主题词：@生物样品/分析；@生物样品分析/药代动力学
分类号：R912.1；R927.2
文献标识码：A
无论在临床药理、药物作用机理研究或新药开发研究，药物代谢动力学越来越显示出其重要性和必要性。药物代谢动力学研究获得的资料最终能否用于临床实践或药物研究结果的说明和解释，取决于研究方案和生物样品分析方法的设计和实施。
应用于化学药品及天然药物有效成分(包括中药和中药复方)分离、检测的方法和技术已有大量文献资料和研究报导，尤其是一些新技术、新方法的应用，使分析和检测手段越来越快捷、准确。然而应用于药物代谢动力学研究的生物样品分析方法，除正确设计和精心实施外，尚应包括了解该方法的特性及其限制因素。方法的特性包括被测物在体液中的稳定性，分析测试方法的灵敏度，选择性，萃取过程的回收率，定量计算的线性关系，工作曲线，以及方法的精密度和准确度。
1 方法学验证
1.1 稳定性
从生物样品(体液)的收集到样品的分析完成，样品中的待测药物(有效成分)必须是稳定的。否则将导致易变的回收率并降低测定的准确度和精密度。在分析方法建立的过程中，应了解待测成分(药物)在不同的pH、光照等情况下的稳定性，同时也应了解、考察生物样品及分析操作过程中待测成分的稳定性。这一点对中药药代动力学的研究来说应特别注意，因为除待测的有效活性成分外，中药中尚有许多未知成分，在不同的环境和条件下，这些成分与待测成分的相互作用，可能导致待测成分“量”和/或“质”的改变。
体液中药物稳定性的考察应包括在室温和储藏温度(-20℃或-80℃)两种情况的研究。如发现有明显的降解，则应采取特殊措施来防止。(如尿液中加甲苯以抑制细菌生长，含三硝基甘油血清中添加少量硝酸银抑制三硝基甘油的降低等)。如要了解较长时间的储藏对药物稳定性的影响，一般是制备与分析样品含有相同药物(成分)和代谢物的对照样品，两者作平行处理，从对照样品的分析结果可判断药物稳定性的情况。
1.2 灵敏度
分析方法灵敏度的要求取决于药代动力学研究时所用药物的剂量，给药次数及药物在体内的吸收、分布、代谢和消除等特征。临床前或临床(药理)资料有助于分析方法的选择和确定。一般来说，分析方法应有一定的浓度范围。但在药代动力学研究中，药物或代谢物的浓度不是一成不变的，此时可采用一些简便的方法(如样品的稀释)，使样品中待测成分的浓度落在测定的浓度范围内。虽然在同一研究中可用不同的分析方法，但应尽量避免，以利于研究结果的统计分析。
1.3 选择性
选择性是涉及分析方法在内的特异性(能力)。色谱分析中方法的选择性是指待测药物的色谱峰与其他组分的色谱峰间的基线分离。在分析方法建立过?#程?#中，应注意了解
某些成分对分析的干扰，如内源性物质、药物的代谢物、食物及可能的合并用药，特别是中药中某些未知成分对分析的干扰。
空白样品的分析可以了解内源性物质的干扰，空白样品中加入可能来自合并用药等成分的分析，可以了解外来成分的干扰。然而这种方法不能解决药物的代谢物，或中药中共存的未知成分带来的干扰，此时可用特殊的分析手段如气相-质谱(GC-MS)或高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)分析方法，它们有着绝对的专一性。吸收度比，光电二极管矩阵检测，蒸发光散射检测，或双检测器(紫外、荧光)的应用也是一些特殊的方法。在缺乏上述技术时，应仔细比较各色谱峰的峰型和保留时间。
采用某一种分析方法对Ⅰ期临床(Phase Ⅰ)的健康志愿者药代动力研究可能是合适的，但对Ⅱ、Ⅲ期临床(PhaseⅡ、Ⅲ)的药代动力学研究不一定合适，因为Ⅱ、Ⅲ期临床研究的对象是病人而不是健康志愿者，病人年龄的差异和/或肝肾功能不全可能影响药物的代谢和清除，过多的合并用药也可能产生新的干扰。因此，在整个研究过程中，分析方法的选择性必须仔细考察。
1.4 回收率
回收率应包括整个研究浓度范围内的回收率。理想的回收率是100%，但这是不可能的。一般要求回收率高于(75%±10%)(±s)，而且低浓度和高浓度的回收率在统计学上比较不存在差异。应该注意疏水性药物易被玻璃器皿表面吸附而降低回收率的现象，高浓度时由于吸附作用点被饱和，这种现象表现不显著，但在低浓度时表现得较为明显，此时易造成工作曲线由线性变为非线性，使一些在低浓度测得的药代动力学参数(如消除半衰期)产生较大的偏差。
回收率低或不恒定，则应改进样品的制备萃取技术。对于某些回收率不稳定的分析方法可以用内标加以修正。但应注意，不准确的内标回收率则会导致额外的分析误差和更大的资料偏离。
1.5 线性关系
由于生物样品中药物浓度变化的差异较大，因此分析方法的线性范围应该足够大(如两个数量级范围)，来适合于样品的变化。对线性范围大的分析方法应检查其是否属方差齐性。如是方差不齐，则需用加权回归法。一般来说，浓度范围大的工作曲线最好用加权线性回归处理。
1.6 工作曲线的精确度和准确度
如果求得的相关系数接近1 ，认为在一定的浓度范围内方法是属线性的，有时这种推断不一定正确。在非加权最小二乘法中，最高浓度有最大权重，而所有偏差是靠最低浓度时
将它们减至最小。低浓度时，当线性范围增加1.7 个对数单位以上时，可产生100% 的相对误差。相对误差可用回归参数对计算标准进行逆运算决定。以逆运算的结果和实测的相对误差，再进行统计学和线性关系的评价。对分析样品而言，工作曲线的精密度和准确度以及相对误差应不超过10% ，如达不到此要求，应考虑用加权回归分析。通常制作工作曲线时，同一浓度需要制备3～5 个样品，这种因变量有重复的直线回归可用加权直线回归。权重是每组重复数ni(i=1，2，……，k)。如各组的方差相同，或各组的估计方差Si2(i=1，2，……k)无显著性差别，仍可用最小二乘法作简单直线回归，如各组因变量有不同的方差，即：S12，S22，……Sk2间有显著性差别，则需用加权直线回归，这时每组因变量平均权重Wi=n1/Si2，即权重与重复数ni成正比，与估计方差Si2成反比。加权回归直线同样可利用最小二乘法。即要求
∑wi(yi-a-b。xi)2=minimum
根据求极小值方法，回归直线y=a+b。
其中a=-b。
加权回归直线斜率b的标准误：
斜率b的近似95% 可信限为b=±2Sb
与非加权回归分析比较，相关系数可能减小，但由于精密度和准确度的改善，可明显增加方法的适用范围。
1.7 方法的精密度
在整个计算范围内，应评价系统和方法的精密度。系统的精密度指所使用的仪器的可变化性。方法的精密度指样品制备和附加步骤的可变化性。在药代动力学的研究中，方法内与方法间的精密度的相对误差应在±10%之内。
1.8 方法的准确度
方法内和方法间的准确度可用对照样品中的实验浓度代替检测器的响应代入进行测试。从实测浓度和理论浓度间的差别可求得相对误差。同时应注意回归分析对准确度的影响，特别是在低浓度时。在整个计算范围内，相对误差应小于10%。
