噬最早被发现是应答饥饿，现在发现自噬受到各种胁迫信号的诱导，基础水平的自噬有利于细胞内稳态的维持.很多因素包括激素刺激的天然免疫信号及能量耗尽或高温等引起的物理胁迫会诱导自噬上调。

相反，很多疾病如癌症、传染性疾病和神经退行性疾病及衰老和自噬的下调都有关联。

自噬主要有三种信号通路:●Microautophagy小自噬通过溶酶体的膜内陷“吞入”目标分子，起到降解细胞质中小体积物质的作用.这个过程研究得不是很清楚,膜内陷相关的GTPaseVps1p蛋白和自噬相关蛋白(Atg)参与其中。

● 分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediatedautophagy,CMA）直接将细胞质蛋白带到溶酶体。

带KFERQ—序列的蛋白质和热休克蛋白Hsc70及其它分子伴侣相互作用形成的复合体和溶酶体膜上的Lamp-2A受体结合后，导致Lamp—2A 聚合引发复合体中的底物易位穿越溶酶体膜.● Macroautophagy大自噬被研究得最多,可以降解更大量的胞浆物质，由特殊的细胞器自噬小体介导。

大自噬起始于吞噬泡装配点(PAS）的形成和Unc51—likekinase (Ulk)复合体的组装,这启动了自噬小体的形成(图1）。

接着是成核阶段，Ulk复合物与由beclin—1、Vps15、Vps34、Atg14组成classIII PI3K 复合物相互作用形成吞噬泡。

接着吞噬泡膜扩展形成自噬小体，在这个过程中Atg12/5/16复合物促成了磷脂酰乙醇胺（PE）和LC3(酵母中是Atg8）的偶联，这是自噬小体膜唯一已知的标志物。

PE-LC3偶联物在几个关键步骤中起作用：自噬泡膜的扩展、自噬体的识别及自噬溶酶体的形成。

整个过程涉及30多个自噬相关基因（Atg蛋白），包括Beclin-1、溶酶体相关膜蛋白(Lamp—1 and Lamp—2)和微管相关蛋白1A/1Blight chains 3A/B （MAP1LC3A/B 或简称LC3)，这些都是自噬常见的标志物.最后一步，完全形成的自噬小体与溶酶体融合释放内含的物质被降解。

自噬双标腺病毒〔mRFP-GFP-LC3〕使用指南背景：自噬是细胞内的一种“自食〔Self-eating〕〞的现象，凋亡是“自杀〔Self-killing〕〞的现象，二者共用相同的刺激因素和调节蛋白，但是诱发阈值和门槛不同，如何转换和协调目前还不清楚. 自噬是指膜〔目前来源还有争议，大部分表现为双层膜，有时多层或单层〕包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体，最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳态和细胞器的更新。

目前文献对自噬过程进行观察和检测常用的策略和手段有：通过western blot检测LC3的剪切；通过电镜观测自噬体的形成；在荧光显微镜下采用GFP〔-RFP〕-LC3等融合蛋白来示踪自噬体形成以与降解。

近几年对自噬流的研究日趋增多，针对于此我们汉恒生物科技〔XX〕XX自主研发了用于实时监测自噬(流)的mRFP-GFP-LC3腺病毒，mRFP 用于标记与追踪LC3，GFP的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP 荧光发生淬灭,此时只能检测到红色荧光。

这种串联的荧光蛋白表达载体系统直观清晰的指示了细胞自噬流的水平，是我们自噬研究尤其是自噬流研究不可或缺的利器。

mRFP-GFP-LC3腺病毒的操作收到病毒后的处理〔一〕、腺病毒的储存1、腺病毒采用冰袋运输。

〔1〕、收到病毒液后如未融化请置于-80℃冰箱，下次使用时再进行分装；〔2〕、如客户收到时腺病毒已融化，请直接分装后置于-80℃冰箱保存；若短期内用于实验，可分装部分于4℃保存〔尽量一周内用完〕。

