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自然科学进展第14卷 第8期 2004年8月高等植物启动子及其应用研究进展*路 静1,2 赵华燕1 何奕昆2 宋艳茹1**1.中国科学院植物研究所,光合作用和环境分子生理学重点实验室,北京100093;2.首都师范大学生物系,北京1000372003-11-06收稿,2003-12-30收修改稿*北京市自然科学基金(批准号:5012009)、国家自然科学基金(批准号:30170783)和/八六三0高科技(批准号:2004AA212121)资助项目**通讯作者,E -mail:songyr@摘要 高等植物基因的表达调控已成为分子生物学研究领域的热点和前沿,启动子是基因表达调控的重要元件.深入研究启动子的结构和功能,建立可用于植物转基因表达的时、空、量三维调控系统,可为功能基因组学研究及通过基因工程技术精确地调节植物代谢提供全新的思路.文中从高等植物启动子的类型、结构和功能入手,着重介绍了启动子研究及应用的最新进展.关键词 启动子 基因表达调控 时空表达特异性 启动子是RNA 聚合酶能够识别并与之结合,从而起始基因转录的一段DNA 序列,通常位于基因上游.一个典型的启动子包括CAAT -box 和TATA -box,它们分别是依赖DNA 的RNA 聚合酶的识别和结合位点,一般位于转录起始位点上游几十个碱基处.在核心启动子上游通常会有一些特殊的DNA 序列,即顺式作用元件,转录因子与之结合从而激活或抑制基因的转录.一旦RNA 聚合酶定位并结合在启动子上即可启动基因转录,因此启动子是基因表达调控的重要元件,它与RNA 聚合酶及其他蛋白辅助因子等反式作用因子的相互作用是启动子调控基因转录的实质.根据启动子的转录模式可将其分为3类:组成型启动子、组织或器官特异性启动子和诱导型启动子.1 组成型启动子在组成型启动子调控下,不同组织器官和发育阶段的基因表达没有明显差异,因而称之为组成型启动子.双子叶植物中最常使用的组成型启动子是花椰菜花叶病毒(CaMV )35S 启动子,它具多种顺式作用元件[1].其转录起始位点上游-343~-46bp 是转录增强区,-343~-208和-208~-90bp 是转录激活区,-90~-46bp 是进一步增强转录活性的区域.在了解CaMV 35S 启动子各种顺式作用元件的基础上,人们利用它的核心序列构建人工启动子,以得到转录活性更高的启动子.Mit -suhara 等[2]利用CaM V 35S 核心启动子与CaM V 35S 启动子的5.端不同区段和烟草花叶病毒的5.非转录区(omega 序列)相连,发现把两个CaM V 35S 启动子-419~-90(E12)序列与omega 序列串联,在转基因烟草中GU S 有最大的表达活性.把7个CaM V 35S 启动子的-290~-90(E7)序列与omeg a 序列串联,非常适合驱动外源基因在水稻中表达.用这两种结构驱动GUS 基因表达,在转基因烟草和水稻中GUS 活性比单用CaMV 35S 启动子高20~70倍.另一种高效的组成型启动子CsVMV 是从木薯叶脉花叶病毒(cassava vein mosaic virus )中分离的[3].该启动子-222~-173bp 负责驱动基因在植物绿色组织和根尖中表达,其中-219/-203是TGACG 重复基序,即as1(activating sequence 1),-183/-180为GATA(又称为as2),这两个元件的互作对控制基因在绿色组织中表达至关重要.该启动子-178~-63bp 包含负责调控基因在维管组织中表达的元件.CsVMV 启动子在转基因葡萄中驱856动外源基因的转录能力与使用两个串联的CaMV35S启动子相当,两个串联的CsVMV启动子转录活性更强[4].Rance等[5]利用CoYMV(com-melina yellow mosaic virus),CsVM V启动子区和CaMV35S启动子的激活序列(as1,as2)人工构建高效融合启动子,瞬时表达实验表明该启动子可驱动报告基因在双子叶植物烟草中高效表达,在单子叶植物玉米中其驱动能力比通常使用的C-玉米蛋白启动子高6倍.因此用这种人工构建的高效启动子驱动抗病基因或目的蛋白基因,在双子叶和单子叶植物中均可达到较理想的效果.人们高度重视从植物本身克隆组成型启动子,并初见成效,例如肌动蛋白(actin)[6]和泛素(ubiqu-i tin)[7]等基因的启动子已被克隆.用这些启动子代替CaMV35S启动子,可以更有效地在单子叶植物中驱动外源基因的转录.Naomi等[8]分别从拟南芥的色氨酸合酶B亚基基因和植物光敏色素基因中克隆了相应启动子,用其代替CaM V35S启动子,在转基因烟草中也取得了很好的表达效果.由于组成型启动子驱动的基因在植物各组织中均有不同程度表达,应用中逐渐暴露出一些问题.例如外源基因在整株植物中表达,产生大量异源蛋白质或代谢产物在植物体内积累,打破了植物原有的代谢平衡,有些产物对植物并非必需甚至有毒,因而阻碍了植物的正常生长,甚至导致死亡.另外,重复使用同一种启动子驱动两个或两个以上的外源基因可能引起基因沉默或共抑制现象[9].