卟啉杀虫剂对稻蝗的毒杀作用及机理初探

Ξ山西大学学报(自然科学版)28(2):196～201,2005Journal of Shanxi U niversity(N at.Sci.Ed.) 文章编号:025322395(2005)022*******卟啉杀虫剂对稻蝗的毒杀作用及机理初探李月梅1,郭亚平1,李　琦1,郑红莲2,马恩波1(1.山西大学生命科学与技术学院,山西太原030006;2.山西大学现代化学研究所,山西太原030006)摘　要:以太原晋源区的中华稻蝗为材料,用以52氨基乙酰丙酸(ALA)为主要成份的卟啉杀虫剂作用蝗虫,7d内处理组雄虫全部死亡,而对照组雄虫死亡数约为一半,雌虫死亡数在低浓度下无明显差异.用荧光检测法和考马斯亮蓝蛋白测定法对试虫作进一步的毒性分析,发现卟啉杀虫剂作用于蝗虫后,导致雄虫体内每克组织蛋白含量与对照组相比显著降低,A分析组平均降低73.049m g g,B分析组降低106.271m g g.雌虫体内每克组织蛋白含量与对照组相比下降不显著,A分析组平均降低22.741m g g,B分析组为6.640m g g.由此得知,卟啉杀虫剂对试虫的作用效果与试虫体内每克组织蛋白含量呈相关关系.此外,分析表明,卟啉杀虫剂作用于试虫后,处理组与对照组相比,试虫体内每毫克蛋白原卟啉I X(Pp I X)的含量普遍提高,这一点与Constantin A.R ebeiz的部分实验结果基本吻合.同时还发现,A分析组中雄虫平均每毫克蛋白Pp I X含量处理组比对照组高0.351Λg m g,雌虫的高0.277Λg m g,前者比后者多0.074Λg m g.B分析组中雄虫平均每毫克蛋白Pp I X含量处理组比对照组高0.171Λg m g,雌虫的高0.103Λg m g,前者比后者高0.068Λg m g.从实验结果可以看出卟啉杀虫剂对试虫的作用效果与试虫体内每毫克蛋白中Pp I X含量呈相关关系,结果表明卟啉杀虫剂对试虫的作用效果是由Pp I X的光敏毒性引起的.关键词:中华稻蝗;52氨基乙酰丙酸;Pp I X;卟啉杀虫剂;光敏毒性中图分类号:Q965.9 文献标识码:A1888年M arcacci报道了阳光对生物系统的毒性,后来R aab等人相继观察了吖啶橙及其它染料在阳光照射下对草履虫等其它单细胞和多细胞有机体的致死作用,并将吖啶橙及其它有同样性能的染料定义为光敏剂[1].接着Jodlbauer和V on T app ainer(Sp ikes1904)证明光、光敏剂和氧是光动力活性的三要素.迄今为止,氧杂蒽和卟啉被认为是具最强杀虫力的光敏剂,尤其是卟啉[1,2].卟啉合成发生在所有的活细胞中,它是动物亚铁血红素和植物叶绿素的前体.ALA作为Pp I X的前体,有植物生长素和细胞分裂素两种特性,一方面可作为增长剂促进植物生长[3],另一方面还可用作植物生长的抑制剂即除草剂[4].另外,因ALA可诱使Pp I X富集,所以被成功地用作赘生组织的诊断与治疗及对其它一些疾病的治疗[5].光敏杀虫剂是一种高效、低毒、廉价、无污染的新型杀虫剂.卟啉杀虫剂是光敏杀虫剂的一种,它具有传统农药无法比拟的优点.首先,它对光的波长没有特殊要求,可以吸收包括紫外和可见光波长范围内所有的光.所以卟啉杀虫剂在低剂量下表现出杀虫活性.其次,它在自然光或人工可见光下迅速降解,降解产物对生物系统无毒性.这样便减少了它在其它非靶标生物体内的毒性残留及对周围环境的污染.第三,因为卟啉杀虫剂产生的活性氧在细胞上的生化作用位点较多,所以昆虫不易对其产生抗药性[6].第四,从自然界提取或人工合成都相对简单[1].Ξ收稿日期:2004211211 基金项目:国家自然科学基金(30170612);山西省国际科技合作项目(041005) 作者简介:李月梅(19702),女,山西平遥人,硕士研究生,研究方向:昆虫毒理学.卟啉杀虫剂的作用方式有两种,一是通过施用过量的ALA 诱使Pp I X 富集,另一方式是将卟啉与诱饵一起直接施用达到光敏剂大量富集的目的,而这些光敏剂又可被自然光有效激活,在细胞内转化成具有氧化功能的自由基和单线态氧,进而毒害包括病源微生物、线虫及植食性昆虫等在内的有机体,引起它们的光敏毒性[1].R ebeiz 和Am o r 先后分别以粉纹夜蛾幼虫(T richop lusia n i )[7]及果蝇(Cera titis .cap ita ta )[8]等为材料进行了实验,得出有学术意义的研究成果.本文以中华稻蝗(O xy a ch inensis )为材料,用以ALA 为主要成份的卟啉杀虫剂作用虫体,探讨卟啉杀虫剂对蝗虫的毒杀作用及其机理.1　材料与方法1.1　材料1.1.1　供试虫体稻蝗五龄若虫(2003年8月22日采自太原市晋源镇),稻蝗成虫(2003年9月12日采自太原市晋源镇).1.1.2　试剂ALA ,Pp I X 均为Sigm a 公司产品,纯度>99%.考马斯亮蓝G -250,购自生工生物工程(上海)有限公司.己烷、丙酮、N H 4OH 、95%乙醇、85%磷酸等均是国产分析纯试剂.1.1.3　实验仪器　UN I CO -2000型分光光度计,珀金-埃莫尔L S -50B 型荧光光度仪.1.2　实验方法1.2.1　试虫用药模拟大田用药,将不同浓度的以52氨基乙酰丙酸为主要成份的卟啉杀虫剂涂于虫体背面,试虫饲养在约(30×15×15)c m 的玻璃缸内.