2、尽量避免反复冻融，否则会降低病毒滴度〔每次冻融会降低病毒滴度10%〕。

建议不要在-20℃下长期保存。

如果病毒储存时间超过6个月，应该重新测定病毒滴度。

3、建议收到病毒产品后根据实验需求自行分装或购买经过分装的小包装病毒产品〔购买时请提出〕。

MDC:取12 mg粉末溶于720 nl DMSO使其浓度为50 mmol/L,分装后-20冰箱保存。

临用前用MEM稀释到终浓度50 umol/L;Rapamycin:用MEM培养基配成终浓度为1 umol/L,现用现配;400ng/ml喹乙醇:称取4 mg喹乙醇,DMSO预溶(体积<0.1%)后加入10 ml MEM培养液至完全溶解,现用现配,避光保存;3-MA:首先用PBS溶解粉末,临用前加热至完全溶解后再加入MEM培养基至终浓度10mmol/L; PI3K抑制剂（3-MA，Wortmannin）可干扰或阻断自噬体的形成用RAPAMYCIN诱导自噬我也查过一部分文献，有用无血清的，也有用，一般培养基的，浓度从25nM到100nM都有，用的是50nM的雷帕霉素，加入一般的培养基中，目的是排除无血清所诱导出来的自噬。

文献说饥饿初期激活的是大分子自噬，在4-6小时活力达到最大，24h后以CMA途径为主Earle's balanced salts solution (EBSS) for 48 hsigma的EBSS，货号E2888，有碳酸氢钠，有酚红的，酚红到不是很必须，只是一个PH指示作用，好看些无血清诱导自噬：EBSS 诱导6个小时就可以了。

EBSS一定可以诱导出来，只是需要说明的是时间点的设置，因为从饥饿诱导开始半个小时就可能开始自噬了，一直到24小时都持续，所以应该设置不同的时间点观察这个作用。

另外一个很大的问题是，饥饿诱导的一个很大的弊端是细胞死亡，这也是我面临的问题，就是在细胞收养的时候蛋白浓度太小了。

24小时就很少了，更不要说48小时和72小时了Hank's诱导，也就是通常所说的饥饿诱导，细胞培养到对数生长期后以Hank's替代常规完全培养基，3h后就可诱导出自噬。

我用Hank's诱导了3h后电镜观察有30%细胞都有自噬这种现象，但不如国外报道的高。

自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3）使用指南背景：自噬是细胞内的一种“自食（Self-eating）”的现象，凋亡是“自杀（Self-killing）”的现象，二者共用相同的刺激因素和调节蛋白，但是诱发阈值和门槛不同，如何转换和协调目前还不清楚. 自噬是指膜（目前来源还有争议，大部分表现为双层膜，有时多层或单层）包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体，最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳态和细胞器的更新。

目前文献对自噬过程进行观察和检测常用的策略和手段有：通过western blot检测LC3的剪切；通过电镜观测自噬体的形成；在荧光显微镜下采用GFP（-RFP）-LC3等融合蛋白来示踪自噬体形成以及降解。

近几年对自噬流的研究日趋增多，针对于此我们汉恒生物科技（上海）有限公司自主研发了用于实时监测自噬(流)的mRFP-GFP-LC3腺病毒，mRFP 用于标记及追踪LC3，GFP的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP 荧光发生淬灭,此时只能检测到红色荧光。

这种串联的荧光蛋白表达载体系统直观清晰的指示了细胞自噬流的水平，是我们自噬研究尤其是自噬流研究不可或缺的利器。

mRFP-GFP-LC3腺病毒的操作收到病毒后的处理（一）、腺病毒的储存1、腺病毒采用冰袋运输。

（1）、收到病毒液后如未融化请置于-80℃冰箱，下次使用时再进行分装；（2）、如客户收到时腺病毒已融化，请直接分装后置于-80℃冰箱保存；若短期内用于实验，可分装部分于4℃保存（尽量一周内用完）。

2、尽量避免反复冻融，否则会降低病毒滴度（每次冻融会降低病毒滴度10%）。

建议不要在-20℃下长期保存。

如果病毒储存时间超过6个月，应该重新测定病毒滴度。

3、建议收到病毒产品后根据实验需求自行分装或购买经过分装的小包装病毒产品（购买时请提出）。

自噬的抑制2009-06-07 18:33:44 来源:未知根据自噬形成的过程，自噬的抑制也分为不同的阶段，包括自噬的起始阶段，自噬泡和溶酶体融合阶段，以及溶酶体内的降解阶段。

目前常用的一些抑制药物如下：（1）对自噬体形成的抑制：主要是PI3K通路的抑制剂（如3-MA, Wortmannin，LY294002等），这些药物均可干扰或阻断自噬体形成。