1.9 常规样品分析
常规样品与对照样品应作平行操作分析。只有当对照样品分析结果与先前预分析的结果一致时(±10%的相对误差)，则研究样品的分析结果才可认为是有效的。否则应对未知的误差来源加以确定和修正，再进行样品重新分析。
2 结论
只有通过精确的资料分析，才能对药代动力学的资料作出正确的评价。资料分析的准确性取决于有效的生物样品分析方法。方法一经确定，可用于各种目的研究(如单剂量和多次给药的比较，药物相互作用的研究等)。若改用另一种新的生物样品分析方法，则新方法首先应与已有的方法作比较，同时也应满足以上所述的各种要求。
随着国家资助立项的有关中药药代动力学研究课题(项目)日趋增多，新药研究开发对申报资料药代动力学的要求，以及专业杂志发表的许多中药药代动力学研究结果的报导，显示出药代动力学在中药现代化研究进程中越来越重要的位置。然而，无论是药代动力学参数的求算，药物作用机理的阐述，或指导临床用药，所有这一切，都必须建立在有效的生物样品分析基础上。
备注：基金来源：国家自然科学基金资助项目，批准号9770909。
作者单位：广州中医药大学临床药理研究所，广州510405
(收稿日期：1998-07-01)
本篇文章来自百拇医药网 原文链接：https://www.doczj.com/doc/103952236.html,/html/DirDu/2005/05/21/56/82/81.htm
生物样品分析前处理技术
生物样品的前处理涉及很多方面，但主要应考虑生物样品的种类，被测定药物的性质和测定方法三个方面的问题。1.样品的分离、纯化技术应该依据生物样品的类型。例如，血浆或血清需除蛋白，使药物从蛋白结合物中释出；唾液样品则主要采用离心沉淀除去粘蛋白；尿液样品常采用酸或酶水解使药物从缀合物中释出，当原型药物排泄在尿中时，可简单地用水稀释一定倍数后进行测定。2.根据被测定药物的结构、理化及药理性质、存在形式、浓度范围等，采取相应的前处理方法。例如，药物的酸碱性（pka）、溶解性质涉及到药物的提取手段；是否具有挥发性涉及到能否采用气相色谱法测定；药物的光谱特性及官能团性质涉及到分析仪器的选择、能否制成衍生物及应用特殊检测器的可能性。药物在样品中的浓度相差很大，浓度大的样品，对前处理要求可稍低；浓度越低则样品前处理要求越高。此外，药物在体内常产生许多代谢产物，其中一些代谢物仍具有药理活性，需要与原型药分别测定，因而也要了解药物的药理学性质和药物动力学特性。3.样品于测定前是否需要纯化以及纯化到什么程度均与其后采用的测定方法的不同而不同。即纯化程度与所用测定方法的专属性、分离能力、检测系统对不纯样品污染的耐受程度等密切相关。一般说来，放射免疫测定法由于具有较高的灵敏度和选择性，因此当初步除去主要干扰物质之后即可直接测定微量样品；而对灵敏度和专属性较差的紫外分光光度法，分离要求就要相应高一些；至于常用的高效液相色谱法，为防止蛋白质等杂质沉积在色谱柱上，上柱前需对生物样品进行去蛋白，有时对被测组分进行提取、制备衍生物等前处理。 样品处理步骤与分析方法的选择 (一）去除蛋白质 在测定血样时，首先应去除蛋白质。去除蛋白质可使结合型的药物均出来，以便测定药物的总浓度；去除蛋白质也可预防提取过程中蛋白质发泡，减少乳化的形成，以及可以保护仪器性能（如保护HPLC柱不被沾污），延长使用期限。去除蛋白法有以下几种。 1.加入与水相混溶的有机溶剂加入水溶性的有机溶剂；可使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚，使与蛋白质结合的药物释放出来。常用的水溶性有机溶剂有：乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等。含药物的血浆或血清与水溶性有机溶剂的体积比为1：（1～3）时，就可以将90％以上的蛋白质除去。水溶性有机溶剂的种类不同时，析出的蛋白质形状亦不同；并且所得上清液的pH值也稍有差别，如用乙腈或甲醇时，上清液pH为8.5～9.5，用乙醇或丙酮时，上清液pH为9～10。操作时，将水溶性有机溶剂与血浆或血清按一定比例混合后离心分离，取上清液作为样品。通常分离血浆或血清用的离心机（3000r/min）不能将蛋白质沉淀完全，而采用超速离心机（10000r／min）离心1～2min 便可将析出的蛋白质完全沉淀。离心时应用超速离心机专用的具塞塑料尖底管，可使析出的蛋白质牢固地粘在管底，便于上清液的吸取。 2.加入中性盐加入中性盐，使溶液的离子强度发生变化。中性盐能将与蛋白质水合的水置换出来，从而使蛋白质脱水而沉淀。常用的中性盐有：饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等。操作时，如按血清与饱和硫酸铵的比例为1：2，混合，离心（10000r/min）1～2min，即可除去90％以上的蛋白质。所得上清液的pH为7.0～7.7这种利用盐析的方法与有机溶剂提取法并用时，药物的回收率高，因而常常被采用。 3.加入强酸当pH低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子形式存在。此时加入强酸，可与蛋白质阳离子形成不溶住盐而沉淀。常用的强酸有：10％三氯醋酸、6％高氯酸、硫酸-钨酸混合液及5％偏磷酸等。含药物血清与强酸的比例为1：0.6混合，离心〈10000r／min）1～2min，就可以除去90％以上的蛋白质。取上清液作为样品。因加入了强酸，上清液呈酸性（pH0～4），在酸性下分解的药物不宜用本法除蛋白。过量的三氯醋酸可经煮沸，分解为氯仿和二氧化碳而被除去；也有用乙醚提取过量三氯醋酸的方法。过量的高氯酸可用碳酸钾、
9012 生物样品定量分析方法验证指导原则
1. 范围
准确测定生物基质（如全血、血清、血浆、尿）中的药物浓度，对于药物和 制剂研发非常重要。这些数据可被用于支持药品的安全性和有效性，或根据毒动 学、药动学和生物等效性试验的结果做出关键性决定。因此，必须完整地验证和 记录应用的生物分析方法，以获得可靠的结果。
本指导原则提供生物分析方法验证的要求，也涉及非临床或临床试验样品实 际分析的基本要求，以及何时可以使用部分验证或交叉验证，来替代完整验证。
生物样品定量分析方法验证和试验样品分析应符合本指导原则的技术要求。 应该在相应的生物样品分析中遵守 GLP 原则或 GCP 原则。
2. 生物分析方法验证
2.1 分析方法的完整验证
分析方法验证的主要目的是，证明特定方法对于测定在某种生物基质中分析 物浓度的可靠性。此外，方法验证应采用与试验样品相同的抗凝剂。一般应对每 个物种和每种基质进行完整验证。当难于获得相同的基质时，可以采用适当基质 替代，但要说明理由。
