下载文档原格式
第25卷第4期2004年7月 江苏大学学报(自然科学版)Journal of Jiangsu University(Natural Science Edition) V ol.25N o.4July2004RNAi技术研究进展陈克平,唐旭东(江苏大学生命科学研究院,江苏镇江212013)摘要:RNAi是由双链RNA引起的基因沉默现象,它通过降解具有同源序列的mRNA起作用,特殊设计的siRNA能使目的基因发生特异性沉默.目前,获得siRNA已经非常方便,导入方式最常用的是微注射.RNAi技术有编码区RNAi和启动子区RNAi两大类,均可以产生类似基因敲除的功能,在家蚕功能基因的研究中已经使用了这种方法.随着RNAi技术的不断进步,RNAi可广泛地应用到功能基因组学,药物靶点筛选,疾病治疗等方面.关键词:RNAi;基因功能;RNAi技术中图分类号:Q756 文献标识码:D 文章编号:1671-7775(2004)04-0336-05Advances on research of RNA interferenceCHEN K e2ping,T ANG Xu2dong(Institute of Life Science,Jiangsu University,Zhenjiang,Jiangsu212013,China)Abstract:RNAi is a phenomenon of gene silence induced by double2stranded RNA(dsRNA)that is hom olo2g ous to target gene.N ow it is easy to obtain small interference RNA(siRNA),and siRNA is oftentransmittedinto organisms by microinjection.RNAi includes encoding region RNAi and prom oter region RNAi,which can be used to investigate gene function by degrading a special mRNA target in a cell or organism and thus knock2 ing out or knocking down the level of the encoded protein.They have been used to the analysis of silkw orm gene function.With the development of the technique,RNAi can be widely used to genomic analysis,medica2 tion target screening,disease treatment and s o on.K ey w ords:RNAi;gene function;RNAi technology R N Ai(R N A inter ference)是由双链R N A引发的转录或转录后基因沉默机制(post-transcriptional gene silenc2 ing,PTG S).长dsR N A被核酸酶降解成21～23bp大小的片段,与具有序列同源性的mR N A结合并使之降解,从而抑制基因的表达.目前已成功地在果蝇、线虫、锥虫、小鼠和哺乳动物中进行了R N Ai研究,其机制也逐渐被认识.由于其具有的独特优势,有望成为研究基因功能和进行基因治疗的有力工具.1 RNAi的产生与发展20多年前,Richard Jorgensen在研究改变色素的转基因矮牵牛时发现,导入色素外源基因并没有产生预期的花色加深,反而因为某些色素的缺失出现花色斑驳的现象.这表明不仅转进去的基因自身没有活性,外源DNA序列还在一定程度上对内源性基因表达产生阻断,把这种现象称为共抑制[1-3].1995年,美国华盛顿大学的G uo和K em phues[2]在研究线虫Caenorhabditis elegans中发现,用反义和正义RNA同样都有抑制par-1基因的表达.3年后(1998年),Fire和Mello及他们的研究组尝试使用反义RNA、正义RNA、dsRNA的阻断效应实验,发现作为沉默引发物的dsRNA混合物比单个收稿日期:2004-01-16基金项目:江苏省高新技术项目(BG2001317);国家财政部家蚕基因组计划技术平台建设项目作者简介:陈克平(1960-),男,安徽无为人,研究员,博士生导师(kpchen@),主要从事家蚕种质创新和家蚕功能基因组学的研究1正义或反义RNA 至少强10倍[4],他们把这种现象称为RNA 干涉(RNA interference ,RNAi )[5].RNAi 在自然界中广泛存在,目前已经在植物、真菌、囊虫、果蝇、线虫、鼠早期胚胎细胞、家蚕等不同种属的生物体中得到证实[6-8].由于它能够特异性地使一些基因得到沉默,所以可以代替基因敲除等研究特定基因的功能.随着人类基因组计划测序工作的完成,人类将进入后基因组时代即研究功能基因组学时代,确定特定基因的功能,迫切需要一种简单经济的方法进行研究,RNAi 以其独特的优势越来越受遗传学家和生物学家的重视,其机理也逐渐被人们阐明.2 RNAi 干涉的机制随着遗传和生化方面的研究不断深入,人们开始逐步了解RNAi 的发生机制.