3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine, 3-MA）是磷脂酰肌醇3激酶的抑制剂，可特异性阻断Autophagy中自噬体的形成，被广泛用作Autophagy的抑制剂。

另外，渥曼青霉素（Wortmannin）、LY294002 也可用作Autophagy的抑制剂。

（2）对自噬体与溶酶体融合的抑制：对自噬体与溶酶体融合过程进行阻断也能起着抑制自噬的作用，这些药物有巴伐洛霉素A1、长春碱、诺考达唑等。

巴伐洛霉素A1（Bafilomycin A1）是一种来源于灰色链霉菌的大环内酯类抗生素，分子式C35H58O9，是空泡型H+-ATP酶的特异性抑制剂，具有抗菌、抗真菌、抗肿瘤等作用。

当突触小泡经历胞外分泌时，巴伐洛霉素A1可以避免小泡重新酸化。

有研究表明，在已发生自噬的肿瘤细胞中加入巴伐洛霉素A1，可使蛋白降解被抑制，自噬体增多而自噬溶酶体数目减少，并且自噬体中的酸性磷酸酶的活性也明显降低，从而证明其阻断了自噬体与溶酶体的融合过程。

这种阻断是可逆的，在去除了药物作用后，自噬体仍可以与溶酶体融合形成自噬溶酶体，继续自噬进程。

（3）对溶酶体降解的抑制: 自噬体与溶酶体融合后最终被溶酶体中的水解酶水解，它首先经过囊泡酸化，达到所需的PH值后经多种蛋白酶作用使囊内容物降解，降解产物在细胞内再循环利用。

对溶酶体的降解进行抑制，使得被降解的囊泡内容物大量蓄积于溶酶体内，而不能释放出来进入细胞内再循环利用，这也同样起着抑制自噬的作用。

因此，蛋白酶抑制剂，如E64d、Pepstatin A等，在抑制溶酶体降解的过程中发挥着自噬抑制剂的作用。

自噬的热点研究方法及步骤自噬作为时下的研究热点，有非常深远的研究意义。

一、自噬病毒工具1）GFP-LC3单荧光自噬指示病毒系统GFP-LC3病毒系统可高效感染目的细胞，表达GFP-LC3，感染感染后细胞可在荧光显微镜下实时观察自噬的整体水平；由于电镜耗时长，不利于监测（Monitoring）自噬形成。

我们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了GFP-LC3指示技术：无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。

汉恒生物已开发出高效的评价用GFP-LC3病毒载体，通过瞬时高效感染细胞，配合活细胞工作站成功评价自噬流。

2）mRFP-GFP-LC3双荧光自噬指示病毒系统表达mRFP-GFP-LC3 融合蛋白的病毒产品。

mRFP 用于标记及追踪LC3，GFP 的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP 荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP 荧光发生淬灭,此时只能检测到红色荧光。

已多种双荧光病毒系统提供，具体如下：a）mRFP-GFP-LC3腺病毒系统——可高效感染目的细胞，表达mRFP-GFP-LC3，感染后细胞可在荧光显微镜下实时观察自噬发生过程；b）mRFP-GFP-LC3慢病毒系统——可以稳定表达持续检测细胞的自噬流检测；c）mRFP-GFP-LC3腺相关病毒（AAV）系统——最有效的在体自噬流检测工具；二、自噬检测以及整体服务1）自噬检测服务常规自噬检测服务包括western blot检测细胞自噬的水平，优惠提供自噬常规抗体LC3、p62以及beclin1等，我们的研究团队长期为客户提供自噬技术服务，有丰富的自噬研究经验，我们的优势是周期短，质量高；a）利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成。