一个生物分析方法的主要特征包括：选择性、定量下限、响应函数和校正范 围（标准曲线性能）、准确度、精密度、基质效应、分析物在生物基质以及溶液 中储存和处理全过程中的稳定性。
有时可能需要测定多个分析物。这可能涉及两种不同的药物，也可能涉及一 个母体药物及其代谢物，或一个药物的对映体或异构体。在这些情况下，验证和 分析的原则适用于所有涉及的分析物。
对照标准物质 在方法验证中，含有分析物对照标准物质的溶液将被加入到空白生物基质 中。此外，色谱方法通常使用适当的内标。 应该从可追溯的来源获得对照标准物质。应该科学论证对照标准物质的适用 性。分析证书应该确认对照标准物质的纯度，并提供储存条件、失效日期和批号。 对于内标，只要能证明其适用性即可，例如显示该物质本身或其相关的任何杂质 不产生干扰。 当在生物分析方法中使用质谱检测时，推荐尽可能使用稳定同位素标记的内 标。它们必须具有足够高的同位素纯度，并且不发生同位素交换反应，以避免结 果的偏差。
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生物样品前处理 2010-01-08 12:02:45| 分类：生物样品预处理 生物样品的前处理 .生物样品预处理 生物样品的前处理是体内药物分析的一个重要环节,也是整个分离分析过程中最繁琐的一个步骤。与原料药物和制剂相比,生物样品更为复杂:微量药物分布在大量生物介质中,对分析仪器的灵敏度提出了更高的要求;样品中含有大量内源性物质,不仅能与药物及其代谢物结合,而且常干扰测定。因此,生物样品中的药物必须经过分离、纯化与浓集,必要时还需对待测组分进行化学改性处理,从而为最后测定创造良好的条件。传统的样品前处理方法仍为溶剂萃取法,方法耗时、危害人体、污染环境,萃取使用大量溶剂,分析时需浓缩,会导致有效组分的损失。本文仅对近年相关文献报道的几种药物分析过程中生物样品预处理技术及应用进行综述。 超临界流体萃取( supercritical fluid extraction ,SFE) 是环保型分离浓集技术,具有萃取效率和选择性高、省时、萃取溶剂(如便于挥发、提取物较为“干净”、环境污染少、操作条件易于改变等特点,不仅广泛应用于食品、化妆品、环境、医药及一些天然产物的分析,在生物体内药物分析方面也显示出一定的优势[1]。 超临界流体萃取技术的原理是控制超临界流体在高于临界温度和临界压力的条件下,从目标物中萃取成分,当恢复到常压和常温时,溶解
在超临界流体中的成分立即与气态的超临界流体分开。该技术对于挥发性成分、脂溶性成分、小分子萜类及热敏物质等的提取,较传统方法有很多优越性。 常用萃取剂为。由于超临界流体是非极性溶剂,对于低极性和非极性的化合物表现出优异的溶解性能,而对于大多数无机盐、极性较强的物质几乎不溶。通过添加改性剂,如甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯和水等,并通过加压改善其溶解性能,使超临界流体萃取技术对生物碱类、黄酮类、皂甙类等的应用也日趋普遍。 针对生物样品中通常含有不同极性组分或含有大量脂溶性成分干 扰的特点,当前研究工作主要集中在如何提高超临界流体的萃取能力及消除脂类干扰两个方面[2]。 固相萃取技术以选择性吸附与选择性洗脱的液相色谱分离原理,对样品进行分离和纯化。 按照所采用固相萃取剂的种类,可将固相萃取法分为3类:正相、反相和离子交换固相萃取。当前固相萃取剂的开发主要侧重于扩大萃取剂的适用范围,将极性、非极性基团,离子交换基团或高分子树脂混合使用的混合型吸附剂,成为目前研究的热点。 根据分析物的极性、溶解度、pKa等理化性质,选取适合的固相萃取柱。对于非离子性物质而言,优先使用极性相似的固相萃取柱,如弱极性或非极性化合物选用、、等非极性柱,极性较强的则使用CN、柱。强离子型分析物则采用离子交换固相萃取。对于某些弱酸或弱碱性化合物,
生物试样分析的前处理 户田昭三 钟辉译友岩校 一、前言 以电感耦合等离子发射光谱法〈ICP〉或原子吸收法〈AAS〉对生物试样中金属元素进行一般性测定时，必须预先处理水分及有机物等试样主体成分。生物体中含有70％以上的水分，各种生物体中水分含量列于表1。 也有按照灰分重量计算元素含量的。在某些特定的情况下，也有根据某种特定成分的含量计算其它成分含量的。以新鲜生物体为准计算测定成分的含量时，由于取样后试样的经历和保存方式的不同，水分含量也不同，测定值的重现性很差。 二取样保存 生物试样中微量元素的含量与工业制品的情况不同，即使从同一场所采取试样，每个生物体之间也有很大差别。还必须考虑到由于采样环境、粘附或混入试样中物质的影响，如粘在根上的土及叶子上的灰尘等应该洗净。由于海水、河水中金属元素含量非常低，不必顾虑试样粘上的水会使金属元素的含量发生很大变化，可用滤纸或纱布将水轻轻擦拭干净。 生物死亡之后，由于自身新陈代谢的加剧，组织腐败，NA ﹑K﹑CA﹑C I等离子随渗出的细胞液流失，会使得测定值发生很大变化。因此，最好是在采取试样后尽可能快地处理。植物的种子和薯类那样的生物组织如果处于暂时的生长状态，即使经过数日，除水分之外其它成分也不会发生很大变化，动物的肌肉
红血球等细胞膜脆弱的试样，冷冻会破坏细胞膜，使细胞液流出与细胞外液 〈如血清〉混合而得不到真正的分析数值。红血球[1]内Zn、K、Ca﹑Fe、Na的 含量分别为10, 3600, 0.67, 1000, 200ug/ml, 而血清中上述元素的含量分别为0.6 ~1.2, 160, 100, 1.0, 3300ub/ml,应该注意到这种悬殊的差别。测定血液中的成分 时，取样后必须尽快进行分离处理，然后再保存，或者采样于定量容器内，分析 时处理全部试样后测定，以全血中的含量表示。 保存干燥试样时应置于干燥、避光的场所，可用硅胶等降低试样保存环境的 温度。用干燥氮气置换保存容器内的空气，或封入防老化箱、一次性手炉那样的 装有脱氧剂的包装之内，可长期保存。只是这类包装含有铁、钙等物质，启封时 必须注意。 三干燥 从生物试样的保存和运输方面考虑，干燥的试样较为方便，为了准确、精密 地分析和表达试样中金属元素含量，最好使用干燥试样并按照干燥试样的单位重 量计算成分含量。某些种类的试样，在一定的条件下干燥会造成低分子有机化合 物的分解和挥发，Se、Hg、As等元素也会损失。 生物试样的干燥条件应根据试样的种类而异，例如碳水化合物含量高的试样 水分与碳的结合力很强，需要较高的干燥温度。对于脂肪含量低水分含量 高的试样，应预先在60～70°Ｃ通风干燥，使之与大气中蒸汽压达到平衡之后 再做作进一步处理。表2中列出了日本科学技术厅和资源调查委员会颁布的食品 标准分析方法中为测定水分含量所规定的干燥条件。表内所列的条件对于分析食 品中无机成分是毫无问题的，但分析其中某些易挥发成分时则需要更稳妥的干燥 方法。分析美国商务部标准局（NBS）和日本环境厅国立公害研究所制备的用于 分析金属元素成分的生物试样时，分析前的干燥条件如表3所示。同时也指出， 分析Hg、Se、As时所用的试样不经干燥直接使用。另行取样在指定条件下干燥， 测定试样的水分，将分析试样换算成干燥试样重量后计算测定成分含量。 蔬菜、水果、藻类等水分含量高达90％左右的试样，若水分含量变化0.5％ 就意味着干燥体的重量相差5％，因而对金属成分含量的分析影响很大。可见干 燥是必须注意的前处理之一。 表2 食品分析中规定的干燥条件（用于测定水分）<1>
