自噬的WB检测指标的研究思路及方案

细胞自噬诱导实验报告细胞自噬的实验观察，主要有四种方法。

1、提取总RNA，通过Real-time PCR 分析相关基因A TG4、A TG5和AT7G的表达；2、提取总蛋白，通过Western blotting 分析LC3的脂化；3、构建GFP-LC3表达载体，通过细胞转染利用荧光显微镜观察LC3颗粒的聚集；4、制备电镜样品，直接观察自噬体的形成。

一、pEGFP-C2-LC3质粒的提取与鉴定实验原理一、实验原理质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。

质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。

质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。

质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。

与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量尽可能减少,以便于基因工程操作。

大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列,这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA 序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。

一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点；（3）能插入较大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的检测表型。

1. 煮沸法提取质粒的原理一般分离质粒DNA的方法都包括3个步骤：①培养细菌，使质粒DNA大量扩增；②收集和裂解细菌；③分离和纯化质粒DNA。

分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法和羟基磷灰石层析法等。

自噬研究思路自噬是一种细胞自身分解的过程，它将一些废旧或受损的细胞器或蛋白质分解成小分子，再利用这些小分子来合成新的细胞器或蛋白质。

自噬起初被认为是一种非特异性的蛋白质降解方式，但近年来的研究表明，自噬在细胞发育、衰老、代谢、应激等方面具有重要的生理和病理学功能，尤其在一些肿瘤、神经退行性疾病和代谢性疾病的发病机制中扮演重要的角色。

因此，自噬已成为当今细胞生物学研究领域的热点之一。

目前，自噬研究的思路主要包括以下几个方面。

1. 识别自噬过程中的关键分子自噬的过程是一个复杂的、高度调控的生物学过程，其主要包括自噬体的形成、运输、降解等过程。

因此，识别自噬过程中的关键分子是理解其整个调控网络的基础。

目前，已经鉴定了一些关键分子，例如Atg基因家族和Bcl-2蛋白家族等。

Atg基因家族编码的蛋白质参与了自噬体的形成和运输，而Bcl-2蛋白家族则与自噬体的降解过程有关。

2. 研究自噬在细胞生理和病理过程中的作用自噬在细胞代谢、应激、免疫、发育、衰老等过程中扮演重要的角色。

例如，自噬在清除破损的细胞器、清理异物和调节细胞代谢等方面发挥作用；而在一些疾病过程中，自噬被激活或受到抑制，导致细胞代谢紊乱、细胞死亡和肿瘤的形成等。

因此，深入研究自噬在这些生理和病理过程中的作用，对于揭示其调控网络和进一步探讨其应用价值具有重要的意义。

3. 探究自噬的调控机制自噬的调控网络是一个复杂的生物学系统，涉及到多种信号通路和分子机制的调节。

因此，探究自噬的调控机制是理解整个自噬过程的重要途径。

目前，包括mTORC1、ERK1/2、JNK等信号通路和Atg基因家族、BECN1、LC3等分子在内的多种调控机制已被发现，并被证实在肿瘤、免疫和衰老等方面具有重要的作用。