第49卷第5期兰州大学学报（自然科学版）Vol.49No.5文章编号:0455-2059(2013)05-0693-07线粒体自噬的研究方法张迎梅,邱倩,漆永梅兰州大学生命科学学院,兰州730000摘要:线粒体自噬是一种选择性清除多余或受损线粒体的自噬过程,在调节细胞内线粒体数量和维持线粒体正常功能等方面发挥重要作用,并涉及诸多生理和病理学过程.有关线粒体自噬的研究报道始于21世纪初,近年来发展十分迅速.目前,研究线粒体自噬的方法众多,各有利弊,但没有一种检测手段可以独立说明线粒体自噬的发生或反映线粒体自噬的活性.本文旨在对目前有关线粒体自噬的研究方法与技术及其优缺点等方面做一总结,供线粒体自噬研究者参考.关键词:线粒体自噬;线粒体自噬体;线粒体自噬溶酶体;检测方法中图分类号:Q5;Q2;Q95文献标识码:AMethods in studying mitophagyZHANG Ying-mei,QIU Qian,QI Yong-meiSchool of Life Sciences,Lanzhou University,Lanzhou730000,ChinaAbstract:Mitophagy,the selective removal of dysfunctional mitochondria by autophagy,is an important mitochondrial quality control and function stabilizing mechanism which has been implicated in many different physiological and pathological processes.The research on mitophagy was begun in the beginning of this century with rapid development.However,numerous methods in mitophagy research have some shortcomings and there are still no effective or standard methods for monitoring or assessing mitophagy.This review aims to show those current techniques and methods with their advantages and disadvantages in the study of mitophagy.Key words:mitophagy;mitophagosomes;mitolysosomes;detection method线粒体是真核细胞进行生物氧化和能量转换的重要场所,涉及细胞内稳态、增殖、能动性、衰老和死亡等多种生物学过程[1].线粒体因其DNA 缺乏组蛋白的保护且修复机制不健全而易受外源或自身代谢产生的自由基(Reactive oxygen species, ROS)的攻击或因其他胁迫而发生损伤[2],线粒体受损后发生膜通透性转变(Mitochondrial perme-ability transition,MPT),氧化磷酸化解耦联,ATP 过度消耗引发细胞坏死,或者线粒体肿胀后细胞色素c释放到细胞质触发凋亡[3].适时清除受损线粒体以保持其数量和质量的稳定对于细胞正常生长和代谢具有非常重要的意义[4−5].线粒体自噬是一种选择性清除受损线粒体的特异性自噬现象[6−7],根据线粒体自噬过程的特征,可将其分为4个时期[8]:1)前期线粒体受损后发生通透性转变,导致线粒体去极化,诱导线粒体自噬相关蛋白活化[9];2)早期自噬体包裹受损线粒体,形成线粒体自噬体(Mitophagosomes)[10];3)中期线粒体自噬体与溶酶体融合后形成成熟的线粒体自噬溶酶体(Mitolysosomes)[11];4)末期线粒体被溶酶体降解.以上各期特点如图1所示.线粒体自噬除了介导受损或者多余线粒体的降解,对网织红细胞成熟过程及受精后精子来源的线粒体清除有重要意义[12−13],与局部缺血或药物诱导的组织损伤以及许多神经退行性疾病和癌症的发生发展也密切相关[14],因此有关线粒体自噬的问题越来越受到学者们的关注.目前研究线粒体自噬及其活性的方法主要包括以下3种类型:MP线粒体自噬体(Mitophagosomes);ML线粒体自噬溶酶体(Mitolysosomes);∆Ψm线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential)图1线粒体自噬过程的4个时期Figure1Four stages of mitophagy1)通过电子显微镜或荧光显微镜直接观察线粒体自噬体的结构或线粒体自噬的动态过程;2)通过流式细胞术检测线粒体膜电位、线粒体总量及免疫印迹技术检测线粒体自噬相关蛋白表达量的变化等方法间接反映线粒体自噬活性;3)通过人为对线粒体自噬通路进行实验性调节来全面评价线粒体自噬对细胞或机体形态和功能的影响.