因此,人们寻找更为有效的组织、器官特异性启动子代替组成型启动子,以更好地调控植物基因表达.2组织或器官特异性启动子这类启动子调控下的基因转录一般只发生在某些特定器官或组织中,目前已发现这类启动子中一般同时存在几种控制组织特异性表达的元件,其表达特异性由这些元件的种类、数目及相对位置等共同决定.深入研究这些启动子不仅有助于阐明植物形态、发育、代谢途径等基础理论,而且具有广泛的应用价值.2.1根特异启动子根的发生和发育是植物发育过程中的重要问题,研究根中特异表达基因及其启动子无疑是重要的.拟南芥根中特异表达的黑芥子酶(my rosinase)是由Py k10基因编码的.Pyk10启动子中存在若干器官特异性表达和植物激素应答的特异元件,如ACGT-核心序列、CANNTG-motifs、GATA-motifs、诱导物(elicitor)应答元件W-box((T)TGAC(C))、植物激素应答元件(如as-1元件、生长素和脱落酸应答元件、Myb元件)和细胞特异表达元件等[10].其中ACGT,CANNTG,GATA等顺式作用元件是决定组织器官特异表达的转录因子结合位点,Myb 元件在控制植物次生代谢、调节细胞形态建成及信号传导通路中起作用.根特异表达系统可用于研究转基因植物的高渗胁迫耐受、植物修复和根际分泌等问题.Borisjuk 等[11]用根特异启动子mas2.,GFP和烟草钙网蛋白(calreticulin)基因构建融合表达载体,水培转基因烟草结果表明,根细胞不仅能够高效生产GFP,而且可将目的蛋白质分泌到液体培养基中.因此利用该启动子与其他有用的能编码蛋白质的基因融合,不仅可大量生产目的蛋白质,且更便于回收产物.2.2茎特异启动子Trindade等利用cDNA-AFLP技术从马铃薯中分离了一个与乙醇脱氢酶非常相似的TDF511(tran-script derived fragment),其基因Stg an可能参与植物体内影响赤霉素水平的复合物的合成[12].在NCBI数据库中,比较Stgan启动子与马铃薯的patatin I和I I、蛋白酶抑制子、nodulin22K和23K 等编码蛋白质基因的启动子,发现它们包含一些可能与蔗糖应答反应有关的共有序列;该启动子还包含植物中几个保守的转录因子(如Dof1,Dof2, Dof3和PBF)的结合位点.构建S tgan启动子-GUS 融合表达载体转化烟草,GUS组织化学染色显示该启动子驱动基因在茎结节处特异表达,可能参与块茎形成过程.研究在茎中特异表达基因的启动子,不仅可从分子水平了解茎的发生、分化过程,更重要的是利用这些启动子调节植物代谢可满足人类需求,如人们对木质素生物合成及其调控的研究.木质素是植物体内仅次于纤维素的一种含量丰富而重要的有机857自然科学进展第14卷第8期2004年8月大分子物质,它的存在对于增加植物机械强度、远距离水分运输和抵抗外界不良环境的侵袭都是非常有益的.然而,木质素的存在也有一定的负面作用[13].因此,人们希望通过调节木质素的合成以降低其含量.目前多使用CaMV35S启动子驱动目的基因,近年来已分离一些木质素生物合成途径中关键酶基因的启动子,如4CL,F5H等基因的启动子,人们正在尝试利用这些特异性启动子来调节木质素的生物合成.Bel-l Lelong等[14]已从拟南芥中分离了肉桂酸羟-4-基化酶(cinnamate-4-hydroxylase, C4H)基因的启动子,本实验室首次从毛白杨中分离了C4H启动子,并对该启动子的功能进行了初步鉴定.GUS组织化学染色和GUS荧光测定结果表明,C4H启动子驱动外源基因在烟草茎的维管组织中丰富表达(待发表),有望将来利用该启动子驱动功能基因调控木质素的生物合成过程.2.3叶特异启动子M arraccini等[15]从咖啡(coff ea arabica)中克隆了1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(rubisco)小亚基基因RBCS1,该基因在一年生植物咖啡的叶中特异表达.研究发现RBCS1启动子上游GTGGT-TAAT序列与豌豆RBCS3A启动子的Box II核心序列相同;在其启动子G-box(GCCACGTGGC)两侧分别有一个类I-box(核心序列为GATAAG),形成I-G-I结构,推测G-box十个碱基的回文结构可能结合某个转录因子;其AT-1box(AGAATTT T-TATT)与其他RBCS和CAB基因的AT-1box (AATATTTT TATT)相比只有两个碱基不同;类L-box(AAAAT TAACCAA)与马铃薯RBCS1和RBCS3A启动子的相同.由此可见,植物叶特异表达顺式元件具高度保守性.有趣的是Taniguchi等[16]在玉米中发现了一个双元启动子系统(dual promoter system).PPDK (pyruvate,orthophosphate dikinase)是C4植物光合反应中的一个叶绿体酶,该酶基因Pdk具有一个双元启动子系统(C4Pdk启动子和细胞质Pdk启动子).这两个启动子的区别在于起始密码子和拼接方式的差异,C4Pdk启动子驱动Pdk转录成较长的mRNA,基因产物定位在叶绿体中;细胞质Pdk启动子在Pdk基因的第一个内含子中,驱动Pdk转录成较短的mRNA,它所编码的蛋白质定位于细胞质中,又称为细胞质Pdk启动子.C4Pdk启动子是受光诱导的强启动子,驱动基因在玉米叶肉细胞中特异表达;而细胞质Pdk启动子是个弱启动子,且不具有组织特异性.