4. 开发自噬抑制剂和促进剂自噬是一个重要的生物学过程，具有广泛的生理和病理学功能。

因此，开发自噬抑制剂和促进剂可以为一些肿瘤、自身免疫性疾病等重大疾病的治疗提供新的策略。

检测自噬的实验方法一、形态学检测。

1. 透射电子显微镜（TEM）- 这可是检测自噬的“金标准”呢。

就像用一个超级放大镜去看细胞内部。

自噬的时候啊，细胞里会形成自噬体，这个自噬体在TEM下有它独特的样子，双层膜结构，里面包着要降解的东西。

不过呢，TEM也有点小麻烦，它的样品制备不容易，就像做一道超级精细的菜，得小心翼翼的，而且对仪器要求也高，就像开豪车得有好的路况一样。

2. 荧光显微镜检测。

- 可以用一些标记自噬相关蛋白的荧光染料。

比如说LC3蛋白，它可是自噬的一个重要标志。

当细胞发生自噬的时候，LC3 - I会变成LC3 - II，并且会定位到自噬体膜上。

我们就可以用带有绿色荧光的标记物去标记LC3，然后在荧光显微镜下看。

就像给自噬体穿上一件绿色的小衣服，在黑暗里用特殊的灯一照就能看到啦。

这种方法相对简单一些，就像穿休闲装出门，没那么多繁琐的步骤。

二、生化检测。

1. 检测自噬相关蛋白的表达水平。

- 像Western blot就可以用来检测自噬相关蛋白的变化。

比如前面说的LC3蛋白，还有p62蛋白。

p62蛋白是自噬的底物，如果自噬正常进行，p62蛋白的水平会下降，因为它被自噬体降解了。

这就像看一个东西的库存一样，如果一直在消耗，库存就会减少。

通过检测这些蛋白的表达量的变化，就能知道自噬是不是在正常工作啦。

2. 检测自噬流。

- 可以用一些试剂来阻断自噬体和溶酶体的融合，然后看自噬相关蛋白的变化。

如果自噬流是正常的，阻断之后自噬体就会堆积，相关蛋白的表达也会有相应的改变。

这就像是在水管中间堵一下，看看水是不是真的在流，在哪个地方堵住了一样有趣呢。

细胞自噬的检测方法及原理细胞自噬是一种维持细胞内稳态的重要过程，通过降解非功能性或老化的细胞器和细胞垃圾，以提供新的生物分子和能量。

自噬不仅在维持细胞内平衡方面起着关键作用，还与多种疾病的发生和发展密切相关。

因此，准确检测和探究细胞自噬的机制和功能对阐明疾病发生的分子机理具有重要意义。

目前，常用的细胞自噬检测方法主要包括观察自噬体形成和测量自噬相关蛋白水平两大类。

观察自噬体形成是一种直观和直接的方法来检测细胞自噬。

自噬体是由自噬小体和被降解的物质组成的膜包泡体，形成过程可以通过染色和显微镜技术进行观察。

以下是常用的自噬体形成检测方法：1. 电镜观察：电子显微镜技术可以观察到产生多层膜结构的自噬体。

2. 免疫荧光染色：通过特异性抗体对自噬相关蛋白进行染色，如微管相关蛋白1A/1B链轻链3（LC3）和自噬素5（Atg5），来观察细胞内自噬体的形成和分布。

3. 荧光探针染色：利用特定的荧光探针来标记自噬体，例如LC3染色剂（如LC3-GFP）和酸性小体标记剂（如LysoTracker Red）。

这些染料可以用于观察自噬体形成的时空演变过程。

4. 转基因动物模型：通过构建表达自噬相关标记物的转基因动物模型，如LC3-GFP转基因小鼠，可以观察到生物体内的自噬体形成情况。

除了观察自噬体形成，测量自噬相关蛋白水平也是评估细胞自噬活性的常用方法。

以下是常用的自噬相关蛋白水平检测方法：1. 免疫印迹：通过Western blot技术检测自噬相关蛋白的表达水平。

以LC3为例，可以检测其转化为醛固酮（LC3-I）和醛固酮转化为醛固酮（LC3-II）这一过程。

LC3-II是在自噬体形成过程中在自噬体外膜上积累的标志。

因此，检测LC3-I到LC3-II的转化可以用作自噬的指标。

2. 转基因动物模型：构建表达自噬标志物的转基因动物模型（如GFP-LC3小鼠），通过检测标志物在组织和细胞水平的表达情况来评估自噬活性。

3. 靶标免疫荧光检测：利用免疫荧光技术直接观察和测量自噬相关蛋白的表达水平，如通过LC3抗体进行染色，来检测LC3-II水平。

细胞自噬的研究方法一、本文概述细胞自噬是一种细胞内自我降解和再循环的过程，通过这一过程，细胞能够清除受损、老化或多余的细胞器及蛋白质，从而维持细胞内部环境的稳态。