本文就目前线粒体自噬不同时期的研究方法和技术及其优缺点等方面综述如下,供线粒体自噬研究者参考.1电子显微镜技术自20世纪50年代比利时科学家Duve[15]在溶酶体的研究中通过电镜第一次观察到自噬现象至今,透射电镜技术(Transmission electron mi-croscopy,TEM)始终被认为是研究自噬发生的最直接、最可靠的手段.线粒体自噬早期形成的线粒体自噬体可以通过线粒体特有的双层膜、嵴等特征辨别,而其与溶酶体融合形成的线粒体自噬溶酶体仅能通过单层膜或消化后的残留物来大体识别[14](表1b).尽管如此,电镜技术也受到诸多因素的影响,获得的结果存在很大的变性,如因切片等人为因素造成的膜结构的改变,其他双层膜细胞器的干扰或者低电子密度空泡的误导等[16].因此,常规的透射电镜观察方法仅能对完整的线粒体自噬体进行观察,由于选取细胞数量有限,无法反映自噬活性,在定量分析中存在很大的不足.近年来,免疫金电镜技术开始用于自噬的定量分析,在线粒体自噬的研究中,利用线粒体蛋白如Tom20, CypD等和自噬体标记蛋白的抗体共定位标记线粒体自噬体,通过测量自噬囊泡面积对其进行定量分析,结合其他检测方法可反映线粒体自噬的活性变化[17−18].2荧光显微镜技术电镜观察线粒体亚结构的变化及线粒体自噬体的形成,仅能初步证明线粒体自噬是否发生,但不充分,还需要进一步结合线粒体与自噬体及溶酶体共定位的方法才能证明线粒体自噬是否发生.通过特异性荧光标记的手段,利用荧光显微镜技术,可进行线粒体溶酶体的荧光共定位观察.目前,用于线粒体自噬荧光标记的方法主要有3种:荧光标记基因转染技术、荧光探针标记技术及自噬相关蛋白免疫荧光技术.2.1荧光标记基因转染技术将自噬体和线粒体特异性蛋白的基因与天然荧光蛋白基因连接起来构成融合基因,导入细胞内表达,借助荧光显微镜对标记蛋白进行细胞内活体跟踪,可对线粒体和自噬体进行共定位分析. Gottlieb等[19]利用发射红色荧光且定位于线粒体的融合蛋白基因pDsRed2-mito与GFP-LC3联合转染细胞,进行线粒体和自噬体的共定位,通过去卷积运算及3维立体重构技术得到自噬体包裹线粒体的3维结构图,可直观反映线粒体自噬体的形成及其结构.但此方法仅适用于线粒体自噬早期的检测,无法反映其末期的降解情况.而另一种融合蛋白基因mKeima稳定表达一种在酸性和中性条件下分别发射红色和绿色荧光的天然蛋白,可用于线粒体自噬体和线粒体自噬溶酶体的定性和定量分析[20].Katayama等[21]通过将COX VⅢ的前导肽序列与mKeima串联起来构成一种融合基因mt-mKeima,使其所表达的Keima蛋白定位于线粒体基质,当线粒体自噬体与酸性溶酶体融合后Keima蛋白的荧光信号由绿色转为红色,荧光信号的转换可定量反映线粒体自噬的活性[8](图2和表1f).但是,长时间激发光照射对转染细胞样品的荧光强度有较大影响,而且溶酶体酶活力和胞浆的酸化程度也会影响到荧光信号的检测.a正常未处理的神经细胞中,只有少数的线粒体呈酸性状态;b诱导线粒体自噬后,大量线粒体酸化图2转染mito-Keima的神经细胞中Keima蛋白的荧光变化[8]Figure2Neurons transfected mito-Keima showing the change of Keima2.2荧光探针标记技术利用线粒体和溶酶体特异性染色技术也可对线粒体和自噬体进行共定位.在培养细胞中可利用线粒体特异性荧光探针TMRM(Tetramethylrho-damine methylester),MitoTracker 和溶酶体特异性荧光探针LysoTracker 染色并结合自噬体的荧光标记技术来追踪线粒体自噬的动态过程.MitoTracker ,LysoTracker 也可用于固定细胞的线粒体和溶酶体染色[22].线粒体去极化(Mitochon-drial depolarization)是线粒体自噬前期的重要事件[9],可利用线粒体膜电位依赖性荧光探针TMRM ,MFFR(Mitofluor far red)、罗丹明123(Rhodamine 123)或JC-1(5,5′,6,6′-Tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide)染色后通过流式细胞术或荧光显微镜技术检测.但这些染料的荧光强度随膜电位降低而减弱,因此无法进行细胞固定后检测.