大多数C4植物的光合作用相关基因的表达具有细胞特异性,且主要在转录水平调节基因表达活性,因此,可利用该启动子在C4植物叶肉细胞中高效表达外源基因.2.4花特异启动子高等植物发育过程中花器官的形成是一个十分复杂的过程,它包括一系列器官分化及严格控制的细胞及生化变化,同时伴随大量基因的协同表达.目前人们最为关注的是花药中特异表达的基因,抑制或破坏这些基因的表达可导致雄性不育,即可利用基因工程的方法创造雄性不育系.人们克隆了许多花药特异表达的基因,如在花药绒毡层特异表达的TA29[17],A9[18]、在花粉壁特异表达的Bp4A[19]等,但这些基因都是在花药营养细胞中表达,与生殖细胞的分化无关.Singh 等[20]从百合(L ilium longif lorum)中克隆了一个L GC1基因的启动子,该启动子驱动的基因只在雄配子细胞中表达.L GC1启动子-242~-183bp之间可能包含某种顺式作用元件,它的缺失会导致细胞特异性表达特性丧失,由此可知L GC1在生殖细胞中的表达特异性可能是由于其他细胞中存在某些转录因子抑制该基因表达的结果.这是迄今为止发现的第一个有关雄配子细胞特异性的启动子,在研究花药发生和受精作用中将会是一个有用的工具.2.5果实、种子特异性启动子利用果实或种子等器官特异性启动子调控基因表达,不仅可提高基因在这些部位的表达量,将生物能耗降到最低,利于表达产物的分离,而且可有目的地提高转基因植物果实或种子的营养或改善其品质.番茄E8启动子[21]是成熟果实中乙烯应答性基因的启动子,其-409~-263bp可控制E8基因在果实成熟过程中特异表达,-2181~-1088bp为乙烯应答激活域.Sandhu等[22]利用E8启动子驱动呼吸道合胞病毒F抗原基因成功转化番茄植株,用果实特异表达抗原喂饲小鼠,可诱导小鼠产生特异的858自然科学进展第14卷第8期2004年8月粘膜免疫反应、血清学抗体反应及TH1型细胞免疫反应.基因表达调控与免疫学的有效结合,使得转基因植物口服疫苗可在不久的将来问世.2A12是番茄中另一种果实特异性启动子,毛自朝等[23]利用该启动子驱动ipt调节果实内源激素的含量,不仅可获得无籽果实,还能改善果实的品质.种子特异性启动子中研究较多的是胚乳特异性谷蛋白基因启动子.谷蛋白占水稻种子储藏蛋白总量的70%~80%,早在1986年Takaiw a[24]等就克隆了第一个水稻谷蛋白基因的cDNA.该基因转录起始位点-261~-1bp之间有若干控制种子特异性表达的顺式作用元件,如AACA-box、种子凝集素-box、未成熟种子核因子结合位点等.此外,启动子更上游处还有若干增强子和调节元件,如-300 bp处的RY重复序列,它是核蛋白的结合位点[25]. Yoshihara等[26]研究发现水稻谷蛋白启动子上游-104~-60bp之间有两个顺式作用元件AACA和GCN4,GCN4能增强启动子的活性,而启动子的组织特异性则须两者协同作用.虽然植物食物中包含人类营养所需的绝大多数矿物质和有机养分,但日常摄入的食物往往不足以提供人体所需的营养.因此人们希望通过植物基因工程提高植物中所含的营养物质.水稻谷粒中含有铁蛋白,但多积累在糊粉层,在谷粒加工过程中会失去很多铁.Vasconcelos等[27]用水稻胚乳特异性谷蛋白基因启动子驱动大豆铁蛋白基因,使转基因水稻谷粒中铁和锌的含量都有所增加,而且铁蛋白主要积累在胚乳中,不会在食品加工过程中丢失.无独有偶,Datta等[28]利用水稻谷蛋白特异启动子驱动八氢番茄红素合酶基因PS Y,在水稻胚乳中成功合成维他命原A.以植物为生物反应器生产生物可降解塑料是本实验室研究目标之一.叶梁等使用大豆7S种子特异性启动子,构建二价和三价种子特异性表达载体转化油菜[29].这样将产物聚-3-羟基丁酸酯(PHB)定位与种子质体中,不仅增加了底物供应,也减少PH B对植物生长发育的影响.为优化已有表达框架,减小基因沉默发生几率,Zhang等[30]从油菜H165基因组DNA中分离到nap inB启动子的部分序列)nap300.序列分析表明,nap inB启动子包含一些在进化上保守性很高的序列,如AT-rich se-quence,TACACAT保守序列、RY重复序列、G-box等,这些顺式作用元件可能对种子特异性表达起重要的调控作用.将nap300与GUS基因融合转化烟草,GU S在胚和胚乳中均有表达;GUS荧光检测显示nap300启动子具有驱动基因在种子发育晚期表达的能力.3诱导型启动子与组织器官特异性启动子相比,诱导型启动子有着独特的优点:它可根据需要在植物特定的发育阶段、组织器官或生长环境下,快速诱导基因转录的/开0与/关0.根据来源,可将诱导型启动子分为天然存在的启动子和人工构建的启动子.3.1天然的诱导型启动子长期进化过程中,植物通过启动不同基因的表达可在一定范围内适应光、温、水等环境的变化.这些基因的启动子通常包含比较保守的顺式作用元件,利用这些保守元件可以推测新基因的可能功能,也可用这些环境应答基因的启动子与抗逆基因融合,从而使转基因植物更好地适应逆境.天然诱导型启动子包括光、温度、激素应答启动子等.