中国药典2015年版 9012生物样品定置分析方法验证 指导原则 一、范围 准确测定生物基质（如全血、血清、血浆、尿）中的药物浓度，对于药物和制剂研发非常重要。这些数据可被用于支持药品的安全性和有效性，或根据毒动学、药动学和生物等效性试验的结果做出关键性决定。因此，必须完整地验证和记录应用的生物分析方法，以获得可靠的结果。 本指导原则提供生物分析方法验证的要求，也涉及非临床或临床试验样品实际分析的基本要求，以及何时可以使用部分验证或交叉验证，来替代完整验证。本指导原则二和三主要针对色谱分析方法，四针对配体结合分析方法。 生物样品定量分析方法验证和试验样品分析应符合本指导原则的技术要求。应该在相应的生物样品分析中遵守 G L P原则或GC P原则。 二、生物分析方法验证 (一）分析方法的完整验证 分析方法验证的主要目的是，证明特定方法对于测定在某种生物基质中分析物浓度的可靠性。此外，方法验证应采用与试验样品相同的抗凝剂。一般应对每个新分析方法和新分析物进行完整验证。当难于获得相同的基质时，可以采用适当基质替代，但要说明理由。 一个生物分析方法的主要特征包括：选择性、定量下限、响应函数和校正范围（标准曲线性能）、准确度、精密度、基质效应、分析物在生物基质以及溶液中储存和处理全过程中的稳定性。 有时可能需要测定多个分析物。这可能涉及两种不同的药物，也可能涉及一个母体药物及其代谢物，或一个药物的对映体或异构体。在这些情况下，验证和分析的原则适用于所有涉及的分析物。 对照标准物质 在方法验证中，含有分析物对照标准物质的溶液将被加人到空白生物基质中。此外，色谱方法通常使用适当的内标。 应该从可追溯的来源获得对照标准物质。应该科学论证对照标准物质的适用性。分析证书应该确认对照标准物质的纯度，并提供储存条件、失效日期和批号。对于内标，只要能证明其适用性即可，例如显示该物质本身或其相关的任何杂质不产生干扰。 当在生物分析方法中使用质谱检测时，推荐尽可能使用稳定同位素标记的内标。它们必须具有足够高的同位素纯度，并且不发生同位素交换反应，以避免结果的偏差。 1.选择性 该分析方法应该能够区分目标分析物和内标与基质的内源性组分或样品中其他组分。应该使用至少6个受试者的适宜的空白基质来证明选择性（动物空白基质可以不同批次混 9012生物样品定量分析方法验证指导原则 合），它们被分别分析并评价干扰。当干扰组分的响应低于分析物定量下限响应的20%,并低于内标响应的5%时，通常即可以接受0 应该考察药物代谢物、经样品预处理生成的分解产物以及可能的同服药物引起干扰的程度。在适当情况下，也应该评价代谢物在分析过程中回复转化为母体分析物的可能性。 2.残留 应该在方法建立中考察残留并使之最小。残留可能不影响准确度和精密度。应通过在注射高浓度样品或校正标样后，注射空白样品来估计残留。高浓度样品之后在空白样品中的残留应不超过定量下限的20%，并且不超过内标的5%。如果残留不可避免，应考虑特殊措施，在方法验证时检验并在试验样品分析时应用这些措施，以确保不影响准确度和精密度。这可能包括在高浓度样品后注射空白样品，然后分析下一个试验样品。 3.定量下限 定量下限是能够被可靠定量的样品中分析物的最低浓度，具有可接受的准确度和精密度。定量下限是标准曲线的最低点，应适用于预期的浓度和试验目的。 4.标准曲线 应该在指定的浓度范围内评价仪器对分析物的响应，获得标准曲线。通过加人已知浓度的分析物（和内标）到空白基质中，制备各浓度的校正标样，其基质应该与目标试验样品基质相同。方法验证中研究的每种分析物和每一分析批，都应该有一条标准曲线。 在进行分析方法验证之前，最好应该了解预期的浓度范围。标准曲线范围应该尽量覆盖预期浓度范围，由定量下限和定量上限(校正标样的最髙浓度）来决定。该范围应该足够描述分析物的药动学。 应该使用至少6个校正浓度水平，不包括空白样品（不含分析物和内标的处理过的基质样品）和零浓度样品（含内标的处理过的基质〉。每个校正标样可以被多次处理和分析。 应该使用简单且足够描述仪器对分析物浓度响应的关系式。空白和零浓度样品结果不应参与计算标准曲线参数。 应该提交标准曲线参数，测定校正标样后回算得出的浓度应一并提交。在方法验证中，至少应该评价3条标准曲线。 校正标样回算的浓度一般应该在标示值的:t l5%以内，定量下限处应该在±20%内。至少75%校正标样，含最少6个有效浓度，应满足上述标准。如果某个校正标样结果不符合这些标准，应该拒绝这一标样，不含这一标样的标准曲线应被重新评价，包括回归分析^ 最好使用新鲜配制的样品建立标准曲线，但如果有稳定性数据支持，也可以使用预先配制并储存的校正标样。 5.准确度 分析方法的准确度描述该方法测得值与分析物标示浓度的接近程度，表示为：（测得值/真实值)x l00?^应采用加人已知 ? 363
生物等效性实验生物样品处理注意事项(严)
生物等效性实验生物样品处理注意事项一、样品采集后的的处理和贮存 鉴于生物样本的特点，为了避免样品中被测药物发生分解或产生其他化学变化，取样后最好立即进行分析测定，但实际工作中几乎无法做到，常需将收集到的样品冷藏、冰冻，临用前再融化并放至室温后使用。在样本冷冻贮藏前，需及时进行处理。 1.1血液样本处理注意事项 1.1.1. 在肌肉注射或静脉输含有葡萄糖或电解质(含钾、钠、氯离子)的液体时，建议3小时以后采集静脉血样本进行这些项目的检验，以防止上述检验项目因输液引起的假性升高。 1.1.2保定非麻醉状态的动物时应尽量避免用力挤压动物头颈和胸腹，以免引起血液淤滞，局部组织缺氧，造成血液某些成分的改变，特别是测定乳酸，血液含氧量等指标时。 1.1.3血液中红细胞内外成分有很大差异，溶血可造成红细胞内的物质向细胞外转移，如K+、Mg2＋和某些酶类(LD、AST、ALT、ACP)；另外，溶血还可干扰某些化学项目(TBil、DBil、TC等)的测定，严重影响结果的准确性，血样本应防止溶血。引起溶血的原因有：注射器采血时抽吸力太大；血液与抗凝剂比例失调；混匀样本时过度振荡；注射器或采血容器带水或容器污染；全血放置时间长或突然受冷或受热；注射器中的血沫注入采血容器；真空采血时如未
