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极端嗜盐古菌遗传转化系统的研究
周梅先;向华;谭华荣
【期刊名称】《生物工程学报》
【年(卷),期】2002(018)003
【摘要】对极端嗜盐古菌遗传转化系统的研究进展进行了综述,内容包括抗性标记基因的选择,基因克隆和表达载体系统的发展以及受体系统的改造.
【总页数】5页(P267-271)
【作者】周梅先;向华;谭华荣
【作者单位】中国科学院微生物研究所,北京,100080;中国科学院微生物研究所,北京,100080;中国科学院微生物研究所,北京,100080
【正文语种】中文
【中图分类】Q933
【相关文献】
1.极端嗜盐古菌嗜盐特性研究及在废水处理中的应用 [J], 李晓琳;邵坚;田秉晖;辛丽花
2.极端嗜盐古菌TRM 51T的多相分类研究 [J], 任敏;歹明辉;夏占峰
3.测定极端嗜盐古菌保持完整细胞形态最低NaCl浓度研究方法探析 [J], 陈绍兴;梁敏;费宗伟;谢志雄
4.云南黑井古盐矿可培养极端嗜盐古菌初步研究 [J], 田新朋;张玉琴;唐蜀昆;李文均;徐丽华;姜成林
5.极端嗜盐古菌分类学研究进展 [J], 王爽;杨谦;孙磊;王允;刘丹
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·研究报告·生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2013年第9期枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性细菌，细胞壁不含内毒素，是一些重要工业酶制剂的生产菌。
作为表达系统，枯草芽孢杆菌因其不含内毒素、高效的分泌能力、易于高密度发酵等优势被广泛研究。
枯草杆菌表达载体pWB980是Wu 等［1］于1999年基于pUB110改造构建而得，该质粒具有P43强组成型启动子和改造了的果聚糖蔗糖酶信号肽，在枯草杆菌中复制赋予宿主卡那霉素抗性，该载体自构建后被成功应用于多种功能基因的分泌表达［2-4］。
pWB980没有大肠杆菌复制子，因而外源基因克隆操作只能在枯草杆菌中进行。
而枯草杆菌的转化步骤繁琐，且转化效率相对较低，构建大肠杆菌-枯草杆菌的穿收稿日期：2013-03-22基金项目：国家“973”计划项目（2010CB833804），国家“863”计划项目（2012AA092104），海洋公益性行业科研专项（201305018）作者简介：杨键，男，博士研究生，研究方向：海洋微生物酶工程；E -mail ：yangjian@ 通讯作者：张偲，男，研究员，博士生导师，研究方向：海洋生物学；E -mail ：zhsmid@大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体的构建及其在蛋白酶基因表达中的应用杨键1，2 游志庆1，2 麦志茂1，2 李洁1 田新朋1 张偲1，2（1.中国科学院南海海洋研究所 中国科学院海洋生物资源可持续利用重点实验室，广州 510301；2.中国科学院研究生院，北京 100049）摘 要： 利用基因重组技术，以枯草杆菌表达载体pWB980为骨架，插入大肠杆菌的克隆载体pUC18中的抗性基因和复制子，构建穿梭质粒pY980coli。
将海洋细菌蛋白酶基因hspa 插入pY980coli 载体P43启动子下游，导入枯草杆菌WB600中，可实现活性表达。
关键词： 穿梭载体 P43启动子 枯草芽孢杆菌表达系统 蛋白酶 分泌表达Construction of a Versatile Escherichia coli -Bacillus subtilis ShuttleVector and Its Application in Protease Gene ExpressionYang Jian 1，2 You Zhiqing 1，2 Mai Zhimao 1，2 Li Jie 1 Tian Xinpeng 1 Zhang Si 1，2（1. Key Laboratory of Marine Bio -resources Sustainable Utilization ，South China Sea Institute of Oceanology ，Chinese Academy of Sciences ，Guangzhou 510301；2. Graduate University of the Chinese Academy of Sciences ，Beijing 100049）Abstract: A versatile Escherichia coli -Bacillus subtilis shuttle vector pY980coli was constructed by genetic recombination. Resistance gene and replicon of pUC18, a