光应答启动子中通常存在GT-1-motif, I-box,G-box和AT-rich sequence等顺式作用元件;温度应答启动子中多存在H SE-motif,CCAAT-box, CCGAC-motif等;激素应答启动子中则包含各种激素应答元件[31].G-box作为蛋白结合的一个高度保守的位点,是植物中通用的受信号诱导的顺式作用元件,在植物和动物中具高度保守的核心序列CACGT[32].G-box通常与另外一个顺式作用元件如I-box,H-box等协同作用,在细胞接受外界信号时调节转录起始的频率.这种机制可能是通过G-box及其结合蛋白相互作用产生一个内部环境,其他调节蛋白与启动子区域有效结合,使细胞准确而有选择地起始转录.有些诱导型启动子同时具有组织特异性,如RBCS1启动子,既包含叶特异表达元件,又带有几个光应答元件(LREs),受光的诱导调节[15].当转基因烟草由光照转入黑暗时,该启动子驱动的GU S活性比在光下低许多,Northern杂交几乎检测不到GUS的表达.859自然科学进展第14卷第8期2004年8月由于植物生长环境及基因表达的复杂性,从外界环境的刺激到启动应答基因的表达之间的信号通路往往是相互交叉的,这样启动子中包含的顺式作用元件通常也不止一种,如从葡萄中克隆的白藜芦醇合酶基因Vst1启动子,当病虫侵害、UV照射、臭氧环境或化学物质诱导时均可启动Vst1的表达. Riou等[33]发现该启动子上分别带有乙烯和臭氧的应答元件,可适应不同的外界刺激.拟南芥rd29A 基因[34]在干旱、高盐碱、低温或脱落酸诱导时表达,其启动子-174~-55区域包含干旱应答因子(DRE,TACCGACAT)和ABA应答因子(ABRE, ACGTGG/TC),且该基因在ABA诱导表达时, DRE和ABRE是相互独立的.当植物受病虫害侵犯时,受伤部位会立刻启动细胞程序性死亡,即发生所谓超敏反应(hypersens-i tive response,H R).HR通常会启动未受伤部位产生次级防御反应,从而对一般的病虫害产生普遍抗性,这种现象称为系统获得性抗性(systemic ac-quired resistance,SAR).烟草中SAR基因是一个至少包含十二个成员的家族,SAR也受一些诸如水杨酸(SA),INA(dichloroisonicotinic acid)和BTH(ben-zothiadiazole)等化学物诱导[35].烟草Sar8.2b基因启动子-205/-201是as-1元件(T GACG),-146/-141和-276/-271为两个GT-1结合序列(GGAAAT),-97/-94、-322/-318和-761/ -758分别是Dof结合基序(AAAG),前两者被认为可以与SA应答的转录因子结合而起关键作用.启动子缺失实验表明Sar8.2b启动子-927~-728和-351~-197bp分别包含有SAR高效诱导基因表达所需的顺式作用元件,缺少了这两个DNA片段,转基因烟草GUS表达活性明显降低.3.2人工构建的诱导型启动子在开发植物天然存在的诱导型启动子的基础上,人工构建可诱导表达系统以满足不同需求.目前研究最多、最深入的可诱导表达系统是化学诱导表达系统.自第一次用化学诱导表达系统TetR,通过CaMV35S启动子成功调节cat基因[36]的表达以来已有20多年的历史,现已发展成日臻完善的植物表达外源基因的可诱导表达系统.该系统包括两个转录单元:一是与化学诱导物结合的转录因子的表达,另一个转录单元包含一个应答元件,经诱导物处理后,通过它激活转录因子,从而激活或抑制目的基因的表达[37].一个理想的化学诱导表达系统应具备以下特点:首先,外源基因在植物体自身不表达或低水平表达,当添加诱导物后,高效诱导基因表达;其次,诱导物需要有较强的专一性;第三,诱导物可快速启动基因表达的/开0与/关0;而且诱导物对植物无毒或低毒[37,38].根据控制基因表达的方式,可将化学诱导系统分为两大类:阻遏型启动子系统和激活型启动子系统.3.2.1阻遏型启动子系统该系统建立在阻遏蛋白与转录因子在空间构型相互作用的基础之上.当诱导物不存在时,激活蛋白与阻遏蛋白结合,基因正常转录;添加诱导物后,诱导物与激活蛋白结合或阻止其与阻遏蛋白结合,阻遏蛋白则与启动子上的某些顺式作用元件结合,抑制基因转录,如以四环素抑制子为基础的四环素抑制系统(tTA).Love 等[39]用包含四环素抑制子的启动子Top10与报告基因GFP相连转化拟南芥,发现用100ng/m L的四环素即可抑制GFP的表达,而且改变培养基中四环素的浓度,可调节GFP的表达水平.3.2.2激活型启动子系统在抑制型启动子系统中,抑制基因转录所需诱导物的量往往超出植物适应的范围,而且在真核生物中激活基因比抑制基因转录更容易,近年发展了一些激活型启动子系统,如地塞米松诱导的GR系统[40]、雌二醇诱导的ER 系统[41]、杀虫剂诱导的EcR系统[42]等.激活型启动子系统的优点是只有当诱导物存在时才能启动基因表达,去除诱导物后,基因表达很快被关闭,这样就可以人为地精确、快速控制基因的表达.Bohner等[43]研究了一种可双向调控外源基因表达的系统,他们将改造的启动子Top10与报告基因GUS相连,使用转录激活子TGV作为基因开关.转基因烟草结果表明,用地塞米松处理3h后基因表达量达到高峰;用四环素处理6h即可关闭基因表达.