近年来，随着对细胞自噬机制的深入研究，其在生物学领域的重要性日益凸显，成为了生命科学研究的热点之一。

本文旨在探讨细胞自噬的研究方法，包括细胞自噬的监测技术、诱导与抑制方法，以及研究细胞自噬在疾病发生发展中的作用等。

通过本文的阐述，希望能为从事细胞自噬研究的科研人员提供有益的参考和借鉴，推动细胞自噬研究领域的深入发展。

二、细胞自噬的基本过程与机制细胞自噬是一种细胞内降解和回收细胞质组分和细胞器的重要过程，对维持细胞稳态和适应环境变化具有关键作用。

自噬的基本过程可以分为几个关键步骤，包括自噬体的形成、自噬体与溶酶体的融合以及自噬体内物质的降解。

自噬体的形成是自噬过程的起始阶段。

在这一阶段，细胞内的双层膜结构（称为吞噬泡或自噬泡）开始延伸并包裹待降解的细胞质组分或细胞器。

这一过程受到多种自噬相关基因（ATG）编码的蛋白质的调控。

一些关键的ATG蛋白，如ATG5和ATG12，参与自噬体膜的延伸和闭合。

接下来，自噬体与溶酶体融合，形成一个自噬溶酶体。

在这一步骤中，自噬体的外膜与溶酶体的膜融合，释放出自噬体内的物质进入溶酶体的酸性环境。

溶酶体中含有多种水解酶，这些水解酶能够降解自噬体内的蛋白质、脂质和糖类等有机物。

自噬体内物质的降解是自噬过程的最后阶段。

在自噬溶酶体中，水解酶将自噬体内的物质分解为小分子，如氨基酸、脂肪酸和单糖等。

这些小分子可以被细胞重新利用，以支持细胞的代谢活动和生长需求。

除了上述基本过程外，细胞自噬还受到多种信号通路的调控。

例如，雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路和腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信号通路是调控自噬的两个重要通路。

mTOR通路在营养充足时抑制自噬，而在营养不足时则促进自噬的发生。

AMPK通路则在能量不足时激活自噬，以提供能量来源。

细胞自噬是一种重要的细胞生物学过程，涉及多个关键分子和通路。

以下是一些常用的检测方法，用于研究细胞自噬相关通路的关键分子：
1. 免疫荧光染色：通过使用特异性抗体标记关键分子，然后观察其在细胞中的分布和表达水平变化。

例如，可以使用LC3B抗体来标记自噬囊泡膜结构，并观察自噬囊泡的形成和降解。

2. 免疫印迹（Western blot）：通过提取细胞蛋白质并使用特异性抗体进行免疫印迹分析，以检测关键分子的表达水平变化。

例如，可以检测LC3B-II（转化后的形式）和p62等自噬相关蛋白的表达水平。

3. 转基因小鼠模型：利用基因工程技术构建具有特定基因缺陷或突变的小鼠模型，从而研究关键分子对细胞自噬的影响。

通过对这些小鼠进行组织或细胞水平的分析，可以评估关键分子在自噬调控中的作用。

4. 实时荧光显微镜：利用荧光标记的自噬囊泡膜结构或关键分子，观察细胞内自噬过程的实时动态变化。

例如，可以使用mCherry-GFP-LC3B融合蛋白来监测自噬囊泡的形成和降解过程。

5. 基因组学和转录组学方法：通过测定关键分子的基因表达水平变化和调控机制，以了解自噬相关通路的调控网络。

这包括RNA测序（RNA-seq）和质谱法等高通量技术。

这些方法的选择取决于具体研究问题和实验要求。

综合应用多种技术可以更全面地揭示细胞自噬相关通路的关键分子的功能和调控机制。

1。

wb实验的原理和步骤WB实验的原理和步骤。

WB实验是一种常用的生物学实验方法，用于检测蛋白质的表达水平。

本文将介绍WB实验的原理和步骤，希望能够帮助读者更好地理解和掌握这一实验技术。

一、实验原理。

WB实验的原理基于免疫学技术，主要包括以下几个步骤：1. 细胞裂解，首先需要将待检测的细胞或组织样品进行裂解，使得蛋白质释放出来。

2. 蛋白质分离，裂解后的蛋白质需要通过电泳或其他方法进行分离，以便后续的检测。

3. 蛋白转移，将分离后的蛋白质转移到聚丙烯酰胺膜上，通常采用电泳转印的方法。

4. 抗体结合，将特异性的一抗与目标蛋白结合，形成抗原-抗体复合物。

5. 信号检测，通过添加化学发光底物或染色底物，检测目标蛋白的表达水平。

二、实验步骤。

WB实验的具体步骤如下：1. 细胞裂解，将含有蛋白质的细胞或组织样品加入裂解液中，使用超声或搅拌等方法进行充分裂解。

2. 蛋白质分离，将裂解后的蛋白质样品加入聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离，根据蛋白质的大小和电荷进行分离。