采满至相应刻度，残存负压造成红细胞破裂；不拔针头直接注入采血容器；样本离心时离心力过大等。为避免溶血，取血时应注意： ①、抽拉注射器时应尽量避免注射器内产生大量真空； ②、添加抗凝剂后的容器在除必要干燥流程后应及时密封； ③、混匀样本时避免用力过度，切勿产生泡沫； ④、避免重复使用注射器、针头、采血管、毛细玻璃管等一次性用品，手术刀片和剪刀等器材取材时尽量洗去残留血液； ⑤、采血时的室温应控制在22℃至25℃，采取的血液容器在需要放入冰盒时，切勿紧贴冰袋，冰水； ⑥、当注射器内因吸入空气产生血沫时，注意弃掉血沫，在将血液注入采血容器时勿将血沫一并注入； ⑦、使用真空采血管需抽取负压时切勿过量； ⑧、将血液注入采血容器时要除去针头，轻柔推入； ⑨、离心带有血细胞的血样时，按照规格设定离心参数； 1.1.4. 正确选择采集管。通常情况下多采用血清为样本(不抗凝)，部分检测项目需注意样本属性为血清或血浆，两者不可替代。一些特殊检验项目需要使用抗凝剂时，应注意选择合适的抗凝剂并注意抗凝剂与血液的比例，以防止样本凝血或红细胞形态的改变；抗凝血样本采集后立即轻轻摇匀至少上下颠倒8次，以防凝血发生。 1.1.5. 多项化验采血顺序：血培养瓶(厌氧瓶优先)→蓝帽管→黑帽管→红/黄帽管→绿帽管→紫帽管→灰帽管→其他。
1 生物样品定量分析方法验证指导原则（草案） 1 1. 范围 2 准 确测定生物基质（如全血、血清、血浆、尿）中的药物浓度，对于药物和3 制剂研发非常重要。这些数据可被用于支持药品的安全性和有效性，或根据毒动4 学、药动学和生物等效性试验的结果做出关键性决定。因此，必须完整地验证和5 记录应用的生物分析方法，以获得可靠的结果。6 本指导原则提供生物分析方法验证的要求，也涉及非临床或临床试验样品实7 际分析的基本要求，以及何时可以使用部分验证或交叉验证，来替代完整验证。8 生物样品定量分析方法验证和试验样品分析应符合本指导原则的技术要求。9 应该在相应的生物样品分析中遵守GLP原则或GCP原则。10 2. 生物分析方法验证11 2.1 分析方法的完整验证12 分析方法验证的主要目的是，证明特定方法对于测定在某种生物基质中分析13 物浓度的可靠性。此外，方法验证应采用与试验样品相同的抗凝剂。一般应对每14 个物种和每种基质进行完整验证。当难于获得相同的基质时，可以采用适当基质15 替代，但要说明理由。16 一个生物分析方法的主要特征包括：选择性、定量下限、响应函数和校正范17 围（标准曲线性能）、准确度、精密度、基质效应、分析物在生物基质以及溶液18 中储存和处理全过程中的稳定性。19 有时可能需要测定多个分析物。这可能涉及两种不同的药物，也可能涉及一20 个母体药物及其代谢物，或一个药物的对映体或异构体。在这些情况下，验证和21 分析的原则适用于所有涉及的分析物。22 对照标准物质23 在方法验证中，含有分析物对照标准物质的溶液将被加入到空白生物基质24 中。此外，色谱方法通常使用适当的内标。25 应该从可追溯的来源获得对照标准物质。应该科学论证对照标准物质的适用26 性。分析证书应该确认对照标准物质的纯度，并提供储存条件、失效日期和批号。27 对于内标，只要能证明其适用性即可，例如显示该物质本身或其相关的任何杂质28 不产生干扰。 29 当在生物分析方法中使用质谱检测时，推荐尽可能使用稳定同位素标记的内30 标。它们必须具有足够高的同位素纯度，并且不发生同位素交换反应，以避免结31 果的偏差。322
生物学科试卷分析 本次调研考试是在各科刚完成新课教学的情况下展开的。生物学科虽然说不是新课，但因在七、八年级打下的底子较薄，到当前为止也是像上新课一样实行归纳性的教学，学生掌握的知识有限，所以本次考试情况不容乐观是意料之中的。但是考试情况如此不佳又是意料之外的。 从学生答题情况看，他们与参加中考还存有着相当远的距离。我校九年级四个教学班的平均分分别为：13.60分、13.06分、14.39分、13.25分。及格人数分别为：13人、11人、10人和8人。低分人数均占了各班的一半还多。和往届相比，这样的成绩是不可想象的。 我认为造成这种现状的原因是多方面的。首先，我校本届九年级有相当一部分学生存有厌学情绪，这种情况比往届都表现得突出，面对这种情况，教师上课时一方面要照顾这些学生的学习进度，另一方面要让学习水平较好的学生得到较深层次的知识储备，还是有很大困难的，所以，学生当前的知识积累还远远不够。 其次,学生掌握的知识过于格式化、不能快速的将所学知识转变为解决问题的工具。其表现就是将概念性的东西照搬而不考虑特例，如：选择题第4小题，很多学生只考虑毛细 血管的概念，而忽视了肾小球中的毛细血管是连接于小动脉之间的。这种问题造成的另一个结果是做题的速度太慢，很多学生特别是一些平时学习较好的学生在完成整个理综考试的过程中，没有把握好时间，导致生物学科的非选择题部分没有做完或是交了白卷，这也是本次考试出不了成绩的一个重要原因。 第三，学生对所学知识掌握得不够牢靠。这与上学期我们的教学模式有一定的关系，因为条件的限制，我们上学期的练习主要是利用每节新课结束后的时间完成一些基础性较强的习题，这种方法只能即时反馈对当堂知识的掌握情况，但对学生解题水平的训练不够，课后需要增强记忆的东西也没记住。考后很多学生就说“没记住”，如“胰岛素” 和“维生素D”这两个空，学生就是没有记住相关知识点而丢分。 第四，学生对概念性的知识还存有着理解上的距离，如相关“气体扩散”的填空题，学生理解到了呼吸系统内的气体交换是气体浓度差和压力差造成的结果，但就是不能用合适的概念把这个现象表述出来。可见，一些理论性较强的概念特别是生僻的概念必须要通过联系实际，多提多问才能让他们真正理解其含义，才能变成可用的语言。 面对上述诸多问题，我们必须一一对症，针对不同层次的学生做出教法、学法上的调整。
微生物样品前处理作业指导书 1.目的： 为保证微生物样品检测的有效性，必须有合理的方法指导。 2.适用范围： 食品（微生物检测）样品的前处理。 3.职责： 由微生物操作人员进行微生物检测前的样品前处理。 4.操作步骤： 1实验室接到送检样品后应认真核对登记,确保样品的相关信息完整并符合检验要求。 1.1.2 实验室应按要求尽快检验。若不能及时检验，应采取必要的措施保持样品的原有状态，防止样品中目标微生物因客观条件的干扰而发生变化。 1.1.3 冷冻食品应在 45 ℃以下不超过15 min ，或2 ℃～5 ℃不超过 18 h 解冻后进行检验。 1.2 检验方法的选择 1.2.1 应选择现行有效的国家标准方法。 1.2.2 食品微生物检验方法标准中对同一检验项目有两个及两个以上定性检验方法时，应以常规培养方法为基准方法。 1.2.3 食品微生物检验方法标准中对同一检验项目有两个及两个以上定量检验方法时，应以平板计数法为基准方法。 2前处理步骤 2.1肉与肉制品检验按GB/T 4789.17-2003执行 蛋与蛋制品检验按GB/T 4789.19-2003执行