cloning vector for Escherichia coli , were integtated into the Bacillus subtilis expression plasmid pWB980. Protease gene hspa from a marine bacterium was then inserted under P43 promoter of pY980coli, and the recombinant vector was transformed into Bacillus subtilis WB600. Protease activity was detected in the fermentation broth.Key words: Shuttle vector P43 promoter Bacillus subtilis expression system Protease Secretory expression梭载体会使其更易于操作。
1株中度嗜盐菌质粒基因组文库的构建及2个膜蛋白基因的克隆和序列分析朱文华;董冠群;滕长财;侯娟;吕彦;孙业盈【摘要】中度嗜盐菌是生活在高盐环境中的微生物,以1株从蜢子虾酱中分离的中度嗜盐菌盐脱氮枝芽胞杆菌(Virgibacillus halodenitrificans)为研究对象,通过酶切,筛选DNA片段然后连接pUC19载体并转化大肠埃希菌,构建了该菌株的质粒基因组文库,推测可获得5×103个阳性克隆,覆盖约15 Mb的遗传信息.随机选取部分克隆进行测序,在测序结果中筛选到了2个具有完整ORF的膜蛋白基因分别为编码Na+H+逆向转运蛋白的NhaC基因,编码一离子通道蛋白的MscS基因,GenBank 登陆号分别为JX849200、JX849202.其中NhaC基因ORF全长为1 446 bp,编码481个氨基酸,包括10个跨膜结构域；MscS基因的全长ORF为822 bp,编码273个氨基酸的蛋白质,包括3个跨膜区,与其他菌种的序列比对表明第3个跨膜区保守性最强.%Moderately halophilic bacteria are microorganism living in high salt environment. A moderately halophilic bacteria Virgibacillus halodenitrijicans was separated from a shrimp paste as research object. Plasmid genomic library of the strain was constructed. DNA fragments were selected after genomic DNA digestion by restriction enzyme, and then were linked with pUC19 vector and transformed into E. coli to construct the plasmid genomic library of the strain. It was speculated that about 5 × 103 positive clones were obtained, covering abo ut 15 Mb of genetic information. Part of the clones was selected to carry out sequencing. From the sequencing results two membrane protein genes possessing complete ORF respectively encoding NhaC gene of Na+ H +reverse transporter protein, MscS genes of encoding an ion channel protein were screened. The CenBank accession numbers of the two genes were JX849200, JX849202 respectively. Among them the NhaC gene was 1 446 bp length ORF, encoded 481 amino acids, including 10 transmem-brane domains. MscS gene had 822 bp length ORF, encoded a protein of 273 amino acids, including 3 transmembrane domains. The sequence comparison analysis with other strain seeds indicated that the third transmembrane domain' s conservativeness was the strongest.