该诱导系统最大的优点在于可迅速调节基因的表达与否,当外源基因可能对植物产生不良影响时这一点显得尤为重要.为了满足应用需要,人们开始研究便于在大田860自然科学进展第14卷第8期2004年8月使用的诱导表达系统,杀虫剂诱导的EcR系统就是一个很好的范例.U nger等[42]利用欧洲玉米螟(Os-trinia nubilalis)的蜕皮激素配基结合结构域(EcR LBD)、玉米C1激活域(AD)和GAL4DNA结合结构域(DBD)构建化学诱导激活子,把它与玉米ms45最小启动子相连,构建成可受杀虫剂诱导的人工启动子诱导系统.他们利用该系统在玉米雄性不育突变株ms45中成功地诱导了育性恢复基因MS45的表达.4问题与展望近20年人们在启动子研究方面展开了大量的工作,不仅克隆了数量丰富的启动子,而且对其结构和功能有了一定的认识.但从遗传信息到基因的表达是一个十分复杂的过程,还有许多问题有待解决.基因表达与否以及表达时间、表达部位需要启动子上的顺式作用元件与相应的转录因子的协同作用.从植物中已知的启动子分析,组织特异性及诱导型启动子的顺式作用元件有一定的保守性,如B-box是种子特异启动子的高度保守区[44],G-box通常受光敏色素A诱导,参与多种信号调节[45,46].而且,启动子驱动基因表达通常需要两种或两种以上的顺式元件,这些元件的种类、数量以及彼此之间的顺序与距离都可能影响基因的转录与否或转录程度.如果能发现其中的规律,将会对基因表达的调控取得突破性进展.另外,基因的特异性表达不仅包括在特定时期激活某些基因的表达,还涉及到在其他组织器官或发育时期抑制某些基因的表达,对抑制子的研究将使人们更好地理解基因表达的调控过程.根据需要选择或人工构建合适的启动子(组成型、组织器官特异性、诱导型或复合型启动子),不仅便于研究新基因的功能,阐明植物的生长、发育、分化及繁殖过程与机理,还可以在植物特定的部位或发育阶段生产有用蛋白质或其他代谢产物,以实现对外源基因表达的定时、定点、定量三维精确调控.人们已经尝试利用植物这个天然的生物反应器进行目标产物的商业化生产并初见成效[47].参考文献1Odell J T,et al.Identification of DNA sequences required for activ-ity of the cauliflower mosaic virus35S promoter.Nature,1985, 313:8102M itsuhara I,et al.Efficient promoter cassettes for enhanced ex pres-si on of foreign genes in di cotyledonous and monocotyledonous plants.Plant 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两种植物抗菌蛋白基因启动子克隆及功能分析的开
题报告
一、研究背景和意义
随着生物信息学和分子生物学的不断发展，植物抗菌蛋白作为重要
的抗菌防御分子，成为了研究热点。
启动子作为基因转录的起始部分，
在基因表达调控中扮演着重要的角色。
因此，研究植物抗菌蛋白基因启
动子的结构和功能，对于揭示植物抗菌蛋白的基因调控机制，从而进一
步理解植物对抗病菌的防御机制具有重要的意义。
二、研究内容和技术路线
本研究将以云南白药（Dioscorea cirrhosa）和小麦（Triticum aestivum）中的抗菌蛋白为研究对象，从两者的基因组中克隆出抗菌蛋
白基因的启动子区域，并进行基本序列分析和比较分析。
随后利用转录
组技术和荧光素酶报告基因系统，探究这两种植物抗菌蛋白基因启动子
的表达特点以及其响应不同生物刺激的表达模式。
最终，利用基因编辑
技术，对比分析抗菌蛋白基因启动子上的关键响应元件和整个启动子对
基因表达的影响，以此初步探究植物抗菌蛋白基因启动子的结构与功能。
三、预期创新点和成果
本研究将首次对云南白药和小麦中的抗菌蛋白基因启动子进行详细
的克隆、分析和比较，从而揭示抗菌蛋白基因表达的调控机制。
同时，
对抗菌蛋白基因启动子上的关键响应元件进行系统性分析，有望为进一
步植物抗病新材料的筛选和设计提供重要依据，推动植物对病原菌的抗
性研究取得新的进展。
基因启动子活性检测技术在克隆表达上的效果评估摘要：近年来，基因启动子活性检测技术在克隆表达研究中得到了广泛应用。
本文通过系统综述已有文献，并结合实验研究结果，评估了基因启动子活性检测技术在克隆表达上的效果。
研究发现，基因启动子活性检测技术可通过定量及定位分析启动子活性，从而提高克隆表达效率和精确性。
然而，在选择合适的启动子，优化实验条件和解读数据方面仍存在一些挑战和限制。
因此，进一步的研究和优化仍然需要进行。
引言：基因启动子是调控基因转录的关键序列。
准确评估基因启动子的活性对于克隆表达和基因功能研究具有重要意义。
传统的基因启动子活性检测方法存在一些局限性，如低灵敏度、低通量和复杂操作等。
近年来，随着新技术的出现，基因启动子活性检测在克隆表达研究中得到了广泛应用。
本文旨在评估基因启动子活性检测技术在克隆表达上的效果，为相关领域的研究提供参考和指导。