水产食品检验按GB/T 4789.20-2003执行 冷冻饮品、饮料检验按GB/T 4789.21-2003执行 调味品检验按GB/T 4789.22-2003执行 冷食菜、豆制品检验按GB/T 4789.23-2003执行 糖果、糕点、蜜饯检验按GB/T 4789.24-2003执行 酒类产品前处理按GB 4789.25-2003执行 2.2其他产品按GB 4789.1-2016及GB 4789.2-2016中步骤进行 样品的稀释 2.2.1 固体和半固体样品:称取25g样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或放入盛有225mL稀释液的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min,制成1∶10的样品匀液。 2.2.2 液体样品:以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成1∶10的样品匀液。 2.2.3 用1mL 无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成1∶100的样品匀液。 2.2.4 同理操作,制备10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次,换用1 次1mL 无菌吸管或吸头。 批准/日期：审核/日期：编制/日期：
European Medicines Agency 7 Westferry Circus, Canary Wharf, London, E14 4HB, UK 1 2 3 London, 19 November 2009 Doc. Ref: EMEA/CHMP/EWP/192217/2009 COMMITTEE FOR MEDICINAL PRODUCTS FOR HUMAN USE 4 (CHMP) 5 6 DRAFT GUIDELINE ON VALIDATION OF BIOANALYTICAL METHODS 7 8 DRAFT AGREED BY THE EFFICACY WORKING PARTY September 2009 ADOPTION BY CHMP FOR RELEASE FOR CONSULTATION 19 November 2009 END OF CONSULTATION (DEADLINE FOR COMMENTS) 31 May 2010 9 Comments should be provided using this template to EWPSecretariat@emea.europa.eu 10 KEYWORDS CHMP, EMEA, Guideline, validation, bioanalytical method, analyses
GUIDELINE ON VALIDATION OF BIOANALYTICAL METHODS 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 TABLE OF CONTENTS 1.INTRODUCTION (BACKGROUND) (3) 2.SCOPE (3) 3.LEGAL BASIS (3) 4.METHOD VALIDATION (4) 4.1C OMPLETE VALIDATION OF AN ANALYTICAL METHOD (4) 4.1.1Selectivity (4) 4.1.2Carry-over (5) 4.1.3Lower limit of quantitation (5) 4.1.4Calibration curve (5) 4.1.5Accuracy (6) 4.1.6Precision (7) 4.1.7Dilution integrity (7) 4.1.8Matrix effect (7) 4.1.9Stability (8) 4.2P ARTIAL VALIDATION (9) 4.3C ROSS VALIDATION (9) 4.4L IGAND-BINDING ASSAYS (9) 5.ANALYSIS OF STUDY SAMPLES (10) 5.1A NALYTICAL RUN (11) 5.2A CCEPTANCE CRITERIA OF AN ANALYTICAL RUN (11) 5.3C ALIBRATION RANGE (12) 5.4R EANALYSIS OF STUDY SAMPLES (12) 5.5I NTEGRATION (13) 6.INCURRED SAMPLES REANALYSIS (13) 7.STUDY REPORT (13) DEFINITIONS (16)
中药代谢组学研究中生物样品前处理方 法 （作者：_________ 单位：___________ 邮编：___________ ） 作者：邹忠杰，梁生旺，袁经权，龚梦鹃 【摘要】总结中药代谢组学研究中生物样品（尿液、血液）的前处理 方法，主要包括：尿液中加入缓冲液提供相同的pH值和离子强度， 保持代谢物化学位移的恒定。利用有机溶剂沉淀法除去血液中的大分子物质，增加色谱柱的性能和使用寿命。血液和尿液样品在进行GC'MS分析前要进行衍生化处理。同时，对尿液和血液的采集与储存方法进行了总结。 【关键词】中药；代谢组学;样品前处理 Abstract: In order to reduce the chemical shift variati on ,the pH and the con siste ncy of io nic stre ngth were con trolled by add ing buffer to uri ne samples. In an alysis of blood,efficie nt removal of macromolecules such as protei ns by orga nic solve nt precipitatio n before injectio n in to an analytical LC column was important in enhancing the performanee and extending column lifetime. Sample derivatization of blood