【期刊名称】《微生物学杂志》【年(卷),期】2012(032)006【总页数】5页(P18-22)【关键词】盐脱氮枝芽胞杆菌;Na+H+逆向转运蛋白;MscS基因【作者】朱文华;董冠群;滕长财;侯娟;吕彦;孙业盈【作者单位】滨州医学院药学院,山东烟台264003;滨州医学院药学院,山东烟台264003;滨州医学院药学院,山东烟台264003;滨州医学院药学院,山东烟台264003;烟台大学生命科学学院,山东烟台264005;滨州医学院药学院,山东烟台264003【正文语种】中文【中图分类】Q78中度嗜盐菌(modrately halophilic bacteria)近年来正受到越来越多的重视，与此相关的中度嗜盐菌的分离，鉴定，基因组学研究以及耐盐机理的研究也日益广泛和深入。
![一种新型嗜热核酸内切酶突变体及其制备方法和应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/6a1448226d175f0e7cd184254b35eefdc8d3159c.png)
(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202210239388.5(22)申请日 2022.03.11(71)申请人 上海交通大学地址 200240 上海市闵行区东川路800号申请人 交弘生物科技（上海）有限公司(72)发明人 冯雁 陆慧 刘倩 徐河山 郭翔 叶星宇 (74)专利代理机构 上海一平知识产权代理有限公司 31266专利代理师 徐迅 崔佳佳(51)Int.Cl.C12N 9/22(2006.01)C12Q 1/6806(2018.01)(54)发明名称一种新型嗜热核酸内切酶突变体及其制备方法和应用(57)摘要本发明提供了嗜热核酸酶A r g o n a u t e(PfAgo)蛋白的突变体及其制备方法和应用。
本发明所述Ago突变体的酶催化活性较野生型显著提高，具有更好的高温热稳定性，并且突变体在靶标DNA底物选择性上对于野生和突变碱基具有更好的区分能力，这提高了其在核酸检测技术领域中的应用潜力，同时也为开发新的基因操作工具奠定了基础。
权利要求书3页 说明书24页序列表4页 附图5页CN 114561374 A 2022.05.31C N 114561374A1.一种嗜热核酸酶Argonaute(Ago)突变蛋白，其特征在于，所述Ago突变蛋白具有选自下组的一个或多个位点的核心氨基酸突变：(Z1)I656Y/S/C(Z2)Y743L/M/F；和/或(Z3)I569S/T/C/Y；其中，所述突变位点的编号基于SEQ ID NO:1所示的序列；并且所述Ago突变蛋白具有定向剪切单链DNA靶标的活性。
2.如权利要求1所述的Ago突变蛋白，其特征在于，所述Ago突变蛋白具有选自以下位点的双重核心氨基酸突变：I656Y和Y743L；I656S和I569C；I656Y和F769R；Y743M和F747P；I659Y和L626N；Y743L和I569S；F747W和F769Y；A573K和F769R；A573H和F747I；I569Y和Y743F；I569Y和F747W；Y743F和L626V；I569Y和L626V；Y743F和F747W；或L626V和F747W，其中，所述突变位点的编号基于SEQ ID NO:1。
![一种穿梭质粒及构建方法及其在集胞藻转化外源基因中的应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/2da209f36bd97f192379e991.png)
专利名称：一种穿梭质粒及构建方法及其在集胞藻转化外源基因中的应用
专利类型：发明专利
发明人：戴玉杰,孟庆营,陈高,宁玉林,赵潇潇,邵强,吕和鑫,谭之磊,贾士儒
申请号：CN201910960728.1
申请日：20191010
公开号：CN112646831A
公开日：
20210413
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种利用Kana启动子分别启动Kana抗性基因和目的基因的穿梭质粒及其在集胞藻转化外源基因中的应用。
该质粒利用集胞藻PCC6803的psbA2基因启始密码子ATG前510bp片段作为同源重组上游臂，以psbA2基因ORF片段为同源重组下游臂基础上，在Kana抗性基因与终止子之间再插入Kana抗性基因启动子(Kana基因启始密码子ATG前174bp)以及目的基因获得穿梭质粒P5ST1T2KAN，利用Kana启动子分别启动Kana抗性基因和目的基因及在集胞藻中的表达。
同时，本发明以上述穿梭质粒为载体，构建了以Kana基因启动子启动纤维素酶CelI15基因表达的集胞藻PCC6803工程藻株PSCE15，实现了利用Kana启动子分别启动Kana抗性基因和纤维素酶CelI15以及纤维素酶CelI15在集胞藻PCC6803中的异源表达。