一、基因启动子活性检测技术的原理和方法1. 荧光素酶报告基因系统荧光素酶报告基因系统是一种常用的基因启动子活性检测方法。
它利用荧光素酶作为报告基因，通过测量其活性来反映启动子的活性水平。
这种方法具有高灵敏度、高通量和低背景的优点，被广泛应用于克隆表达研究。
2. 可视化报告基因系统可视化报告基因系统是另一种常用的基因启动子活性检测方法。
它利用可视化标记（如荧光蛋白和β-半乳糖苷酶等）作为报告基因，使启动子活性的检测结果可以直观地观察和分析。
可视化报告基因系统具有直观、快速和定量化分析的优点，在基因启动子活性检测中得到了广泛应用。
二、基因启动子活性检测技术在克隆表达中的应用1. 提高克隆表达效率通过基因启动子活性检测技术可以筛选出活性高的启动子，从而提高克隆表达效率。
研究发现，活性高的启动子与高表达水平存在正相关关系，选择合适的启动子可以显著提高克隆表达效果。
2. 精确调控克隆表达水平基因启动子活性检测技术可以定量分析启动子的活性水平，从而实现精确调控克隆表达水平。
桃遗传转化再生体系的建立及果实特异性基因E8启动子的克隆桃遗传转化再生体系的建立及果实特异性基因E8启动子的克隆引言：桃（Prunus persica）是一种重要的果树，其果实具有丰富的营养价值和良好的口感，因此备受消费者的喜爱。
然而，桃树的优良性状往往受到遗传性状的限制，限制了其育种和栽培的进展。
为了促进桃树的遗传改良，研究人员通过转基因技术进行了一系列的研究。
其中，克隆桃果实特异性基因E8的启动子，对于研究桃树果实发育的分子机制以及提高桃树的品质具有重要意义。
一、方法和材料1. 果实采集和处理：选择发育中的桃果实作为实验材料，采用无菌技术将果实表皮剥离并酶解，获得果皮细胞。
2. RNA提取与逆转录：从果皮细胞中提取总RNA，并通过逆转录反应合成cDNA。
3. 基因克隆和PCR：利用已知的桃基因序列设计引物，进行PCR扩增，并将扩增产物克隆入载体中。
4. 酶切分析：对克隆的启动子进行酶切分析，确定其正确性。
5. 再生体系的建立：选择优良品种的桃花萼为外植体，通过植物生理激素的处理以及培养基的优化，建立桃遗传转化再生体系。
二、结果1. 克隆桃果实特异性基因E8的启动子：通过PCR扩增和基因克隆技术，成功地克隆了桃果实特异性基因E8的启动子，并经酶切分析验证其正确性。
2. 桃遗传转化再生体系的建立：通过对外植体的选择和优化培养条件，成功地建立了桃遗传转化再生体系。
在激素处理的条件下，外植体发生了分化和再生。
三、讨论1. 桃果实特异性基因E8的启动子：桃果实发育过程中，基因的转录调控起着重要的作用。
克隆到E8启动子具有重要的意义，可以进一步研究桃果实发育的分子机制，为提高桃树的品质和产量提供理论依据。
2. 桃遗传转化再生体系的建立：桃遗传转化是进行基因功能研究和遗传改良的重要手段。
通过建立再生体系，可以实现介导引物的转入，将外源基因整合到桃树基因组中，进一步研究基因的功能以及对桃树性状的影响。
四、结论本研究通过克隆桃果实特异性基因E8的启动子和建立桃遗传转化再生体系，为进一步研究桃树果实发育的分子机制、提高桃树品质和推动桃树育种提供了有力的工具。
常用的几种启动子分析方法研究成果生物信息学的发展为在线软件预测基因启动子提供了众多有重要价值的参考信息，下面是搜集的一篇相关，欢迎阅读参考。
前言启动子作为RNA聚合酶和一些转录因子结合的靶序列，对转录起始有调节和控制作用，决定着基因表达过程的起始以及在什么条件下开始。
因此启动子的识别与分析是表达调控研究的前提和基础。
随着越来越多的原核和真核模式生物基因组测序完成，使得研究基因之间的相互作用关系进而构建表达调控网络已经成为可能。
而且启动子与结合蛋白的研究能够帮助我们寻找新的功能性蛋白质。
启动子分析对于构建基因工程载体，表达目的蛋白有着重要的意义。
如何查找并通过实验确定启动子序列是研究启动子功能的前提。
启动子分析大多是基于DNA和蛋白质相互作用的特性。
本文从原核和真核启动子的基本结构、分类入手，对常用的几种启动子分析方法，如生物信息学分析方法、酵母单杂交(Y1H)技术、瞬时转染法(TransientTransfection)、染色质免疫共沉淀(ChIP)技术、凝胶阻滞分析(EMSA)试验和DNA足纹(DNaseIfootprinting)分析法等，从原理、优缺点和最新应用等方面的研究进展作一综述，并对近年来出现的新技术新方法的应用前景进行展望，为启动子的结构与功能研究提供借鉴，以进一步促进这一领域研究工作的深入发展。
1启动子基本结构1.1原核生物启动子的结构模型原核生物启动子(Prokaryotepromoter)长度一般为20bp~200bp,细菌启动子常由四部分组成[1]:CAT序列，转录起始位点;Pribnow框，即转录起始位点.10位置，有一段共有序列TATAAT,是RNA聚合酶的结合位点，启动子的强度很大程度上是由这一序列的核苷酸构造所决定;Sextama框，位于.35区，其共有序列是TTGACA,是RNA聚合酶的识别位点;间隔区：两段长为6个核苷酸保守序列，被长为非特异性的17~19个核苷酸序列所分隔。
启动子的克隆与载体构建过程研究任务下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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启动子克隆方法研究进展随着基因工程的发展，常常需要构建一种能高水平表达异源蛋白质的表达载体。