初步认为RNAi 主要分为三个阶段(图1).图1 RNAi 过程示意图Fig.1 Process of RNA inter ference (1)起始阶段.dsRNA 进入细胞,RNAi 核酸酶与dsRNA 结合,并将之降解成21～23bp 小的片段dsR 2NA (small interference RNA ,siRNA ),后者与RNAi 核酸酶结合成复合物.由于siRNA 和RNase Ⅲ切割产物的相似性,Benda Boss 等认为在形成siRNA 的过程中有RNase Ⅲ的参与[9,10],Bernstein 和他的同事发现果蝇中RNAi 的发生与这种酶有关,他们把这种蛋白称为Dicer [11].除了含有两个RNase Ⅲ共有区域外,Dicer 还含有一个解旋酶区域、一个dsRNA 结合区域和一个PAZ 区域.Dicer 酶具有高度保守性,在果蝇、烟草、线虫、哺乳动物和神经细胞中发现能够将相应种属的dsRNA 加工成特定长度的siRNA [12].最近,RNase Ⅲ接触反应区域结构的阐明导致了Dicer 切割产生22bp 片段模型的建立.在该模型中认为细菌RNase Ⅲ以二聚体酶形式起作用,反向平行的RNase Ⅲ区域产生两个复杂的接触反应中心.(2)效应阶段.复合物中siRNA 作为模板,其反义链与对应的同源mRNA 结合,有义链解离出来,mRNA 定位在原来有义链的位置上,同时降解mRNA并释放出RNAi 核酸酶,然后重复这一过程,特异性降解下一个对应的mRNA [13].在果蝇中,RNAi 通过一种称为RNA 诱导沉默复合物(RNA 2induced silenc 2ing com plex ,RISC )识别和降解目的mRNA [14].Z am ore 和他的同事们最近发现RISC 在胚胎提取物中以大约250kDa 大小的前体复合物的形式存在,在加入ATP 之后被激活形成约100kDa 大小的能切割mR 2NA 的复合物[15].siRNA 是双链结构,含有2个3’端突出碱基和一个5’端磷酸基团,该结构有利于siR 2NA 与RISC 复合物的结合.(3)扩增和扩散阶段.siRNA 的反义链与目的mRNA 结合后不仅诱导RISC 对该基因进行降解,而且还激活RdRp (RNA dependent RNA polymerase )介导的单链RNA 的合成,产生大量的dsRNA ,这些dsR 2NA 又被切割成许多siRNA ,进入下一个RNAi 循环.因此只要注射很少量的dsRNA ,就能在整个生物体中发生基因沉默.类似的沉默现象在植物中也有发现,同时也发现RNAi 不但能渗透到整株植物中还能传递到通过嫁接移植的后代植株中[16].出现这种现象首先要求一个细胞间有传递信号的系统,其次要有一个增强信号的机制.最近研究提出一种称为转移RNAi 的现象,转移RNAi 指的是伴随一个特定基因沉默信号的迁移.例如在线虫中,瞄准3’端转录的RNAi 导致相应mRNA 的沉默和与目的序列具有同源性的siRNA 的产生,而且与目的基因上游序列互补的siRNA 也有产生和积累[17].当这些siRNA 与其他dsRNA 互补时,其他dsRNA 也被抑制,于是实现了转移.不管是在植物还是线虫中,dsRNA 诱导的基因沉默都需要RdRp 的参与,它能够增强RNAi 信号[18].这种现象容易导致“RNA 依赖RNA 聚合酶活性是RNAi 所必须的”.然而到目前为止,只有西红柿中的RdRp 显示有这种活性,要证实这一结论必须通过进一步的生化研究,才能揭示这些蛋白在733第4期 陈克平等:RNAi 技术研究进展RNAi中的作用机制.3 RNAi技术进行RNAi首先要进行的是目的基因的选择,在目前所进行的实验中一般选择对应于能被容易检测的表型的目的序列.自从发现使用cDNA模板RNAi突变拟表型的外显率比使用基因组模板高后, cDNA序列成为指定的模板.然而,在没有cDNA的情况下,也可以使用富含外显子的基因组序列.RNAi效率可能受所用dsRNA长度和结构类似物等其他因素的影响.传递dsRNA的方法也可能影响RNAi反应的强度.在 C.elegan中传递RNA最普遍的方法是对微生物多核体、体腔或内脏进行微注射.在C.elegan中对成年蠕虫进行微注射被认为是最有效的RNAi途径.虽然其他传递RNA的方法强度较小,但是dsRNA浸泡、给蠕虫喂养表明 C.ele2 gan dsRNA的 E.coli的方法已经被用来进行整个基因组功能分析和高通量筛选.311 编码区RNAi和启动子区RNAi技术根据所选用序列的不同,可将RNAi分为:(1)编码区RNAi技术.自1998年在线虫中发现RNAi现象以来,以基因编码区为靶序列的编码区RNAi技术已用于线虫功能基因组的研究.最初这种技术是通过注射或浸泡等方法直接导入到线虫的性腺或早期胚胎中.这些方法虽然可以关闭目的基因的表达,产生突变表型,但这种表型变化却不能遗传.这种早期的RNAi技术可以用于研究与胚胎发育有关的基因的功能,但由于细胞分裂造成dsR2 NA的稀释,使得这种方法在研究成体的基因功能时有一定的局限性.