另外,非培养条件下线粒体膜电位也会有所变化,因此染色后必须尽快完成后续表1线粒体自噬各期的检测方法[23−24]Table 1Detection methods on different stages of mitophagy时期检测指标原理检测方法分析与评价早期线粒体自噬EM 结果变性较大,不适于做定量体直接观察分析,仅作定性参考线粒体和自噬FM 直接反映自噬体包裹线粒体的体荧光共定位事实,但无法说明线粒体自噬末期的降解情况末期线粒体总量检测−FC 可快速检测线粒体总量的改变,但荧光极易淬灭线粒体蛋白表达量检测−IB定量分析的高效方法,但线粒体自噬特异性蛋白的选择尚有疑问mtDNA 定性和FM 线粒体总量变化受多种因素影响,定量分析FC仅依靠mtDNA 降解程度难以反映线粒体自噬活性情况MP 线粒体自噬体(Mitophagosomes),ML 线粒体自噬溶酶体(Mitolysosomes),Ψm 线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential),EM 电子显微镜技术(Electron microscopy),FM 荧光显微镜技术(Fluorescence microscopy),IF 免疫荧光技术(Immunofluorescence),IB 免疫印迹技术(Immunoblotting),FC 流式细胞技术(Flow cytometry),TMRM 四甲基罗丹明甲酯(Tetramethylrhodamine methylester),MTG 线粒体示踪绿(MitoTracker green),LTR 溶酶体示踪红(LysoTracker red).检测.MitoTracker是一种持久的线粒体特异性荧光探针,可被活细胞摄取和累积,较之传统的线粒体荧光探针TMRM等,其荧光不依赖膜电位而变化,仅需一个温和的共价巯基结合于线粒体蛋白并在线粒体去极化后仍保持不变[25].MitoTracker 具有多个颜色的变体,可结合其他荧光标记手段选择所需荧光色彩进行双染或者三联染色,如LC3-GFP,MTR(MitoTracker red)联合标记(表1c),用于线粒体自噬体的定位[14].LysoTracker是一种偏酸性的胺类荧光探针,可用于对活细胞内的酸性区室(如溶酶体、内吞体、自噬体等)染色示踪,其敏感度极高,并可在乙醛固定后稳定保持[26],也有多个荧光色彩的变体可选.但是这种探针作为溶酶体非特异性的探针不能单独用于线粒体自噬的分析,必须与其他的方法相结合,如LTR(LysoTracker red)与MTG(MitoTracker green)联合染色(表1d),用于线粒体自噬体与溶酶体融合的共定位[27]. TMRM,MTG两种荧光染料均可在极化的线粒体中蓄积,TMRM可以通过荧光共振能量转移使MTG荧光淬灭,单独发红色荧光.但当线粒体去极化后,TMRM被释放,MTG发出绿色荧光,聚集在细胞核周围[28].因此,用TMRM,MTG联合染色可特异性标记新的去极化线粒体(表1a).当对细胞同时进行TMRM,MTG,LTR染色时,可以通过荧光显微镜观察去极化的线粒体是否与溶酶体融合,亦即是否发生了线粒体自噬[25]. Kim等[29]利用发蓝色荧光的MFFR代替TMRM,联合GFP-LC3及LTR在线粒体动态监测中可更方便地观察线粒体自噬的动态变化过程.此外,荧光探针标记技术也可与荧光标记的线粒体自噬标志蛋白基因转染技术结合来示踪线粒体自噬[30]. 2.3免疫荧光技术在固定细胞中,选用线粒体和溶酶体特异性蛋白的抗体对线粒体自噬体和线粒体自噬溶酶体进行免疫荧光标记,如溶酶体膜蛋白LAMP-1或LAMP-2,线粒体基质蛋白Hsp60和CypD(表1e),线粒体膜蛋白VDAC1,Tom20等.然而,线粒体自噬并非受损线粒体蛋白的唯一降解方式,研究者发现许多线粒体外膜及膜间隙蛋白的降解是由Parkin依赖性的泛素蛋白酶系统介导的,还有一部分线粒体外膜蛋白在Parkin的介导下逃逸至内质网以躲避降解[31],而大多数的线粒体内膜蛋白及基质蛋白的降解则是由Parkin依赖性的线粒体自噬介导的,但其具体机制还不清楚[32].因此,同时选用CypD,Hsp60等线粒体基质蛋白或者内膜蛋白的抗体进行免疫荧光标记来检测线粒体自噬可能会更严谨.除了通过线粒体溶酶体的共定位来说明线粒体自噬之外,也可以通过线粒体DNA(mtDNA)的降解来反映线粒体自噬的活性.线粒体中ROS的累积可导致mtDNA的突变,并进一步诱导线粒体自噬.PicoGreen是一种可穿透线粒体膜,对mtDNA进行特异性标记的荧光探针,通过免疫荧光技术检测PicoGreen的荧光信号强度可反映mtDNA的降解程度[33].PicoGreen也可用于活细胞染色,Kim等[10]利用PicoGreen,TM-RM和LTR对来源于野生型小鼠的肝脏细胞线粒体自噬过程中mtDNA的降解进行监测(表1g).3免疫印迹技术免疫印迹技术(Immunoblotting,IB)可用于线粒体自噬的定量分析,通过检测线粒体蛋白的表达量变化可反映末期线粒体总量(Mitochondrial mass)的改变,从而间接反映线粒体自噬的活性.