启动子对外源基因的表达水平影响很大，是基因工程表达载体的重要元件。
因此研究启动子的克隆方法，对研究基因表达调控和构建表达载体至关重要。
迄今为止，国外尚未见到有关启动子克隆方法的综述性报道，国内仅孙晓红等曾就启动子的结构、分类、克隆方法和食用菌中已经分离到的启动子作过综述。
而近年来又有许多改进的克隆启动子的方法获得了多方面的成功，本文就近年来改进的启动子克隆方法作一综述，以期促进对启动子分离技术的应用。
1启动子克隆的几种方法1.1利用启动子探针载体筛选启动子启动子探针型载体是一种有效、经济、快速分离基因启动子的工具型载体，包含2个基本部分：转化单元和检测单元。
其中，转化单元含复制起点和抗生素抗性基因，用于选择被转化的细胞；检测单元则包括1个已失去转录功能且易于检测的遗传标记基因以及克隆位点。
利用启动子探针载体筛选启动子的过程为，先选用1种适当的限制性核酸内切酶消化切割染色体DNA，然后将切割产生的DNA限制片段群体与无启动子的探针质粒载体重组，并按照设计的要求使克隆的片段恰好插在紧邻报告基因的上游位置；随后再把重组混合物转化给寄主细胞，构建质粒载体基因文库，并检测报告基因的表达活性。
当插入段同时满足(1)具有基因启动子序列；(2)具有翻译启始区；(3)具有启始密码子；(4)插入方向正确；(5)插入片段3'端编码区序列抗性基因编码区读码框一致，则有可能形成有功能的抗性融合基因，从而启动抗性基因的表达。
最早由Rachael等在大肠杆菌中以四环素抗性基因作为报告基因构建了启动子探针质粒pBRH3B，并克隆了一些原核和真核启动子片段。
其后Donna等以氯霉素抗性基因作为报告基因，Fodor等以大肠杆菌LacZ为报告基因，构建了酵母启动子探针质粒并克隆了一些启动子片段。
构建启动子探针型载体，较为常见的检测标记基因有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、四环素抗性基因(Tet')和卡那霉素抗性基因(Kan')。
近年来，人们渐渐较多地使用潮霉素B磷酸转移酶(hph)基因作为检测标记基因。
李维等曾构建了含有hph抗性基因的启动子探针型载体pSUPV8，直接在大肠杆菌中分离黄孢原毛平革菌基因的启动子。
先用Sau3AI酶切黄孢原毛平革菌基因总DNA，再与用BamHI酶切后的pSUPV8相连，转化大肠杆菌，用间接筛选法从氨苄青霉素和潮霉素抗性平板上筛选重组子，得到6个双抗重组子(pCH1～pCH6)，电泳检测插入片段分别命名为CHl～CH6；再用原生质体转化法将重组子分别转化黄孢原毛平革菌，对获得的转化子进行复筛，仅pCH6的转化平板上有稳定生长的菌落，说明了CH6片段在黄孢原毛平革菌中具有启动基因表达的功能。
该方法不需要知道具体基因的序列，可随机筛选启动子，避免了引物设计，能获得大量的启动子片段。
1.2利用PCR技术克隆启动子即根据发表的基因序列，设计引物，克隆基因的启动子，由于PCR法简便快捷，近年来人们较多采用此方法克隆基因启动子。
苏宁等根据已报道的水稻叶绿体16SrRNA启动子基因序列设计5'启动子序列的引物，以水稻叶绿体DNA为模板，PCR扩增出16SrRNA基因5'启动子区的片段，酶切克隆到pSK的SacI和SphI位点，构建测序载体质粒pZ16S，进行序列测定，结果表明所克隆的片段长为144bp，含有SD序列。
同源比较结果表明，所克隆的片段与水稻叶绿体16SrRNA启动子序列具有100％的同源性。
上述的PCR方法简便、快捷、操作简单，是人们较为广泛使用的技术。
1.3环状PCR环状PCR包括I-PCR(Inverse-PCR)和P-PCR(Panhandle-PCR)。
这2种PCR都是根据一端已知序列设计的嵌套式引物进行PCR。
1.3.1I-PCR I-PCR是1988年由Triglia最早提出的一种基于PCR的改进的染色体步行方法。
I-PCR的实验程序包括，基因组DNA经酶切后用T4DNA连接酶进行自连接，产生环状DNA片段；以环化产物为底物，用根据已知片段设计的反向引物进行PCR扩增，从而得到含有未知片段的扩增产物(流程如图1所示)。
韩志勇等以I-PCR技术为基础克隆了转基因水稻的外源基因旁侧序列。
先用小量法提取转基因水稻的总DNA，总DNA用10倍过量的限制内切酶进行过夜酶切，酶切片段进行自连接，然后根据工程质粒的T-DNA区设计2对反向引物，进行套式PCR扩增旁侧序列。
建立了适合于处理大量材料的克隆转基因水稻中外源基因旁侧序列的技术体系。
在1周内克隆了35个转基因水稻株系中外源基因的旁侧序列，长度在300～750bp之间。
I-PCR法快速、高效、稳定，操作相对简单，花费少，PCR引物设计比较方便。
1.3.2P-PCR P-PCR是由Jones等提出的利用末端反向重复序列与已知序列互补配对形成环状单链模板，有效增强了引物与模板结合的特异性。
反应需要3个根据已知序列设计的引物，3个引物在已知序列内呈线性排列，其中第3个引物可作为接头使用，可与已知序列互补配对形成锅柄状单链模板。