为弥补早期RNAi技术的不足, T avernarakis[19]等对RNAi技术进行了改进,将目的基因的靶序列以反向重复的方式,由热激启动子控制在转基因生物中表达.热激处理后,反向重复序列在细胞内开始转录,其产物会形成具发夹环结构的dsRNA,从而产生RNAi,使目的基因沉默.这种改进的RNAi技术与传统的RNAi技术相比,具有明显的优点:首先转基因可以遗传给后代,有利于突变的分析;其次dsRNA可以被诱导产生,RNAi能够在发育特定阶段出现,从而使研究发育早期必需基因在发育晚期的功能成为可能;另外,当用细胞特异性启动子控制dsRNA的表达时,可以研究特定基因在不同器官中的功能.(2)启动子区RNAi技术.M. F.Mett等证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21～23核苷酸长的片段,这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化,从而使启动子失去功能,使其下游基因沉默.由于多基因家族的各成员之间高度同源,因而使用编码区RNAi技术很难将各个成员区分开来研究,而多基因家族内的启动子序列通常比编码区变化大,采用启动子区RNAi技术有望将多基因家族的各个成员区分开来研究.这样综合编码区RNAi技术和启动子区RNAi技术的信息即可更全面地了解多基因家族各成员的功能.312 siRNA的获得及dsRNA的导入方法越来越多的研究人员开始采用siRNAs小分子来抑制特定的哺乳动物基因表达.到目前为止较为常用的5种制备siRNAs的方法包括:(1)化学合成,公司订购,比较方便但是价格贵成本高.(2)通过体外转录可以合成siRNAs,这种方法的成本相对化学合成法比较低,不足之处是实验的规模受到限制.(3)长片断dsRNAs经RNase III类酶降解(例如:Dicer, E.coli.RNase III),这个方法通常选择200～1000碱基的靶mRNA模版,用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA,然后用RNase III或Dicer 在体外消化得到多种siRNA混合物,优点在于可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤,缺点是有可能引发非特异的基因沉默,特别是同源或者是密切相关的基因.(4)siRNA表达载体或者病毒载体在细胞中表达siRNAs,多数的siRNA表达载体依赖3种RNA聚合酶III启动子(pol III)中的一种,操纵一段小的发夹siRNA在哺乳动物细胞中的表达.目前已经开始研究逆转录病毒和其他病毒载体用于siRNA表达,其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究,避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便.(5)PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达, siRNA表达框架(siRNA expression cassettes,SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模版,能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中,主要缺点是PCR产物很难转染到细胞中.dsRNA的导入方式.在线虫中最常用的是微注射法,该方法最早使用于细菌转化试验中[20,21],R. Bettencourt通过注射dsRNA到蚕蛹胸部成功地抑制了Hemolin基因的表达[21].后来又发现将线虫浸泡833 江苏大学学报(自然科学版) 第25卷于dsRNA溶液中能得到有效的RNAi[22].Timmons等用能表达线虫dsRNA的工程菌E scherichia coli喂养线虫后也能使线虫的基因沉默[23].到目前为止,通过其他方法进行RNAi得到的表型效果都比直接注射弱.电穿孔也是一种可行的方法,已经由Ng o成功地应用于锥虫的研究[24].对于某一特定的生物体, dsRNA的具体导入方法依生物体的性质而定,一般使用浸泡的方法比较简单,而对于外壳坚硬的如蚕卵等不宜进行微注射或浸泡效果不明显的研究对象,可使用喂养能表达特定dsRNA的工程菌或病毒的方式.313 在家蚕中进行的RNAiQuan和K anda等[25]注射对应于家蚕白卵基因(Bmwh3)的双链RNA到野生型家蚕前胚期卵中诱导了类似于White egg3位点突变产生的表型.用白卵和半透明幼虫肤色定义诱导表型.N orthern杂交分析显示注射后的胚胎中内生的Bmwh3基因的表达被完全抑制.而且,从质粒中来的与dsRNA连载一起的G FP dsRNA抑制G FP基因的表达但不抑制Bmwh3基因的表达,这验证了RNAi的序列特异性.具体实验过程如下:(1)构建Bmwh3dsRNA和G FP dsRNA.Bmwh3 925bp大小的一个片段以Bmwh3cDNA为模板, CT ACGG AG CC AT CGG AGG T ATT和GG CCG TG C AAA2CTG2 T AT CT ATG为引物进行扩增.G FP基因706bp大小的一个片段以质粒pPIG A3G FP为模板,TGG TG AG2 C AAGGG CG AGG AG和T CG T CC ATG CCG AG AG T2G AT为引物进行扩增.