3. 蛋白转移，将分离后的蛋白质转移到聚丙烯酰胺膜上，通常使用半干法或湿法转印。

4. 抗体结合，将膜中的蛋白质与特异性的一抗结合，通常需要进行过夜孵育，以保证抗体与蛋白质的充分结合。

5. 信号检测，通过添加化学发光底物或染色底物，检测抗体与蛋白质复合物的信号，得到目标蛋白的表达水平。

三、实验注意事项。

在进行WB实验时，需要注意以下几点：1. 样品处理，样品的裂解和处理过程需要在低温和无酶的条件下进行，以避免蛋白质的降解。

2. 抗体选择，选择特异性良好的一抗和二抗，以确保实验结果的准确性。

3. 数据分析，对实验结果进行准确的数据分析，包括目标蛋白的相对表达水平和统计学分析。

四、实验应用。

WB实验广泛应用于生物医学研究领域，可以用于检测蛋白质的表达水平、翻译后修饰和相互作用等。

在癌症、免疫学、神经科学等领域具有重要的应用价值。

总之，WB实验是一种常用的蛋白质检测方法，掌握其原理和步骤对于开展生物学研究具有重要意义。

线粒体自噬研究方法
线粒体自噬是细胞内一种重要的生理过程，其研究方法主要有以下几种：
1. 透射电镜技术（TEM）：这是研究自噬发生的最直接、最可靠的手段。

透射电镜可以观察到线粒体自噬体和线粒体自噬溶酶体的形成和结构特征，从而判断自噬是否发生。

2. 荧光显微镜技术：通过荧光标记的方法，可以观察线粒体自噬的动态过程，例如使用荧光探针标记技术对线粒体和自噬体进行共定位。

此外，还可以利用荧光基因标记技术对线粒体和自噬体进行共定位分析。

3. 免疫印迹技术（IB）：通过检测线粒体蛋白的表达量变化，可以反映线粒体自噬的活性。

通常选取线粒体基质蛋白、线粒体膜蛋白等作为检测目标，以全面反映线粒体总量的变化。

4. 流式细胞技术（Flow cytometry, FC）：这是一种单细胞定量分析和分选的手段，可以通过定量检测线粒体荧光强度的变化来反映线粒体的损伤程度。

5. 分子生物学技术：例如通过基因敲除或转基因技术，研究特定基因对线粒体自噬的影响；通过蛋白质组学方法，研究参与线粒体自噬的蛋白质的相互作用和调控机制。

这些方法各有特点，需要根据具体的研究目的和实验条件选择合适的方法。

WB常见指标——自噬标志物LC3摘要LC3特点实验要点LC3A/B/C有细胞/组织类型分布特点查询细胞/组织中各亚型的表达谱，选择合适靶标的抗体LC3-I可转变为LC3-II 检测LC3-I和LC3-II使用LC3A，LC3B 或者LC3A/B的抗体均可。

脂化、膜相关蛋白超声确保充分裂解小分子量蛋白~15%分离胶，0.22um印记膜转膜LC3-II可被溶酶体降解加入工具药（如氯喹等），阻断降解LC3-I/II的形成和降解是一个动态过程瞬时LC3-II表达不能反映自噬程度，需配合使用工具药（如氯喹）分析自噬变化正文在进行自噬研究时，WB检测LC3-I和LC3-II几乎是必做的实验，那么，进行LC3检测时，需要注意哪些要点呢？请看下文LC3: 从何处来？往何处去？LC3/Atg8 被具有蛋白内切酶活性的Atg4在羧基端剪切，生成胞质 LC3-I。

LC3-I通过Atg7 和 Atg3（分别对应 E1 和 E2 样酶）参与的泛素样反应，使磷脂酰乙醇胺 (PtdEth，PE) 偶联，生成脂质化形式的 LC3，也称作 LC3-II，它可以附着到自噬体(autophagosome)的膜上，是自噬体的结构蛋白。

在降解过程中，位于自噬溶酶体外膜的LC3-II被半胱氨酸蛋白酶Atg4B移除后回收，位于内膜的LC3-II则与包裹的内容物一起，被溶酶体降解。

图1：自噬信号通路的调控，点击下载源文件LC3A/B/C有种属细胞/组织分布特点LC3/Atg8 被具有蛋白内切酶活性的Atg4在羧基端剪切，生成胞质 LC3-I。

LC3-I通过Atg7 和 Atg3（分别对应 E1 和 E2 样酶）参与的泛素样反应，使磷脂酰乙醇胺 (PtdEth，PE) 偶联，生成脂质化形式的 LC3，也称作 LC3-II，它可以附着到自噬体(autophagosome)的膜上，是自噬体的结构蛋白。