用药后试虫先经约7h ～10h 的无光照期,后置自然条件下培养.稻蝗若虫雌雄各4头,设2mm o l ・L -1ALA ,1mm o l ・L -1ALA 加2,22双吡啶(ALA +D )处理组及水处理对照组(CK 或T 5).稻蝗成虫雌雄各5头,T 1浓度为8mm o l ・L -1,T 2为6mm o l ・L -1,T 4为2mm o l ・L -1,对照组用蒸馏水处理.实验结果如表1、表2(P 198)及图1(P 198),图2(P 198)所示.1.2.2　毒性分析对处理组及相应对照组的试虫进行进一步毒性分析.用考马斯亮蓝法测定试虫体内蛋白含量,用珀金-埃莫尔L S -50B 型荧光光度仪检测试虫体内Pp I X 的含量.1.2.2.1　样品处理方法将试虫编号称重,每克组织加丙酮∶0.1m o l ・L -1N H 4OH =9∶1(V ∶V )溶液30mL ,然后用D Y 89- 型电动玻璃匀浆机匀浆约7m in ,等分匀浆液为两份,分别用于测定Pp I X 含量和蛋白含量.一份样品经3.9×104g 、0℃条件下离心10m in ,取上清液用己烷萃取,弃去上层液,下层液体于4℃冰箱保存,用于当日Pp I X 含量测定.另一份样品经1.5×104g 、4℃条件下离心20m in ,取上清液置于4℃冰箱保存,用于当日蛋白测定.表1　稻蝗若虫不同处理组试虫死亡数统计表时间(d )ALA ALA +D CK 21 31 1 43 1♀1 561 72 1♀　1♀累计4 1♀4 1♀2 1♀注:用药后的第1天ALA 、ALA +D 、CK 三个处理组都没有死虫1.2.2.2　标准工作曲线的制作用考马斯亮蓝法(B radfo rd ),以牛血清白蛋白(B SA )为标准白测定一系列浓度的OD 595值,作标准工作曲线.用珀金-埃莫尔L S -50B 型荧光光度仪,在Κex =314nm ,Κe m =631nm ,E x slit :10nm ,E m slit :791 李月梅等:卟啉杀虫剂对稻蝗的毒杀作用及机理初探5nm ,平滑度22.5的条件下测定一系列浓度的荧光强度(I N T )值,作标准工作曲线.表2　稻蝗成虫不同处理组试虫死亡数统计表时间(d )T 1T 2T 4CK (T 5)03　1♀11 1♀1 1♀3 1♀1 22 1♀2 1♀2 1♀31 2♀2 2♀45　1♀671 1♀　1♀2 累计5 5♀5 4♀5 2♀3 2♀注:03指CK 组死虫出现在用药后不足5h 内图1　稻蝗若虫死亡数量随作用时间的变化图2　稻蝗成虫死亡数量随作用时间的变化2　结果与分析讨论2.1　试虫用药实验结果分析2.1.1　稻蝗若虫用药实验结果与分析由表1及图1可看出,ALA 组试虫在用药后的第4d 死虫数达总数的1 2,其中4头雄虫全部死亡而雌虫只死了1头.ALA +D 组第4d 才开始有死虫,到第7d 也出现试虫多数死亡的现象,并且同样是雄的全死而雌的仅死了1头.与处理组相比,对照组试虫死虫数雄性是处理组的1 2,雌性与处理组相同,而且没有出现一天中多数死亡的现象.2.1.2　稻蝗成虫用药实验结果分析从表1及图2看出,处理组死虫情况大都集中在第2d 、3d 或4d ,对照组则分散在第1d 、2d 、3d 和第7d .处理组死虫数都比对照组高,且7d 内处理组试虫基本全部死亡而对照组死亡数仅为1 2.浓度高低对雄虫的致死情况无明显影响,而且低浓度对雄虫的致死程度更强.但雌虫的致死情况则随浓度的降低而减少.本实验中稻蝗成虫与若虫用药后生理反应方面相同的是:第一,处理组雄虫全部死亡;第二,试虫涂药后渐渐出现体色发白发干,身体失衡,爬壁困难直至不能爬行,最后倒地死亡的现象.2.2　毒性分析2.2.1　T 1及CK 两处理组毒性检测结果分析分A 、B 两组分别对T 1及CK 两处理的试虫进行毒性检测分析,检测结果见表3(P 199)和表4(P 199).由表3和表4可知,A 分析组中,处理组每g 组织蛋白含量的总平均值为58.719m g g ,对照组为106.61m g g ,前者比后者低近50m g g .B 分析组中,处理组每g 组织蛋白含量的总平均值为97.231m g g ,对照组为148.686m g g ,前者比后者同样低约50m g g .结合图3(P 200)可以看出,与对照组相比,在A 、B 两分析891山西大学学报(自然科学版) 28(2)　2005　组中经处理的试虫不同个体每g 组织蛋白含量都大大降低.同时由图4(P 200)可知,雄虫降低的量比雌虫降低的量多.就Pp I X 含量来看(见P 200图5,图6),A 分析组中,经处理的雄虫平均每m g 蛋白Pp I X 含量为1.064Λg ,对照组为0.713Λg ,处理组比对照组高0.351Λg m g .处理组雌虫平均每m g 蛋白Pp I X 含量0.7885Λg ,对照组为0.512Λg ,处理组比对照组高0.276Λg m g .由此看出,与对照组相比,处理组雄虫平均每m g 蛋白Pp I X 含量提高的量比雌虫提高的量多0.074Λg .同样,B 分析组中,经处理的雄虫平均每m g 蛋白Pp I X 含量比对照相高0.171Λg ,雌虫的高0.103Λg .