后将PCR片段克隆进PGE M2T质粒载体.分离插入双向Bmwh3和G FP基因PCR片段的质粒,质粒用P stⅠ酶切进行线性化,作为RNA合成的模板.每个目的基因的正义反义链RNA用Ri2 boMAX Large Scale RNA Production System2T7 (Promega)合成.RNA合成后,反应混合物用酚、氯仿抽提,乙醇沉淀,溶于无RNase的水中.相等摩尔量的正义和反义链混合在10mm ol/L T ris2HCl (pH715)/20mm ol/L NaCl缓冲液中,加热到95℃1 min.为完全退火成dsRNA,加热后的溶液在25℃下放置12～16h.退火dsRNA用RNase在37℃下处理30min,酚、氯仿抽提,乙醇沉淀,溶于蒸馏水.dsRNA 组成用非变性琼脂糖凝胶电泳确认.注射液通过将dsRNA溶解于蒸馏水准备.(2)幼虫在25℃下人工饲料喂养,卵产下4h 后,在25℃下019mm ol/L HCl浸泡1h以打破滞育.6～7h后,微注射dsRNA,每个卵中注射2～3μl 溶液.注射后将卵在25℃下发育胚胎,发育4d后能够存活的卵通过带G FP2滤波器的荧光显微镜观察G FP基因的表达.N orthern杂交分析显示注射后的胚胎中内生的Bmwh3基因的表达被完全抑制.4 RNAi应用前景及展望由于RNAi可以特异性地抑制基因的表达,同时可将抑制表达时间控制在发育的特定阶段,产生类似基因敲除的功能,可用来促进新基因功能的研究.Andrew等利用喂养线虫能分泌dsRNA的工程菌研究了线虫染色体I上约90%的预测基因,使该染色体上已知表型的基因数由70增加到378.与传统的研究基因功能方法相比,RNAi是一种反向基因分析方法,即已知特定的基因序列,通过阻断这一基因的表达而表现出功能或表型的改变,从而揭示基因与功能关系.RNAi有着古老的根源,在进化过程中具有抵抗病毒入侵、抑制转座子活性,是生物天然防御系统的重要组成部分.RNAi可利用统一基因家族中多个基因含有一段同源性较高的保守序列的特性,设计针对它的dsRNA,将多个基因同时沉默.如肿瘤就是由多个基因控制的,单一基因阻断不能完全阻断肿瘤的生长[26,27],而使用RNAi技术就有望通过注射一次设计好的dsRNA将多个相关肿瘤基因抑制,这为进一步开发治疗肿瘤药物提供了新的思路.参考文献(R eferences)[1] Fire A.P otent and genetic inter ference by double2strandedRNA in Caenorhabditis elegans[J].Nature,1998,391:806-811.[2] G uo S,K em phues KJ.par-1,a gene required for estab2lishing polarity in C.elegans embry os,encodes putativeSer/Thr kinase that is asymmetrically distributed[J].Cell,1995,81:611-620.[3] T imm ons L,Fire A.S pecific inter ference by ingested dsR2NA[J].Nature,1998,395:854.[4] T imm ons L,C ourt D,Fire A.Ingestion of bacterially ex2pressed dsRNAs can produce specific and potent genetic in2ter ference in Caenorhabditis elegans[J].G ene,2001,263:103-112.[5] Schmid A,Schindelhoz B,Z inn K.C ombination RNAi:amethod for evaluating the function of gene families inDrosophila[J].Trend Neurosic,2002,25(2):71-74. [6] Paddis on P J,Caudy A,Hannon GJ.S table suppression of933第4期 陈克平等:RNAi技术研究进展gene expression by RNAi in mammalian cells[J].SCI,2002,99(3):1443-1448.[7] E lbashir S M,Martinez J,Pakaniowska A,Lendeckel W,Tuschl T.Functional anatomy of siRNA for mediating effi2cient RNAi in Drosophila Melanogaster embry olysate[J].EMBO J,2001,20:6877-6888.