通常选线粒体基质蛋白Hsp60,CypD,线粒体膜蛋白VDAC1,Tom20等,但考虑到不同线粒体蛋白降解过程的线粒体自噬依赖性的不同[32],最好分别选取线粒体内外膜蛋白、基质与膜间隙蛋白,从而全面反映线粒体总量的变化.在酵母线粒体自噬的定量分析中用GFP标记的线粒体外膜蛋白基因GFP-Om45转染细胞,线粒体自噬过程中Om45降解,释放出游离的GFP可稳定存在,通过免疫印迹检测GFP的含量即可定量分析线粒体自噬的活性[34],但由于哺乳动物细胞溶酶体酸性状态可使GFP快速降解,此方法不适用其线粒体自噬的检测.此外,通过标准比色法检测柠檬酸合酶的活力也可以反映线粒体的总量[35].介导线粒体自噬的一些特异性蛋白的稳定性、表达量及活性的变化也可以通过免疫印迹技术来分析,进而定量地反映线粒体自噬的发生及其活性.如在PINK1/Parkin介导的线粒体自噬途径中, PINK1在正常条件下以线粒体膜电位依赖性的方式被蛋白水解酶快速降解,而线粒体去极化能使其稳定,并在线粒体膜上累积聚集[30,36],进而通过磷酸化Parkin使之从细胞质向功能紊乱的线粒体上募集[37],以介导线粒体自噬性的降解.另外,低氧条件下,NIX表达量的显著上升和FUNDC1的去磷酸化[38−39],也可介导线粒体自噬的发生.4流式细胞技术流式细胞技术(Flow cytometry,FC)作为单细胞定量分析和分选的手段,在线粒体自噬的检测中被广泛应用.通过流式细胞技术定量检测TMRM、罗丹明123或JC-1染色后线粒体荧光强度的变化可反映线粒体的损伤程度.线粒体自噬性降解会导致细胞内线粒体总量的减少[8]. Zhang等[40]在网织红细胞成熟过程线粒体自噬清除的研究中,利用线粒体特异荧光探针MTG对线粒体染色后通过流式细胞技术检测荧光总量来反映末期线粒体总量的变化.而Yoshii等[32]通过流式细胞技术检测稳定表达GFP标记的线粒体外膜蛋白GFP-Omp25的Parkin野生型MEFs细胞经CCCP(Carbonyl cyanide3-chlorophenyl hydra-zone)处理诱导线粒体自噬,发现GFP-Omp的含量在线粒体自噬诱导后随时间的延长而降低,也可反映线粒体自噬的活性.但以线粒体的总量变化来反映其自噬活性的方法必须联合其他检测手段才能说明线粒体自噬.5线粒体自噬的诱导与抑制在线粒体自噬对机体或细胞的行为和效应分子影响的研究中,一般通过人为干预的方式来诱导或抑制线粒体自噬,方法主要包括药物处理、物理损伤、饥饿及线粒体自噬基因敲除、沉默或过表达等.有关线粒体自噬的分子途径和功能研究中,常用线粒体的解偶联剂CCCP和FCCP(Carbonyl cyanide4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)作为诱导剂,引发细胞内全部线粒体短时间内剧烈的去极化及线粒体自噬的发生,但这两种诱导剂也可造成细胞骨架的破坏及溶酶体酸化的抑制,因此,实验中也会用到如K+载体缬氨霉素(Valino-mycin)、抗霉素A(Antimycin A)等一些比较温和的诱导药物[41].此外,饥饿和光照辐射也可以诱导部分线粒体发生自噬[10,22,29].在表达KillerRed-d Mito(一种光敏蛋白,定位于线粒体基质)的Parkin 野生型细胞中,通过光照辐射激发KillerRed发射荧光,可导致ROS的急剧增加,诱导线粒体自噬的发生,这是一种可在时间和空间上进行人为控制的线粒体自噬诱导方法[42].线粒体的保护剂,包括影响ATP生成与降解的药物、降低线粒体膜通透性的药物、铁依赖脂质过氧化作用的抑制剂、Ca2+阻滞剂和Ca2+依赖蛋白酶抑制剂等.乙酰左旋肉毒碱(Acetyl-L-carnitine,ALC)作为细胞呼吸的替代底物,可恢复呼吸效率,促进ATP生成,维持线粒体膜电位,抑制脂质过氧化,常用于线粒体紊乱导致的神经退行性疾病及病理性损伤的治疗研究[43].环孢菌素A(CyclosporinA,CsA)是一种线粒体通透性转变的特异性抑制剂,可通过干扰亲环素D(Cyclophilin D)和线粒体通透性转变孔的相互作用抑制线粒体的去极化和线粒体自噬体的形成[44].在Rodriguez等[27]的研究中,作为线粒体自噬诱导后的保护剂,可明显降低线粒体自噬体的总量.此外,非免疫抑制剂NIM811(N-methyl-4-isoleucine cyclosporin)也可发挥同样作用[45].线粒体自噬相关基因的敲除、沉默或过表达,可用于某一特定基因在整个线粒体自噬通路中功能的研究.