处理组雄虫平均每m g 蛋白Pp I X 含量与对照组相比提高的量比雌虫的提高量多0.068Λg m g .结合用药实验中雄虫的死亡情况可知,卟啉杀虫剂的作用效果与Pp I X 含量具有相关性.将用药实验中处理组试虫出现的虫体发白发干现象,与毒性分析中得到的蛋白质含量较低的分析结果相联系推测,可能是由于脱蛋白造成虫体失水进而引起试虫出现发白发干.另外,用药实验中处理组与对照组相比雄性比雌性死得快且死虫数多,结合分析实验中雄虫平均每g 组织蛋白含量比雌虫低而雄虫平均每m g 蛋白Pp I X 含量比雌虫高的分析结果,可推知卟啉杀虫剂的作用效果与平均每g 组织蛋白含量以及平均每m g 蛋白Pp I X 含量呈相关性.表3　(A 组)T 1及CK 两处理组试虫毒性检测结果比较12345678类型T 1T 1T 1T 1CK CK CK CK 雌(♀)雄( )♀♀ ♀♀虫体重(g )0.2070.2080.3880.5600.2620.2750.2320.299加buffer (mL )6.216.2411.6416.807.868.256.968.97I N T55.471.682.358.398.899.865.488.2Pp I X 浓度(Λg mL )0.8381.4011.7730.9392.3462.3811.1861.978Pp I X 含量(Λg )5.2038.74220.63815.77518.44019.6438.23417.743OD 5950.0040.0170.0100.0360.0220.0400.0150.045蛋白质浓度(m g mL )0.6461.6861.3104.1872.5724.6301.8305.183蛋白质含量(m g )4.01210.52115.24870.34220.21638.19812.73746.492蛋白质含量(m g ) 每克组织19.38250.58239.299125.61177.160138.90254.901155.492雌雄分别求平均值34.98282.455108.031105.196总平均值58.719106.614Pp I X 含量(Λg )每毫克蛋白1.2970.8311.3530.2240.9120.5140.6420.382雌雄分别求平均值1.0640.7890.7130.512总平均值0.9260.613表4　(B 组)T 1及CK 两处理组试虫毒性检测结果比较12345678类型T 1T 1T 1T 1CK CK CK CK 雌(♀)雄( )♀♀ ♀♀虫体重(g )0.3000.2340.4380.4770.1650.2510.3990.274加buffer (mL )9.007.0213.1414.314.957.5311.978.22I N T37.160.650.540.333.148.434.234.5Pp I X 浓度(Λg mL )0.2021.0190.6680.3130.06320.5950.10140.112Pp I X 含量(Λg )1.8197.1528.7754.4810.3134.4791.2140.919OD 5950.0210.0230.0320.0350.0520.0500.0350.036蛋白质浓度(m g mL )2.4942.7153.7114.0435.9245.7034.0434.154蛋白质含量(m g )22.46719.06348.76757.32629.32642.39848.39834.146蛋白质含量(m g ) 每克组织74.8281.464111.340121.299177.733171.094121.299124.619雌雄分别求平均值78.142116.320174.414122.959总平均值97.231148.686Pp I X 含量(Λg )每毫克蛋白0.0810.3750.1800.0780.0110.1040.0250.027雌雄分别求平均值0.2280.1290.0570.026总平均值0.1780.042 综上所述,ALA 作用于蝗虫后,黑暗条件下诱导Pp I X 富集,进一步引起光照条件下试虫中毒死亡.这种光活化毒杀作用在其它试虫如粉蚊夜蛾及果蝇等一些昆虫中已被证实.本实验结果表明,引起试虫死亡的991 李月梅等:卟啉杀虫剂对稻蝗的毒杀作用及机理初探图3　不同个体每g组织蛋白含量比较图4　平均每g组织蛋白含量比较图5　不同个体每m g蛋白Pp I X含量比较图6　平均每m g蛋白Pp I X含量比较原因很可能是脱蛋白和Pp I X光敏毒性.据报道,富含原卟啉I X的昆虫暴露于光下3h～4h后便具有了光敏性[7].而类型 和类型 两种光敏机理都产生亲电子物,所以最具光敏性的靶标为富含电子的生物分子[1].因此,光活化杀虫剂攻击的靶标主要为生物膜,引起膜上不饱和脂肪酸、甾醇、蛋白质氨基酸残基等的氧化,破坏膜的结构和功能[9].由此可以看出脱蛋白的根本原因依然是光敏毒性.R ebeiz等分别于1988年和1990年先后两次实验证实当将ALA或ALA与其它调节剂一起喷洒于粉蚊夜蛾三龄若虫后,会引起黑暗条件下原卟啉I X在虫体内的大量富集从而导致光照下试虫死亡.本文的实验结果与该结论基本吻合.另外,1997年A fon so等人实验证实,卟啉主要影响酶的活性位点或靠近酶的活性位点的巯基,在紫外光照射下卟啉诱导蛋白降解,进而引起游离氨基含量的提高[10].