[8] H olen T,Amarzguioui M,Wiiger M,Babaie E.P ostional ef2fect of short inter ferencing RNAs targeting the human coagu2lation trigger tissue factor[J].Nucleic Acid Research,2002,30(8):1757-1766.[9] Bass B L,D ouble2stranded RNA as a tem plate for gene si2lence[J].Cell,2000,101:235-238.[10] Cerutti L,M ian N,Bateman A.D omains in gene silencingand cell differentiation proteins:the novel PAZ domain andredefinition of the Piwi domain[J].Trends Biochem Sci,2000,25:481-482.[11] Bernstein E,Caudy A A,Hamm ond S M,Hannon G J.R ole for a bidentate ribonuclease in the initiation step ofRNA inter ference[J].Nature,2001,409:363-366. [12] K etting R F,et al.Dicer function in RNA inter ference andsynthesis of small RNA inv olved in development timing inC.elegans[J].G ene Dev,2001,15:2654-2659.[13] K amath R S,Martinez2Cam pos M.E ffectiveness of specificRNA-mediated inter ference through ingested double-stranded RNA in caenorhabditis elegans[J].G enome Biol,2001,2(1):RESE ARCH0002.[14] Hamm ond S M,Berstein E,Beach D,Hannon G J.AnRNA2directed nuclease mediates posttranscriptional gene si2lencing in Drosophila cells[J].Nature,2000,404:293-296.[15] Nykanen A,Hally B,Z am ore P D.ATP requirements andsmall inter fering RNA structure in the RNA inter ferencepathway[J].Cell,2001,107:300-321.[16] Palauqui J C,E lmayan T,P ollien J M,Vauchere H.Sys2temic acquired silencing:transgene specific post-transcrip2tional silencing is transmitted by grafting from silenced stocksto non-silenced scions[J].EMBO J,1997,16:4738-4745.[17] S ijen T.On the role of RNA am plification in dsRNa-trig2gered gene silencing[J].Cell,2001,107:465-476. [18] Schiebel W.Is olation of an RNA-directed RNA polymerase-specific cDNA clone from tomato[J].Plant Cell,1998,10:2087-2101.[19] Nektarios T avernarakis.Induction of RNA inter ference inCaenorhabditis elegans by RNAs derived from plants ex2hibiting post2transcriptional gene silencing[J].NucleicAcids Res,2002,30(7):1688—1694.[20] Fire A.Integrative trans formation of Caenorhabditis elegans[J].EMBO,1986(5):2673-2680.[21] Mello C C.E fficient gene trans fer in C.elegans:extrachro2m os omal maintenance and integration of trans formationingseguence[J].EMBO,1991,10:3959-3790.[22] Bettencourt R.Hemolin genesilencing by dsRNA injectedinto Cecropia pupae is to next generation embry os[J].InsectMolecular Biology,2002,11(3):267-271.