在降解过程中，位于自噬溶酶体外膜的LC3-II被半胱氨酸蛋白酶Atg4B移除后回收，位于内膜的LC3-II则与包裹的内容物一起，被溶酶体降解。

细胞自噬 pcr和western步骤细胞自噬是一种细胞内的重要调节过程，可通过多种实验方法进行分析，包括PCR和western blotting。

下面是细胞自噬PCR和western blotting的一般步骤：PCR步骤：1. 收集并处理细胞样品，可以是自噬诱导或抑制后的细胞。

2. 提取总RNA或总DNA，使用适当的方法，如酚/氯仿提取。

3. 使用反转录酶将RNA逆转录为cDNA，可以使用逆转录PCR试剂盒。

4. 进行定量PCR实验来测定感兴趣的自噬相关基因的表达水平，使用合适的引物和PCR条件。

5. 进行PCR产物的电泳分析和可视化，以确定目标基因的相对表达水平。

Western blot步骤：1. 收集并处理细胞样品，可选择自噬诱导或抑制后的细胞。

2. 使用细胞裂解缓冲液裂解细胞，释放细胞内蛋白质，加入蛋白酶抑制剂以防止降解。

3. 将细胞裂解液进行离心，以去除细胞碎片和细胞核。

4. 将蛋白质样品分离通过SDS-PAGE凝胶电泳，根据需要选择凝胶浓度。

5. 将分离的蛋白质转移到膜上，通常使用半湿法转膜或湿法转膜等方法。

6. 阻断膜上非特异性结合位点，如使用1%的牛血清蛋白。

7. 使用特异性的一抗与目标蛋白结合，通过孵育过夜或适当的孵育时间。

8. 进行蛋白质的辅助抗体标记，如HRP标记的二抗结合目标蛋白。

9. 使用化学发光试剂等方法进行检测，如ECL法。

10. 使用影像分析软件对蛋白质带进行定量分析，以确定目标蛋白质的表达水平。

对于细胞自噬，可以通过检测和分析自噬相关基因的表达水平（PCR）以及检测自噬相关蛋白的表达水平（western blotting）来评估自噬程度。

wb实验的原理和步骤WB实验的原理和步骤。

WB实验是一种常用的蛋白质检测方法，它可以用来检测目标蛋白在细胞或组织中的表达水平，是生物学研究中常用的实验技术之一。

本文将介绍WB实验的原理和步骤，希望能够帮助读者更好地理解和掌握这一实验技术。

一、实验原理。

WB实验的原理主要基于蛋白质的电泳分离和免疫印迹技术。

首先，将待检测的蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳分离，然后将分离后的蛋白转移到聚丙烯酰胺膜上，接着用特异性抗体与目标蛋白结合，最后通过化学发光或显色反应来检测目标蛋白的表达水平。