申请人：天津科技大学
地址：300457 天津市滨海新区第十三大街9号
国籍：CN
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嗜热微生物中天然质粒的筛选、鉴定与穿梭载体的构建-微生物学专业毕业论文摘要嗜热菌是指一类能够在55℃以上温度下正常生长和繁殖的细菌群体。
本研究以来源于腾冲温泉中的天然菌样为研究对象，从中筛选出含有天然质粒的嗜热菌株，对筛选出的天然质粒进行测序和分析，并利用生化及分子的方法鉴定该含有天然质粒的嗜热菌株。
同时对本实验室构建的高效热激表达载体 pHsh 进行改造，为进一步构建穿梭质粒奠定基础。
本文利用高温下平板筛选的方法获得嗜热菌株，进一步将各个单菌落分别点样，以SDS蛋白上样缓冲液破细胞的方法破除细胞壁，所得样品进行凝胶电泳，获得1株带有天然质粒的嗜热菌，该天然质粒琼脂糖凝胶电泳大小约为7．9 kb。
对该菌株进行革兰氏染色及芽孢染色，初步确定为革兰氏阳性的芽孢杆菌。
随后分别用几种常用限制性内切酶对质粒进行酶切，将酶切所得片段分别克隆至pUCl9上，测序结果与NCBI比对，发现其与地衣芽孢杆菌(Bacilluslichenifo册括)中发现的天然质粒pFL7、pFL5具有相当高的同源性。
继而对宿主菌进行16S rDNA克隆测序，比对得到相同的结果。
为进一步确定宿主菌株，对其进行了BIOLOG微平板系统检测，检测结果表明该宿主菌株为热葡糖苷酶芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)。
通过分时取样测OD的方法分别测定该宿主菌在高温区间(45～62℃)和低温区间(30,--,45"C)各温度梯度的生长曲●线，得知在高温区间，其在53℃有最大OD值，而在56℃有较长的平稳期，并且倍增时间最短；在低温区间，其在37℃有最大OD值，并且倍增时间最短，而在30℃有较长的延滞期。
本文通过PCR扩增相同大小特异性片段的方法，以基因组上特异基因为对照，粗略估计筛选到的天然质粒拷贝数，结果证明该天然质粒在细胞中仅存在2--'-3个拷贝，为低拷贝质粒。
结合DNA分析软件，根据NCBI已经公布的地衣芽孢杆菌(Bacillus lichenifo朋括)中发现的天然质粒pFL7的序列设计PCR引物，以筛选到的天然质粒为模板分段PCR，将PCR产物克隆至pHsh载体上，通过测序获得该天然质粒的全基因序列。
巨噬细胞特异性表达载体的构建及鉴定李晓缘;尹洪超【摘要】目的构建巨噬细胞特异性白喉毒素受体过表达载体并检测其在巨噬细胞中的表达情况.方法将白喉毒素受体基因Hbegf克隆入pcDNA3.1载体中扩增Hbegf与BGHpolyA尾片段,与克隆入pUCm-T载体中的巨噬细胞特异性启动子相连接,分别转染巨噬细胞与其他细胞,通过荧光定量PCR鉴定其表达情况.结果特异性表达载体通过测序以及酶切鉴定构建成功,在巨噬细胞中的表达高于未转染的巨噬细胞以及转染的非巨噬细胞.结论构建了巨噬细胞特异性表达人白喉毒素受体载体,瞬时转染后可在巨噬细胞中特异性表达白喉毒素受体,为动脉粥样硬化易损性斑块的建立以及斑块内与凋亡相关的其他研究提供了一定依据.【期刊名称】《医学研究杂志》【年(卷),期】2018(047)011【总页数】4页(P29-32)【关键词】pUCm-T载体;pcDNA3.1载体;人白喉毒素受体;细胞凋亡;动脉粥样硬化【作者】李晓缘;尹洪超【作者单位】81670430 中国医学科学院/北京协和医学院基础医学研究所病理系;81670430 中国医学科学院/北京协和医学院基础医学研究所病理系【正文语种】中文【中图分类】Q782白喉毒素(DT)是白喉杆菌产生的细菌外毒素，由535个氨基酸组成，相对分子质量为62000[1,2]。
它通过阻止延长因子2在核糖体内促进多肽链延长而抑制蛋白质合成造成细胞死亡，具有极强的细胞毒性[2]。
白喉毒素受体广泛分布于哺乳动物细胞表面，但是只有人类与少数灵长类动物体内的白喉毒素受体才对白喉毒素具有敏感度，有研究证明，白喉毒素无法对小鼠细胞产生作用[3]。
所以可以通过将人类的白喉毒素转移到小鼠细胞表面，实现白喉毒素诱导小鼠细胞凋亡的目的。
清道夫受体(scavenger receptor，SR)是一类主要位于巨噬细胞表面的糖蛋白，至少存在5种不同类型即SR-A、CD36、SR-C、CD68和LOX-1。
Re search Paper研究报告微生物学报Acta Microbiologica Sinica 49(8):1040-1047;4August 2009ISS N 0001-6209;C N 11-1995ΠQ http :ΠΠ Πactamicrocn基金项目:国家自然科学基金(30671141);国家“863计划”(2006AA09Z 401)3通信作者。