[23] Andrew G.Functional genomic analysis of C.elegans chro2m os ome I by systematic RNA inter ference[J].Nature,2000,408:325-330.[24] Ng o H.D oubled2stranded RNA induces mRNA degradationin trypans ome brucei[J].Proc Natl Acad Sci,1998,95:14687-14692.[25] Quan G X,K anda T,T amura T.Induction of the white egg3mutant phenotype by injection of the double-strandedRNA of the silkw orm white gene[J].Insect Molecular Biolo2gy,2002,11(3):217-222.[26] 董雪伟,蒋敬庭.血清肿瘤标志物联合检测对胃癌的诊断评价[J].江苏大学学报(医学版),2002,12(1):612-613.DONG Xue2wei,J I ANG Jing2ting.Diagnosis evaluation ofblood serum tum or marker detection on gastris cancer[J].A2cademic Journal o f Jiangsu Univer sity(Medicine),2002,12(1):612-613.(in Chinese)[27] 方景海,赵竹清.桥小脑角肿瘤的诊断和治疗[J].江苏大学学报(医学版),2002,12(6):56-57.FANGJing2qing,ZH AO Zhu2qing.Diagnosis and treatmentof cerebellopontine angle tum ours[J].Academic Journal o fJiangsu Univer sity(Medicine),2002,12(6):56-57.(inChinese)(责任编辑 陈持平)043 江苏大学学报(自然科学版) 第25卷。
RNAi技术在遗传学方面的研究进展高利华 朱孟玲 (江苏农林职业技术学院 江苏句容 212400)R NA干扰(RN Ai)是最近几年发现和发展起来的一门新兴的在转录水平上的基因阻断技术 1。
RNA i是由双链R NA介导的,在转录后mRNA水平上关闭相应基因表达的过程,也就是序列特异性的转录后基因沉默(post-transcrip tional gene silencing,PT G S)。
RNA i是生物体中存在的一种普遍现象,代表了一种古老的细胞反应通路。
RNA i作为一种新兴的基因阻断技术,在基因组基因功能研究、遗传病的基因治疗和蛋白质功能研究方面已显示出巨大的前景。
为此,RNA i被美国!Science∀和!N ature∀杂志评为2002年度最重要的科技成果之一。
RNA研究的重大突破性进展,是近20年来可以与HGP相提并论的最重大的成果之一。
1 研究历史与分子机制1.1 研究历史1990年,为加深矮牵牛花的紫色,Jorgensen等人导入了一个强启动子控制的色素基因,可是结果与预期相反,许多花瓣颜色并未加深,反而呈杂色甚至白色,这是由于转基因和同源的内源基因的表达都被抑制了,Jorgensen把这个现象命名为共抑制(cosuppression)。
1995年,康奈尔大学的Su Guo博士在用反义RNA阻断线虫基因表达的试验中发现,反义R NA和正义RNA都阻断了基因的表达,他们对这个结果百思不得其解。
到1998年,A ndrew F ire的研究证明,在正义RNA阻断了基因表达的试验中,真正起作用的是双链R NA。
这些双链RNA是体外转录正义RN A时生成的,于是提出了R NAi 这个词。
2002年,Zernicka-Coetz等用双链RN A注射小鼠受精卵和着床前的胚胎,结果发现导入的双链RN A可以特异性地抑制C-mos、E-cadherin和GFP基因的表达。
Judy L ieberman和Pr emlata Shankar首先向公众宣布了在动物中利用RNA i技术治疗疾病的研究进展。
收稿日期:2007204204基金项目:新疆兵团科技局社会发展项目(2006GG31)作者简介:荣光(1978～),男,山东人,硕士研究生,主要从事动物传染病诊断与防制研究。