如在果蝇PINK1/Parkin依赖性线粒体自噬途径的研究中发现,敲除PINK1和Parkin,可造成线粒体自噬的抑制[46],PINK1过表达不能补偿Parkin缺失所造成的线粒体自噬阻滞,而Parkin的过表达却可以部分缓解PINK1缺失造成的线粒体自噬阻滞[47].6小结线粒体自噬的研究方法众多,各有优势,但没有一种手段可以独立说明线粒体自噬的发生并反映其活性.受损的线粒体不仅可通过自噬的方式得到清除,也可能发生线粒体凋亡(Mitoptosis)[48].因此,研究线粒体自噬形态与功能,需针对其各期特点和发生机制,多指标与多技术联合,体内与体外、定性与定量实验相结合,并通过人为干预的实验性调节来研究线粒体自噬对机体或细胞的行为和效应分子的影响.在目前线粒体自噬尚无标准化的检测或监控技术的情况下,建议研究者理性地分析和对待采用不同技术手段所获得的有关线粒体自噬的实验结果,并在现有基础上寻找和创新线粒体自噬研究的新方法和新技术.这不仅是线粒体自稳态调节的深入研究所必需的,更对线粒体自噬的调控在衰老、神经退行性疾病和癌症治疗中的研究有重要意义.参考文献[1]Detmer S A,Chan D C.Functions and dysfunc-tions of mitochondrial dynamics[J].Mol Cell Biol, 2007,8(11):870−879.[2]Yakes F M,Van Houten B.Mitochondrial DNAdamage is more extensive and persists longer than nuclear DNA damage in human cells following oxida-tive stress[J].Proc Natl Acad Sci USA,1997,94(2): 514−519.[3]Lemasters J J,Nieminen A-L,Qian T,et al.The mitochondrial permeability transition in cell death:a common mechanism in necrosis,apopto-sis and autophagy[J].Biochim Biophys Acta,1998, 1366(177/196):177−196.[4]Guarente L.Mitochondria:a nexus for aging,calorie restriction,and sirtuins?[J].Cell,2008, 132(2):171−176.[5]Melser S,Chatelain Etienne H,La vieJ,et al.Rheb regulates mitophagy induced by mitochondrial energetic status[J].Cell,2013,17(5): 719−730.[6]Lemasters J J.Selective mitochondrialautophagy,or mitophagy,as a targeted defense against oxidative stress,mitochondrial dysfunction, and aging[J].Rejuv Res,2005,8(1):3−5.[7]Fimia G M,Kroemer G,Piacentini M.Molecu-lar mechanisms of selective autophagy[J].Cell Death Differ,2013,20(1):1−2.[8]Klionsky D J,Abdalla F C,Abeliovich H,et al.Guidelines for the use and interpretation of as-says for monitoring autophagy[J].Autophagy,2012, 8(4):445−544.[9]Rodriguez E S,He L,Lemasters J J.Role ofmitochondrial permeability transition pores in mito-chondrial autophagy[J].Int J Bilchem Cell B,2004, 36(12):2463−2472.[10]Kim I,Lemasters J J.Mitochondrial degradationby autophagy(mitophagy)in GFP-LC3transgenic hepatocytes during nutrient deprivation[J].Am J Physiol Cell Physiol,2011,300(2):C308−317. 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