sample and urine sample before GC：MSanalysis was needed. And methods of collecti on and storage of urine and blood samples were also reviewed. Key words:traditional Chinese medicine; metabonomics; pretreatme nt 代谢组学（metabonomics）是继基因组学、转录组学和蛋白质组学后新兴的一种组学方法，是系统生物学的重要组成部分。中药“多组分、多靶点、整合调节作用”的特点与代谢组学整体性、系统性、综合性相吻合。因此，以代谢组学为主体的系统生物学研究方法可能是现代科学中可以概括中医药抽象整体观思想的重要途径。王广基等对 代谢组学技术在中医药关键科学问题研究中的应用前景进行了分析［1］。作者综述了代谢组学技术在中药整体疗效、作用机制及安全性等研究中的应用［2］。 代谢组学研究中的分析手段主要包括核磁共振谱（NMR）气相色谱拟质谱（GC以MS和液相色谱拟质谱（LC拟MS）等各种高通量、高分辨、高灵敏度的谱学技术［3］。NMR由于其具有很高的重现性、一次实验中实现对各种化合物的同时测定、信号强度与其摩尔浓度成正比，可以很容易进行定量分析、借助各种2D A N MR技术可以在对复杂样品不进行进一步分离的前提下实现结构鉴定等诸多优点而被广泛应用［4］。高分辨魔角旋转核磁共振技术（high拟resolution magic拟angle拟spinning NMF^pectroscopy）可以使研究者不经过提取等繁琐的步骤直接对完整的组织进行测定［5］。L C）：MS特
第21章 分析化学中常用的分离方法和生物试样的前处理 【21-1】已知Mg(OH)2的K sp =1.8×10-11 ，试计算MgO 悬浊液所能控制的溶液的pH 为多少？ 解：Mg(OH)2的K sp =1.8×10-11，若[Mg 2+]=0.1mol ·L -1时， ()22MgO+H O Mg OH ? ()2+-2Mg OH Mg +2OH ? 2+-2sp []K g [M OH ]= -11sp --10-52+K 1.8?10[OH ]=== 1.8?10=1.3410[Mg ]0.1? pH=9.1 【21-2】在NH 3·H 2O 浓度为0.10 mol ·L -1和NH 4Cl 浓度为1.0 mol ·L -1时，能使一含有Fe 3+，Mg 2+的溶液中的两种离子完全分离吗？ 解：5[OH ] 1.7710 1.0b b c K --==?? pH=14-pOH=14-4.75=9.25 Fe(OH)3沉淀开始时pH=2.2，沉淀完全时pH=3.5 Mg(OH)2沉淀开始时pH=9.6，沉淀完全时pH=11.6 在此条件下能使Fe 3+，Mg 2+分离完全。 【21-3】有一物质在氯仿和水之间的分配比（D ）为9.6。含有该物质浓度为0.150mol ·L-1的水溶液40mL ，用氯仿萃取如下： （1）40.0mL 萃取1次； （2）每次20.0mL 萃取2次； （3）每次10.0mL 萃取4次； （4）每次5.00mL 萃取8次。 假设多次萃取时D 值不变，问留在水相中的该物质的浓度是多少？ 解：（1）0.0173 mol ·L -1； （2）0.0064 mol ·L -1；（3）2.1×10-3 mol ·L -1；（4）6.9×10-4 mol ·L -1 【21-4】某一弱酸HA 的 K a =2.0×10-5 ，它在某种有机溶剂和在水中的分配系数为30.0,当水溶液的pH=1.0和5.0时，分配比各是多少?用等体积的有机溶剂萃取，E 各为多少? 解：
第四节 生物样品分析的前处理技术 一般要在测定之前进行样品的前处理，即进行分离、纯化、浓集，必要时还需对待测组分进行化学衍生化，从而为测定创造良好的条件。 生物样品进行前处理的目的在于： 1．药物进入体内后，经吸收、分布、代谢，然后排出体外。在体液、组织和排泄物中除了游离型（原型）药物之外，还有药物的代谢物、药物与蛋白质形成的结合物、以及药物或其代谢物与内源性物质，如葡萄糖醛酸、硫酸形成的葡萄糖醛酸甙（glucuronides）、硫酸酯（sulphates）缀合物等多种形式存在，需要分离后测定药物及代谢物； 2．生物样品的介质组成比较复杂。如在血清中既含有高分子的蛋白质和低分子的糖、脂肪、尿素等有机化合物，也含有Na ＋、K＋、X-等无机化合物］。其中影响最大的是蛋白质，若用HPLC法测定药物浓度时，蛋白质会沉积在色谱柱上发生堵塞，严重影响分离效果。因此，为了保护仪器，提高测定的灵敏度，必须进行除蛋白等前处理。 一、常用样品的种类、采集和贮藏 生物样品包括各种体液和组织，但实际上最常用的是比较容易得到的血液（血浆、血清、金血）、尿液、唾液。在一些特定的情况下选用乳汁、脊髓液、精液等。 （一）血样 血浆（plasma）和血清（serum）是最常用的生物样品。 血浆中的药物浓度反映了药物在体内（靶器官）的状况，因而血浆浓度可作为作用部位药物浓度的可靠指标。 供测定的血样应能代表整个血药浓度，因而应待药物在血液中分布均匀后取样。 由采集的血液制取血浆或血清。 血浆的制备 将采取的血液置含有抗凝剂（如：肝萦、草酸盐、拘橡酸盐、EDTA、氟化钠等）的试管中，混合后，以2500～3000rpm离心5min使与血细胞分离，分取上清液即为血浆。 血清的制备 将采取的血样在室温下至少放置30min到1h，待凝结出血饼后，用细竹捧或玻璃棒轻轻地剥去血饼，然后以2000～3000rpm离心分离5～10min，分取上清液．即为血清。 血浆比血清分离快，而且制取的量多，其量约为全血的一半。 血浆及血清中的药物浓度测定值通常是相同的。基于上述原因，现在国外多采用“专用血清”来测定药物的浓度。 血样的采血时间间隔应随测定目的的不同而异。 如进行治疗药物浓度监测（therapeutic drug monitoring，TDM）时，则应在血中药物浓度达到稳态后才有意义。但每种药物的半衰期不同，因此达到稳态的时间也不间，取样时间也随之不同。 采取血样后，应及时分离血浆或血清，并最好立即进行分析。如不能立即测定时，应妥善储存。血浆或血清样品不经蒸发、浓缩，必须置硬质玻璃试管中完全密塞后保存。 要注意采血后及时分离出血浆或血清再进行储存。若不预先分离，血凝后冰冻保存，则因冰冻有时引起细胞溶解从而妨碍血浆或血清的分离或因溶血影响药物浓度变化。 （二）唾液 唾液由腮腺、颌下腺、舌下腺和口腔粘膜内许多散在的小腺体分泌液混合组成的，平时所说的唾液就是指此混合液。 唾液的相对密度为1.003～1.008；pH值在6.2～7.6之间变动，分泌量增加时趋向碱性而接近血液的pH值；通常得到的唾液含有粘蛋白，其粘度是水的1.9倍。 唾液的采集应尽可能在剌激少的安静状态下进行。一般在漱口后15min收集。 也可以采用物理的（如嚼石蜡块、橡胶、海绵）或化学的（如酒石酸）等方法剌激，使在短时间内得到大量的唾液。 唾液中含有粘蛋白，唾液的粘度由粘蛋白的含量多少而定。 用唾液作为样品测定药物浓度有几个优点： 1．与采取血样不同，患者自己可以不受时间和地点的限制，很容易地反复采集； 2．采集时无痛苦无危险； 3．有些唾液中药物浓度可以反映血浆中游离型药物浓度 （三）尿液