[21] 王艳华,李克生,才学鹏,等.弓形虫抗体免疫胶体金快速检测试纸条的研制[J].中国兽医科学,2007,37(1):29232.[22] 司进,朱荫昌,徐明,等.快速胶体染料试纸条法检测弓形虫病I g M抗体的研究[J].中国血吸虫病防治杂志,2005,17(2):93296.[23] Ho2yen D O,J A W L,Balfour A H,et al.U se of thepoly merase chain reacti on t o detect Toxoplas m a gondii inhu man bl ood sa mp les[J].J Clin Pathol,1992,45:9102913.[24] Savva D,Morris J C,Johns on J D,et al.poly merasechain reacti on for detecti on of T oxop las ma gondii[J].JM ed M icr obi ol,1990,31(1):25231.[25] Jauregui L H,H iggins J,Zarlenga D,et al.Devel op2ment of a Real2Ti m e PCR f or for detecti on of Toxop las magondii in p ig and mouse tissues[J].Clin M icr obi o,2001,39(6):206522071.[26] 戴克胜,李玉云,郝艳梅.先天致畸病原体感染多重PCR检测方法的建立[J].蚌埠医学院学报,2000,25(4):2372239.[27] 李爽,甘绍伯.原位PCR对弓形虫感染鼠病理检测效果的观察[J].中国人兽共患病杂志,2000,16(3):41243.[28] 郑兰艳,王海鹏.应用免疫2PCR检测弓形虫循环抗原的实验研究[J].中国人兽共患病杂志,2000,16(4):78280.[29] 罗文,余世,胡千里,等.应用荧光定量PCR及E L I S A法检测弓形虫感染分析[J].中国优生与遗传杂志,2002,10(1):31233.[30] 陈俏梅,张俐,何国声.检测实验动物弓形虫感染的两种PCR方法的建立和比较[J].中国兽医寄生虫病,2003,11(2):528.[31] 刘世国,刘明林,孟桂芳,等.弓形虫感染家兔精液中虫体含量的动态变化[J].中国人兽共患病学报,2006,22(4):3232325.中国兽医寄生虫病 2008,16(1):33237 Chinese Journal of Veterinary Parasit ol ogy・文献综述・RNA i技术及其在寄生虫研究中的应用荣 光1,2, 赵军明1,2, 王新华2, 薄新文2, 郑金海1,2, 陈护亚3(1.石河子大学动物科技学院,石河子832003;2.新疆兵团绵羊繁育生物技术重点实验室,石河子832003;3.陕西省汉中市畜牧兽医中心,汉中723000)摘 要: RNA干扰(RNA interference,RNA i)是一种新兴的基因阻断技术,它通过双链RNA分子的介导,特异性降解相应序列的mRNA,从而导致转录后水平的基因沉默,该技术自1998年首次报道以来已取得了重大研究进展。
RNAi技术在医学领域的研究进展【摘要】 rnai是利用内外源mrna沉默目标基因的现象，目前已经应用于临床疾病的治疗。
本文主要讲述rnai在病毒性、遗传性、肿瘤疾病治疗方面的应用，展现二十一世纪医学领域中治疗手段发展的新突破。
【关键词】 rnai 医学治疗rnai technology in the field of medicine research progress author: liangying lishufen yuantianyou【 abstract 】 use rnai is internal and external source mrna silence the target genes phenomenon, at present has been applied to clinical disease treatment. this article mainly described in viral, inherited, rnai tumor disease treatment application, show the 21 st century in the field of medical treatment of the development of new breakthrough.【 key words 】 rnai medical treatmentrnai（rna interference，rnai）即rna干涉，是生物体内普遍存在的一种生物学现象，是由双链rna（dsrna）参与指导的，在特定酶的参与下以外源和内源mrna为降解目标的转基因沉默现象。
在过去几十年里rnai一直是生物科学中的一个亮点，人们通过向有机体引入小片段干涉rna分子（small interfering rnas，sirnas）和发夹样rna分子（small hairpin rnas，shrnas）能够特异地降解目标mrna这一特性来探索基因功能。
RNA干扰技术及其在寄生虫研究中的应用
RNA干扰技术及其在寄生虫研究中的应用
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是双链RNA(dsR-NA)介导的序列特异靶基因转录后基因沉默的过程.RNAi天然存在于各种生物体中,如果蝇、线虫、原生动物、脊椎动物、高等植物等,在保持基因组的纯洁、抵抗病毒的入侵、控制生物发育、染色体的异染色质化等方面都具有非常重要的作用.自1998年Fire等[1]首次将RNAi现象定义为转录后基因沉默(PTGS)后,应用RNAi技术进行基因功能的研究迅速在各种生物中开展起来.本文就RNAi技术及其在寄生虫领域中的研究结果作一综述.