二、实验步骤。

1. 样品制备，将待检测的蛋白样品加入SDS-PAGE样品缓冲液，加热变性，然后进行电泳分离。

2. 凝胶电泳，将样品加载到SDS-PAGE凝胶孔中，连接电源进行电泳分离，直至蛋白样品分离完全。

3. 转膜，将分离后的蛋白转移到聚丙烯酰胺膜上，可以选择湿式转膜或半干式转膜的方法，转膜时间和电流密度需要根据蛋白的大小和数量进行调整。

4. 封闭，将转膜后的膜放入封闭液中，封闭蛋白质膜上的非特异性结合位点，减少后续免疫印迹过程中的非特异性结合。

5. 抗体结合，将封闭后的膜与特异性一抗抗体孵育，使抗体与目标蛋白结合。

6. 洗膜，将膜进行多次洗涤，去除未结合的抗体。

7. 二抗结合，将膜与辣根过氧化酶标记的二抗孵育，二抗与一抗结合形成复合物。

8. 洗膜，将膜进行多次洗涤，去除未结合的二抗。

9. 显色或发光，根据实验需要选择化学发光或显色反应，观察目标蛋白的表达水平。

三、实验注意事项。

1. 样品制备时需加入还原剂和变性剂，使蛋白完全变性并且带有负电荷，便于电泳分离。

2. 蛋白转膜时，需保持膜的完整性，避免出现气泡和损坏，影响后续的免疫印迹效果。

3. 免疫印迹过程中的抗体孵育和洗膜步骤需要严格控制时间和条件，以保证特异性结合和减少非特异性结合。

4. 显色或发光反应的时间和条件也需要根据实验情况进行优化，以获得清晰的实验结果。

细胞自噬过程研究的关键方法与技术细胞自噬是细胞利用自身溶酶体内部酶降解并重复利用其自身细胞器、蛋白质和其他小分子且对缺乏营养等压力产生应答的基本机制。

细胞自噬广泛存在于真核生物中并且是一个非常保守的过程，可以作为研究癌症、神经系统疾病等疾病机制以及药物开发实验的重要手段。

但细胞自噬是非常复杂的，需要采用极具专业技术的方法从细胞自噬的各个方面加以研究。

1.细胞自噬基础研究之显微镜技术细胞自噬的研究需要多种技术来进行。

其中，显微镜技术是非常重要的手段。

通过荧光显微技术能够观察细胞中细胞自噬体的形成和分解。

使用GFP (green fluorescent protein)或自噬有关标志等融合蛋白，来对自噬相关蛋白进行观察和标记。

同时，荧光显微技术也可模拟短期药物作用的效应，并研究它们在细胞自噬中的作用。

通过电子显微技术，堆积的自噬体可以被直接观察到。

并且，该技术能够带来更多的细节和结构信息，从而更好地理解细胞自噬过程中各个阶段的变化。

2.细胞自噬基础研究之蛋白质检测技术细胞自噬过程中，一些蛋白质的含量和状态会发生变化，如Atg5、LC3、Beclin1和p62等等等。

因此，这些关键蛋白质的检测是研究细胞自噬过程的关键。

例如，在静止后的细胞中的LC3B-II 表现出的细胞自噬活性是一个特定的标志，而Atg5-Atg12结晶化体是一个标志活性的复杂结构。

免疫印记技术可以用来检测蛋白质的表达。

这个技术是基于高度选择性的抗体与特定蛋白质相应结合方法, 可以避免使用多种分子学和细胞生物学技术。

联动免疫墨迹技术技术可用于检测不同阶段的自噬和相关蛋白质互动的蛋白质表达。

这个方法利用蛋白质亲和受体和蛋白A / 蛋白G结合，非常适合确定自噬相关蛋白质可能形成的复合体。

3.细胞自噬基础研究之分子生物学技术基于RNAi技术，siRNA和shRNA可以使用C2C12细胞株中的基因静默方法研究细胞自噬过程。

使用引物可以引导RNase H 在核酸酶的作用下剪切信使RNA。

细胞⾃噬检测的具体步骤及⽅法细胞⾃噬检测的具体步骤及⽅法⼀、⾃噬体介绍⾃噬（Autophagy），或称⾃体吞噬，是⼀个涉及到细胞⾃⾝结构通过溶酶体机制⽽被分解的过程，该过程是⼀个受到紧密调控的步骤，帮助细胞产物在合成、降解以及接下来的循环中保持⼀个平衡状态。

细胞接受⾃噬诱导信号后，在胞浆的某处形成⼀个扁平的类似“脂质体”样的膜结构，称为Phagophore。

随着Phagophore不断延伸，将胞浆中的细胞器等成分，全部包裹住成为密闭的结构，称为“⾃噬体（autophagosome）”。

⾃噬体形成后，可与溶酶体融合，⾃噬体中的内容物随即被降解，产物（氨基酸、脂肪酸等）被输送到胞浆中，供细胞重新利⽤，⽽残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。

⾃噬信号通路：⼆、⾃噬研究策略和⽅法正常细胞基础⽔平⾃噬活性⽐较低，对⾃噬研究通常需要进⾏⼈⼯调节和⼲预，常⽤药物有：1、⾃噬诱导剂a) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质⽹应激；b) Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase 抑制剂（即Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶）；c) Earle's平衡盐溶液：制造饥饿；d) N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制剂；e) Rapamycin：mTOR抑制剂；f) Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂。

2、⾃噬抑制剂a) ⾃噬抑制剂3-Methyladenine（3-MA）：(Class III PI3K) hVps34 抑制剂；b) Bafilomycin A1：质⼦泵抑制剂；c) 溶酶体抑制剂Hydroxychloroquine（羟氯喹）。

3、⾃噬检测1) 透射电镜；电镜作为⾃噬检测的⾦指标。

自噬研究：快到碗里来！作者：右哉最近自噬的研究都很火，耐药不耐药，凋亡不凋亡的都开始往上扯了。

这篇文章的题目是：'Ulinastatin Reduces the Resistance of Liver Cancer Cells to Epirubicin by Inhibiting Autophagy'，基本上可以作为入门级自噬研究的参考模板了。

文章思路是这样的：首先文章证明了EPI能诱导肝癌细胞自噬，而UTI能抑制这样的自噬；然后UTI能促进EPI诱导的细胞凋亡；接着证明UTI是抑制自噬从而促进了EPI诱导的凋亡；然后证明了UTI是通过NF-kB信号通路起到了这样的作用；最后做了一下成瘤实验。