这一实验结果与本实验得出的处理组与对照组比蛋白含量降低的结果基本一致.参考文献:[1]　THAM EU R BEN AM OR,G I UL I O JOR I,Sunligh 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uan ,030006,Ch ina ;2.Institu te of M od ern Che m istry ,S hanx i U niversity ,T aiy uan 030006,Ch ina )Abstract :O xy a ch inensis w as sp rayed w ith Po rphyrin in secticides agen t that is m ain ly con sisted of 52am ino levu lin ic ,all treated m ales died du ring a peri od of 7days w h ile the con tro lled m ales on ly do so in half .How ever ,the treated fem ales are hardly affected in the low er concen trati on .B y analyzing p ro topo rp hyrin I X (Pp I X )and p ro tein con ten t w ith fluo rescence spectra and b radfo rd ,the resu lts show that com p ared w ith the con tro lled ,the p ro tein con ten t per gram tissue in m ale body decreased .In A analysis group ,average p ro tein con ten t decreasing am oun t of m ale is 73.049m g g and B group is 106.27m g g ,how ever ,fem ale’s hardly decreased .A verage p ro tein con ten t of A analysis group decreasing am oun t is 22.741m g g and B analysis group is 0.640m g g .T he above resu lts suggested that the effect of Po rphyrin in sectivides agen t is related to p ro tein con ten t in tissue p er gram .In additi on ,com pared w ith thecon tro lled ,Pp I X con ten t increased .W h ich p artly co incide w ith the resu lts of Con tan tin A .R ebeiz.In A analysis group ,the average Pp I X con ten t per m illigram p ro tein of the treated m ale increased by 0.351Λg than the con tro lled m ale w h ile the treated fem ale’s increasing am oun t is 0.227Λg ,the fo r m er h igher than the latter by 0.074Λg .In B analysis group ,the average Pp I X con ten t per m illigram p ro tein of the treated m ale is h igher than the con tro lled m ale by 0.171Λg w h ile the treated fem ale’s is 0.103Λg ,the fo r m er h igher than the latter by 0.068Λg .T he resu lts suggested that Pp I X con ten t of per m illigram p ro tein is relati on to the effect of Po rphyrin In secticides A gen t .It is the pho to sen sitive tox in that resu lts in the effect of the Po rp hyrin In sectivides on O xy a ch inensis .Key words :O xy a ch inensis ;52am ino levu lin ic ;Pp I X ;p ho to sen sitive tox in102 李月梅等:卟啉杀虫剂对稻蝗的毒杀作用及机理初探。