其过程为，首先酶切基因组DNA，产生5'或3'粘末端，然后连接上合适的接头(primer 3)，连接好后最好用核酸外切酶I除去多余的接头，由于连接上的接头与已知序列是反向重复序列，变性后的DNA单链可退火形成锅柄状单链模板，之后分别用3个单引物进行3次PCR扩增，能有效地扩增2～9kbp的大片段未知序列(流程如图2所示)。
黄君健等成功地应用P-PCR技术从正常的人外周血单核细胞基因组DNA中扩增端粒催化亚基hTERT基因5'端上游旁侧序列，获得了hTERT基因翻译启始位点上游2090bp的基因组DNA序列。
首先用酶切消化基因组DNA，得到带有GATC的5'突出端的DNA片段。
然后利用已知的hTERTcDNA序列设计PCR引物，用常规的PCR方法扩增出1条大约900bp的基因组特异片段，序列分析为hTERT的基因组DNA片段。
根据得到的基因组DNA序列的信息，确定P-PCR的引物退火区，并合成了5'磷酸化的连接寡核苷酸和4条基因特异性引物，其中连接寡核苷酸5'端的4个碱基CTAG与上述核酸内切酶消化产生的5'突出端GATC互补，然后将连接寡核苷酸与基因组酶切产物连接，以连接产物为反应模板，进行PCR，使模板自身进行退火-延伸反应，以形成Panhandle结构。
最后以单链Panhandle为模板，4条基因特异序列为引物进行嵌套式PCR，最终获得了1条约2kb的含hTERT基因启动子的DNA片段。
Jones等利用改进的P-PCR，在形成panhandle结构之前3'末端连上ddCTP，使引物错配的机率减少，特异性增加。
他们从人类基因组DNA已知位点侧翼扩增了4～9kb的大片段未知序列。
P-PCR是目前能够扩增距已知序列最远的未知DNA序列的方法，有很高的特异性。
1.4利用载体或接头的染色体步行技术克隆基因启动子这类方法的第一步都是酶切基因组DNA，连接载体或接头，既可以用pUCl8等质粒载体，也可以使用λDNA 等噬菌体载体，只要选用的载体带有合适的酶切位点；同样根据实验需要，接头既可以是双链也可以是单链，然后根据基因组DNA序列设计的特异引物和载体的通用引物或接头序列进行扩增。
1.4.1利用载体的PCR Shyamala等利用的单特异性引物PCR(SSP-PCR)对以小鼠伤寒杆菌组氨酸转运操纵子为起点进行连续步行。
以M13mpl8RF DNA为载体。
用PstI和AraI酶切基因组DNA，PstI和XmaI酶切载体DNA，然后连接基因组片段和载体片段，用根据基因组DNA序列设计的特异引物和载体的通用引物进行扩增，由于非特异片段没有单特异引物结合的位点，即使有载体连到非特异片段，也无法得到大量扩增，而使特异片段得到有效扩增。
1.4.2利用接头的PCR王新国等利用衔接头的方法，设计了位于单链DNA两端互补的颠倒末端重复序列，增加了反应的特异性，在胡萝卜II型转化酶基因启动子的克隆方面取得了新的进展。
首先将胡萝卜基因组DNA分别用PvuI、SmaI、DraI、EcoRV酶切，并设计了1个衔接头长链序列和1个衔接头短链序列，并在衔接头短链的3'末端带有1个氨基的衔接头，能够阻止聚合酶催化的衔接头短链的延伸，同时衔接头的长链和短链之间是反向重复序列。
将酶切片段与此衔接头连接，取连接产物做模板，以衔接头引物和基因特异引物做PCR，在首轮PCR中只有限定的远端基因特异引物有结合位点，当基因特异引物延伸产生的DNA链通过衔接头时，才能产生衔接头引物的结合位点，PCR才能以衔接头引物和基因特异引物进行指数扩增。
而另一方面，如果非特异合成产生了DNA两端都有双链衔接头序列的PCR产物时，这种PCR产物在每次变性后，单链DNA末端的衔接头反向重复序列将形成锅柄结构，此结构比引物-模板杂交更稳定，能抑制非特异序列的指数增长。
最后得到主要的PCR产物为3.4kb、1.3kb、0.6kb和0.4kb。
将EcoR V-衔接头体系的PCR产物克隆、测序、同源性比较，得到1个新的胡萝卜II型转化酶基因启动子序列，它含有类似于TATA box和CAAT box的元件，在启动子的远上游区域含多个AT富含区，该启动子的发现对于研究植物中的糖代谢具有重要的意义。
接头引物的相对位置如图3所示。
这种方法具有便于操作、实验线路简单的优点，但是特异性较差，产物需进一步杂交验证。
1.5YADE法Prashar等在扩增cDNA3'端时采用“Y”形接头，以减少接头引物的单引物扩增。
其原理是接头引物处于“Y”接头的2个分叉单链上，序列与接头一样，只有与特异引物引导合成了接头的互补序列后，接头引物才能退火参与扩增，流程如图4。
方卫国等尝试将YADE法引入到昆虫病原真菌的分子生物学研究，并取得了成功，建立了适合于球孢白僵菌和金龟子绿僵菌YADE体系。
在已克隆的类球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1的基础上，利用YADE法，克隆到该基因的启动子CDEPP。
先酶切球孢白僵菌基因组DNA，然后与“Y”形接头相连，取连接产物做模板，先以基因特异引物1做线性扩增，再以线性扩增产物为模板，以接头引物和基因特异引物2做指数扩增，只有当线性扩增时合成了含有接头引物的互补单链，接头引物才能与其发生退火，参与指数扩增，从而有效防止了接头引物的单引物扩增。
最后得PCR产物，进行序列分析确定为CDEP-1的上游启动子序列。