T el ΠFax :+86210264807472;E 2mail :xiangh @作者简介:苗荻(1983-),女,北京人,硕士研究生,主要从事微生物分子遗传学研究。
E 2mail :miaous @1631com 收稿日期:2009203216;修回日期:2009204203极端嗜盐古菌质粒pSCM201衍生穿梭表达载体的构建及应用苗荻,孙超岷,向华3(中国科学院微生物研究所,微生物资源前期开发国家重点实验室,北京 100101)摘要:【目的】利用有自主知识产权的嗜盐古菌θ型复制质粒和启动子,构建在极端嗜盐古菌模式菌株西班牙盐盒菌(Haloarcula hispanica )中方便使用、功能完善的基因表达载体。
【方法】以pSC M201的最小复制子为基础,通过引入莫维诺林抗性基因,大肠杆菌质粒复制子以及氨苄抗性基因,构建了一个新的嗜盐古菌2大肠杆菌穿梭载体。
利用定点突变和末端补平法依次将其中多余的酶切位点去除后,再添加hsp 5启动子核心序列、人工合成的多克隆位点以及蛋白纯化标签His ・T ag 等重要元件成功构建了嗜盐古菌表达载体pSC M307。
将报告基因bgaH 插入到该载体的多克隆位点中并转化H .hispanica AS2049,通过X 2gal 平板筛选和β2半乳糖苷酶酶活实验检测pSC M307的表达能力。
【结果】pSC M307具有独立的自主复制能力,其多克隆位点方便实用,报告基因bgaH 在hsp 5启动子控制下实现了高效表达。
【结论】成功构建了嗜盐古菌领域中第一个方便使用的基因表达载体。
关键词:嗜盐古菌;pSC M201;穿梭载体;表达载体中图分类号:Q933 文献标识码:A 文章编号:000126209(2009)0821040208 极端嗜盐古菌相对于其他古菌来说,易于实验室培养及遗传转化,因此已成为研究古菌生命机制最重要的材料之一[1]。
嗜盐古菌富含质粒,在某些菌株中各类质粒可占宿主菌DNA 总量的25%[2],这就为我们构建多样化的载体系统奠定了基础。
加之PEG 介导的原生质体转化方法的建立[3]以及莫维诺林(mevinolin ,Mev )等抗生素抗性选择标记基因的鉴定[4],都相应地推动了极端嗜盐古菌遗传操作系统的逐步完善,促进了嗜盐古菌在分子生物学领域的快速发展。
在已描述的一些极端嗜盐古菌质粒中,其复制方式可以分为两类,一类是滚环型质粒,如pNB101、pZ MX 201[5]等;另一类如pH V2、pHH1等,被推测可能属于θ型复制[2],但都没有直接的实验证据证明。
以这些质粒为基础,已发展了一系列的克隆载体,这些载体均含有极端嗜盐古菌质粒复制子,大肠杆菌质粒复制子以及用于在极端嗜盐古菌和大肠杆菌中筛选转化子的抗性选择标记。
例如pH V2和pHH1就分别被用于构建了目前在嗜盐古菌中普遍使用的穿梭克隆载体pW L102[6]和pUBP2[7]。
将极端嗜盐古菌的克隆载体与极端嗜盐古菌特殊的启动子及其他一些表达调控元件加以组合可构建成表达载体,实现基因的同源或异源表达,以进行基因功能的分析鉴定。
目前,已经有来自盐杆菌属(Halobacterium sp.)的细菌视蛋白基因bop 启动子[8]、来自盐沼盐杆菌(Halobacterium salinarium )的铁氧还蛋白基因启动子[9]以及来自沃氏富盐菌(Halo ferax volcanii )的tRNA 基因启动子[10]等被用于嗜盐古菌基因表达的研究,但是成熟的表达载体仍未见报道。
最近,本实验室的孙超岷博士从盐盒菌属Haloarcula sp.AS7094中分离测序了一个新质粒pSC M201,通过透射电镜分析和复制起点作图等方法,证明该质粒为单向θ复制型质粒,并确定了其最小复制子和精确的复制起始位点[11]。
pSC M201的最小复制子为118kb,包括复制起点ori201以及推测的复制蛋白基因rep201,并且通过质粒稳定性实验证明该复制子的稳定性非常好[12]。
本文的研究工作就是在pSC M201这些遗传特性和研究进展的基础上,对其加以改造和完善,构建一个相对成熟的极端嗜盐古菌专用的基因表达载体。
1 材料和方法111 材料11111 菌株和质粒:极端嗜盐古菌Haloarcula sp. AS7094为pSC M201的天然宿主,采用AS2168培养基于37℃培养[13]。
Haloarcula hispanica AS2049为衍生载体的转化宿主,同样采用AS2168培养基于37℃培养;在需要时添加终浓度为5μgΠm L的莫维诺林作为抗性选择[13]。
大肠杆菌(E scherichia coli)JM109为基因克隆的宿主,采用LB培养基于37℃培养[14];在需要时添加终浓度为100μgΠm L的氨苄青霉素作为抗性选择。
pUCmT载体是购自上海生工的pUCm2 T经平滑化后自身环化成的复制形式[11]。
质粒pW L102为莫维诺林抗性基因(Mev r)的来源;质粒pNP22[15]为bgaH基因的来源。
其他的中间衍生载体产物见表1。
11112 引物:本文涉及的所有引物见表2。