我们就看第一个Fig，就基本能了解自噬他们究竟做了点啥。

自噬研究基本可以分这样几个层次：1.证明自噬参与了你的研究表型：western检测LC3，p62；LC3双荧光测细胞自噬流；电镜观测自噬；自噬形成时胞浆型LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。

但LC3的抗体会对LC3-II有更高的亲和力，所以往往会造成假阳性。

所以通常会使用LC3的亚细胞结构定位来辅助实验。

比如这篇文章所采用的就是HanBio Inc.（汉恒生物）的mRFP-GFP-LC3的腺病毒进行分析的。

2.证明自噬在你的表型中起了关键作用：加自噬抑制剂3-MA，激动剂rapamycin等，然后检测表型（功能）；这里就用到了两种自噬抑制剂：3-MA和CQ（Chloroquine）。

3.找到表型与自噬衔接的分子：检测自噬通路如pI3K 通路，Beclin-1，ATG家族各成员,看看哪个与表型呈现正相关变化;4.基因操作3中的分子,检测自噬和表型：说明该分子在衔接自噬和表型中的作用机制;这一点需要运用到的也就是柯霍氏法则和回复实验。

…华丽丽的分割线…李莫愁博士：而普通的自噬研究，也就是这样一个模式：（感谢汉恒生物的蔡博士为我们整理）自噬表型研究中，较为常用的就是采用汉恒的mRFP-GFP-LC3融合蛋白的腺病毒，对细胞进行了感染。

WB试验每步原理和技术及试剂的分析WB蛋白印迹在生物化学这一块是常规实验，就像有人说炒菜中境界最高也最难的是蛋炒饭一样，实验中常规实验也是很考验技能的，除了潜心研究原理、认真揣摩技巧以外，对于新实验试剂的信息把握，勇于尝试新方法也是非常之重要的——各大厂家都在不断开发更方便更灵敏的新产品，“idea是生产力”嘛，因此生物通这里介绍一些能把我们从日常操作中解脱出来，获得“升级版”效果WB产品。

讲完了Western Blotting的电泳转移仪器，蛋白分子量标准和转移膜之后，我们最后来探讨一下WB的检测系统。

一般的WB检测过程中，都会有封闭、一抗、二抗和底物显色这四道工序要“加工”。

我个人觉得底物显色这最后一步是最关键的，也是最有文章可以作的一个部分。

你看，光标记方式就有生物素标记，地高辛标记，各种酶标记等等，酶标的底物又有各种生色底物、化学发光法底物和荧光底物可供选择；就连识别一抗的配体也不一定非要二抗不可，也可以是抗生物素蛋白，链亲和素或者Protein A或G等，更别说各种试剂盒琳琅满目，叫人好像无从下手！不过不急，生物通帮你作个参考，让你对各种产品的优点缺点一览无遗，真正成为一个WB高手。

另外如果实验室有已经建立的固定的显色方法，那也没关系，有时候不经意浏览到的方法可能就会对你的实验有莫大的帮助——这也就达到我们的目的了。

封闭和一抗的选择没有太多的选择余地——封闭前面介绍过了；一抗？现在的抗体产品说明书一般都有注明应用范围的，说明可以用于WB的就OK。

如果没有这些信息可以遵从以下原则：单抗专一性高，但是经过SDS-PAGE变性胶电泳的蛋白质可能由于原来的识别位点构象发生改变而不被识别，多抗不如单抗专一性高但更容易得到结果。

如果还有多种抗体选择，那当然是来源于兔或者小鼠抗体为好，因为后继的检测试剂盒一般都是针对兔鼠的居多，因而选择范围更大通用性也更强。

除了无标记的一抗，还有生物素等各种标记一抗。

细胞自噬流数据统计分析
细胞自噬是一种细胞内的代谢过程，涉及到多个相关蛋白质和信号通路，因此流数据统计分析可以帮助我们更全面地了解细胞自噬过程。

以下是可能需要进行的流数据统计分析：
1. 细胞自噬相关蛋白质表达：使用Western blot等方法检测细胞中自噬相关蛋白质（如LC3、p62、Beclin-1等）的表达水平，对比实验组和对照组并进行差异分析。

2. 细胞自噬程度：使用转染GFP-LC3等荧光探针标记自噬小体，通过荧光显微镜观察自噬小体数量和大小的变化，并进行荧光强度的统计分析。

3. 细胞自噬相关信号通路：使用RT-qPCR等方法检测细胞自噬相关信号通路（如mTOR、AKT、AMPK等）的mRNA水平变化，对比实验组和对照组并进行差异分析。