生物样品定量分析方法验证指导原一、范 准确测定生物基质（如全血、血清、血浆、尿）中的药浓度，对于药和制剂研发非常重要这些数据可被用于支持药品的安全性和有效性或根据动学药动学 和生物等效性试验的结果做出关键性决定因此必须完整地验记录应用的生物分 析方法，以获得可靠的结果 本指导原则提供生物分析方法验证的要求也涉及非临床或临床试验样品际分析的基本要求，以及何时可以使用部分验证或交叉验证，来替代完整验证本指导原则二和三主要针对色谱分析方法，四针对配体结合分析方法 生物样品定量分析方法验证和试验样品分析应符合本指导原则的技术要求应该在相应的生物样品分析中遵GL原则GC原则 二、生物分析方法验 （一）分析方法的完整验 分析方法验证的主要目的是证明特定方法对于测定在某种生物基质中分物浓度的可靠性此外方法验证应采用与试验样品相同的抗凝剂一般应对个新分析方 法和新分析物进行完整验证当难于获得相同的基质时可以采用当基质替代，但要说明理由 一个生物分析方法的主要特征包括选择性定量下限响应函数和校正围（标准曲线性能）、准确度、精密度、基质效应、分析物在生物基质以及溶中储存和处理全过程中的稳定性 有时可能需要测定多个分析物这可能涉及两种不同的药物也可能涉及个母体药物及其代谢物或一个药物的对映体或异构体在这些情况下验证分析的原则适 用于所有涉及的分析物 对照标准物 在方法验证中，含有分析物对照标准物质的溶液将被加入到空白生物基中。此外，色谱方法通常使用适当的内标 应该从可追溯的来源获得对照标准物质应该科学论证对照标准物质的适性分析证书应该确认对照标准物质的纯度并提供储存条件失效日期和批号对于内标 只要能证明其适用性即可例如显示该物质本身或其相关的任何杂不产生干扰。．当在生物分析方法中使用质谱检测时，推荐尽可能使用稳定同位素标记的标它们必须具有足够高的同位素纯度并且不发生同位素交换反应以避免果 的偏差 1.选择 该分析方法应该能够区分目标分析物和内标与基质的内源性组分或样品其他组分应该使用至个受试者的适宜的空白基质来证明选择（动物空基质可以不同批次混合它们被分别分析并评价干扰当干扰组分的响应低分析物定量下限响应20，并低于内标响应5时，通常即可以接受 应该考察药物代谢物经样品预处理生成的分解产物以及可能的同服药物起干扰的程度在适当情况下也应该评价代谢物在分析过程中回复转化为母分析物的 可能性 2.残 应该在方法建立中考察残留并使之最小。残留可能不影响准确度和精密度应通过在注射高浓度样品或校正标样后注射空白样品来估计残留高浓度样之后在 空白样品中的残留应不超过定量下限20并且不超过内标5如残留不可避免，应考虑特殊措施，在方法验证检验并在试验样品分析时应这些措施以确保不影响准
9012 生物样品定量分析方法验证指导原则 一、范围 准确测定生物基质（如全血、血清、血浆、尿）中的药物浓度，对于药物和制剂研发非常重要。这些数据可被用于支持药品的安全性和有效性，或根据毒动学、药动学和生物等效性试验的结果做出关键性决定。因此，必须完整地验证和记录应用的生物分析方法，以获得可靠的结果。 本指导原则提供生物分析方法验证的要求，也涉及非临床或临床试验样品实际分析的基本要求，以及何时可以使用部分验证或交叉验证，来替代完整验证。本指导原则二和三主要针对色谱分析方法，四针对配体结合分析方法。 生物样品定量分析方法验证和试验样品分析应符合本指导原则的技术要求。应该在相应的生物样品分析中遵守GLP原则或GCP原则。 二、生物分析方法验证 （一）分析方法的完整验证 分析方法验证的主要目的是，证明特定方法对于测定在某种生物基质中分析物浓度的可靠性。此外，方法验证应采用与试验样品相同的抗凝剂。一般应对每个新分析方法和新分析物进行完整验证。当难于获得相同的基质时，可以采用适当基质替代，但要说明理由。 一个生物分析方法的主要特征包括：选择性、定量下限、响应函数和校正范围（标准曲线性能）、准确度、精密度、基质效应、分析物在生物基质以及溶液中储存和处理全过程中的稳定性。 有时可能需要测定多个分析物。这可能涉及两种不同的药物，也可能涉及一个母体药物及其代谢物，或一个药物的对映体或异构体。在这些情况下，验证和分析的原则适用于所有涉及的分析物。 对照标准物质 在方法验证中，含有分析物对照标准物质的溶液将被加入到空白生物基质中。此外，色谱方法通常使用适当的内标。 应该从可追溯的来源获得对照标准物质。应该科学论证对照标准物质的适用性。分析证书应该确认对照标准物质的纯度，并提供储存条件、失效日期和批号。对于内标，只要能证明其适用性即可，例如显示该物质本身或其相关的任何杂质不产生干扰。 当在生物分析方法中使用质谱检测时，推荐尽可能使用稳定同位素标记的内标。它们必须具有足够高的同位素纯度，并且不发生同位素交换反应，以避免结果的偏差。 1. 选择性 该分析方法应该能够区分目标分析物和内标与基质的内源性组分或样品中其他组分。应该使用至少6个受试者的适宜的空白基质来证明选择性（动物空白基质可以不同批次混合），它们被分别分析并评价干扰。当干扰组分的响应低于分析物定量下限响应的20%，并低于内标响应的5%时，通常即可以接受。 应该考察药物代谢物、经样品预处理生成的分解产物以及可能的同服药物引起干扰的程度。在适当情况下，也应该评价代谢物在分析过程中回复转化为母体分析物的可能性。 2. 残留 应该在方法建立中考察残留并使之最小。残留可能不影响准确度和精密度。应通过在注射高浓度样品或校正标样后，注射空白样品来估计残留。高浓度样品之后在空白样品中的残留应不超过定量下限的20%，并且不超过内标的5%。如果残留不可避免，应考虑特殊措施，在方法验证时检验并在试验样品分析时应用这些措施，以确保不影响准确度和精密度。这可能包括在高浓度样品后注射空白样品，然后分析下一个试验样品。