11113 主要试剂和仪器:常用的缓冲液均按照文献表1 本文所涉及的质粒T able1 The plasmids used in this studyPlasmids Relevant features References or s ources pW L1021015kb shuttle vector;Am p r,M ev r Lam et al.,1990pMI101615kb remaining part of pW L102,from which pH V2ori and Hin dⅢsite were rem oved;Am p r,M ev rThis w orkpMI102The E.coli replicon of pMI101was replaced with Eco RⅠ2SphⅠfragment from pUCmT;Am p r,M ev rThis w orkpMI103Hin dⅢsite was rem oved from pMI102;Am p r,M ev r This w orkpMI104NdeⅠsite was rem oved from pMI103;Am p r,M ev r This w orkpSC M301The1985bp pSC M201minimal replicon digested by Eco RⅠand K pnⅠwas inserted intopMI104;Am p r,M ev rThis w orkpSC M302Hin d site was rem oved from pSC M301;Am p r,M ev r This w orkpSC M303ClaⅠsite was rem oved from pSC M302;Am p r,M ev r This w orkpSC M307The144bp fragment including Phsp5,MCS and H is・T ag was inserted into pSC M303;Am p r,M ev rThis w orkpSC M3072bgaH The1992bp PCR product of bgaH gene digested by Bam HⅠand Hin dⅢwas inserted intopSC M307;Am p r,M ev rThis w ork表2 本文所涉及的引物T able2 The primers used in this studyPrimers DNA sequences(5′→3′)Restriction sites or mutation sites 218NF ACGG T ACCCG AG AAG CAG CAAG T AG C K pnⅠ209NR CTG AATTCCCAG ACGG AACCACCATC Eco RⅠH A2TF G AATCGGG CAG T AG AA T G CTTCTG AG TTTCGG A in Hin dⅢreplaced with TH A2TR CCG AAACTCAG AAG C A TTCT ACTG CCCG ATTC T in Hin dⅢreplaced with ACT6CF TCACCCGG T AT ATCG A C G CCAG CCCACACT AT T in ClaⅠreplaced with CCT6CR AT AG TG TGGG CTGG C G TCG AT AT ACCGGG TG A A in ClaⅠreplaced with GBgaHF ACGG ATCCATG ACAG TTGG TG TCTG CT ATT Bam HⅠBgaHR G TCAAG CTTTCACTCGG ACG CG AG TC Hin dⅢThe normal restriction sites are underlined.The mutated restriction sites are shown with dotted lines.The alternative nucleotides in mutated sites are boxed.[4]中的相关要求进行配制。
常用限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Ex Taq DNA聚合酶、T4DNA聚合酶等购自T aK aRa公司。
DpnⅠ购自NE B公司。
K OD2 plus DNA聚合酶购自T oY oBo公司,经该酶扩增出的PCR产物为平末端。
DMS O购自Sigma公司。
RNaseA、52溴242氯232吲哚2β2D2半乳糖苷(X2gal)购自欣经科公司。
T2G radient96PCR仪购自Biometra公司;紫外Π可见分光光度计DU800购自贝克曼库尔特1401苗荻等:极端嗜盐古菌质粒pSC M201衍生穿梭表达载体的构建及应用.Π微生物学报(2009)49(8)(中国)公司。
双链DNA合成由北京擎科公司完成。