4. 细胞自噬和细胞凋亡：使用细胞凋亡标记染料如Annexin V和PI等，通过流式细胞术检测细胞凋亡率，并分析自噬和细胞凋亡之间的相关性。

以上是一些可能需要进行的流数据统计分析，具体方法可以根据实验设计和需要进行选择。

自噬荧光研究方法及具体步骤自噬（Autophagy）一词来源于古希腊语，是“auto”（自我）与“phagein”（吞噬）的结合。

自噬发生在细胞内，是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器，使其包被进入双层膜囊泡（自噬体），进而与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程，自噬的意义在于实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。

在自噬过程中，自噬体的形成是关键，其直径平均500nm，囊泡内包裹胞质成分和某些细胞器如线粒体、内吞体、过氧化物酶体等。

与其他细胞器相比，自噬体的半衰期很短，只有8min 左右，说明自噬是细胞对于环境变化的有效反应。

细胞质中的线粒体等细胞器首先被囊泡所包被，这种囊泡主要来自于内质网和高尔基体；囊泡最终形成双层膜结构，即自噬体（autophagosome）；自吞噬体与胞内体融合形成中间自体吞噬泡，最终自体吞噬泡的外膜与溶酶体融合形成自噬溶酶体（autolysosome），由溶酶体内的酶降解自体吞噬泡中的内容物和内膜。

自噬观察检测方法：1．透射电镜下直接观察自噬体Phagophore 的特征为：新月状或杯状，双层或多层膜；自噬体的特征为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等；自噬溶酶体的特征为：单层膜，胞浆成分已降解。

2．利用Western Blot 检测LC3-II/I 比值的变化以评价自噬形成自噬形成过程中，胞浆型LC3（LC3-I）会酶解掉一段多肽，转变为膜型LC3 （LC3-II）。

故而LC3-II/LC3-I 比值的大小可估计自噬水平的高低。

3．在荧光显微镜下采用GFP-LC3 融合蛋白来示踪自噬形成无自噬时，GFP-LC3 融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3 融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。

单荧光检测系统该系统通过外源表达系统在宿主细胞中过表达GFP-LC3B 融合蛋白。

细胞自噬检测引言细胞自噬（Autophagy）是一种维持细胞内稳态的重要细胞生理过程。

它通过将细胞内的有害垃圾物质、受损蛋白质和细胞器通过包裹成双层膜体而将其降解和回收。

细胞自噬不仅对于维持细胞内环境的平衡，也在细胞营养不足、应激等情况下发挥至关重要的作用。

为了研究细胞自噬的机制、功能以及其在疾病中的作用，科研人员常常需要进行细胞自噬的检测。

本文将介绍一些常用的细胞自噬检测方法，旨在帮助科研人员更好地开展相关研究。

方法一：免疫组化检测免疫组化检测是常用的细胞自噬检测方法之一，它利用特异性抗体识别和定位自噬相关的蛋白质标记。

以下是免疫组化检测的步骤：1.固定和透化：将细胞样品固定在载玻片上，并通过透化剂处理，以便抗体能够穿透细胞膜进入细胞内。

2.抗体反应：加入特异性的抗体，使其与目标自噬蛋白结合。

3.洗涤：进行多次洗涤，以除去未结合的抗体。

4.二抗结合：加入与第一抗体来源不同种类的第二抗体，它能连接到第一抗体上，使得目标蛋白能够被可见光或荧光染料标记。

5.洗涤：进行多次洗涤，以除去未结合的第二抗体。

6.显色或荧光检测：加入适当的显色剂或荧光标记物，观察细胞自噬标记的结果。

免疫组化检测方法适用于观察细胞内特定蛋白质的表达和定位情况，从而间接地了解细胞自噬的活性。

方法二：转染自噬标记基因为了直接观察细胞内自噬相关的蛋白质的表达情况，科研人员可以利用转染自噬标记基因的方法。

以下是一种常用的自噬标记基因：mRFP-GFP-LC3。

mRFP-GFP-LC3是一种融合蛋白，其中GFP（绿色荧光蛋白）和mRFP（红色荧光蛋白）与自噬相关的蛋白LC3融合在一起。

GFP能够在细胞自噬过程中被降解，而mRFP则能够在自噬过程中保持稳定。

转染mRFP-GFP-LC3基因后，科研人员可以通过观察细胞中的荧光信号来确定细胞的自噬活性。

当细胞自噬活性较低时，绿色和红色荧光都很强；而当细胞自噬活性增加时，绿色荧光减弱而红色荧光增强。