作者：姚利晓林矫矫蔡幼民作者单位：姚利晓(中国农科院上海家畜寄生虫病研究所农业部动物寄生虫学重点实验室,上海,200232;中国农业科学院研究生院,北京,100081)
林矫矫,蔡幼民(中国农科院上海家畜寄生虫病研究所农业部动物寄生虫学重点实验室,上海,200232)
刊名：中国人兽共患病学报ISTIC PKU 英文刊名：CHINESE JOURNAL OF ZOONOSES 年，卷(期)：2006 22(3) 分类号：Q852.7 关键词：。
鳞翅目昆虫RNAi新进展0 引言DNA 高通量和低成本的测序能力是现代生物学技术的最显著的进展，截至目前已有50个昆虫的基因组序列已完成或正在进行中（网址），在不久的将来至少每个昆虫目都有代表性的物种其基因组序列完成测序。
同时，基因组测序的不断发展也带来了众多未知功能的基因，特别是在这个令人惊奇的昆虫世界。
但是，这些发现导致的问题是如何揭示这些新基因的功能。
RNAi 技术通过降解选定基因的转录本产生功能缺失的表型，从而帮助我们克服所面临的挑战。
RNAi 不仅能够预测新基因的功能，揭示老基因的新功能，还能验证新基因已具有的功能[1]。
十年间，昆虫学家们从第一次在秀丽杆线虫中发现dsRNA 开始，逐步利用日益成熟的RNAi 技术，研究了大量基因的功能[2]。
特别是近三年来，生物学家们从模式生物果蝇[3] [4] [5]、家蚕[6] [7]，到非模式生物赤拟谷盗[8] [9]、甘比亚按蚊[10] [11]、烟粉虱[12]等，越来越多的基因功能被详细阐述，范围涉及昆虫的各大纲目[1]。
就如任何技术都有两面性一样，RNAi 也不尽完善，同样具有缺点和技术障碍，特别是昆虫的第二大目鳞翅目，这类昆虫由于自身较强的系统恢复和自愈能力使得活体RNAi 技术遇到了一定的挑战，如何保证靶基因的高效、特异性沉默成了鳞翅目昆虫RNAi 的核心问题。
本文利用已建立的昆虫基因功能研究的RNAi 技术平台，对甜菜夜蛾进行活体饲喂或注射dsRNA 片段来干扰昆虫生长发育，在几丁质合成相关基因的功能研究上取得了新进展。
本实验团队主要针对几丁质合成通路的始末酶即海藻糖酶和几丁质合成酶，以及几丁质合成的重要调控基因几丁质酶、海藻糖合成酶和蜕皮激素受体，通过有效的RNAi 研究这些基因的生理功能及对甜菜夜蛾蜕皮变态的影响。
1 研究进展1.1 利用 RNAi 技术研究几丁质合成酶基因A 的生理功能1.1.1 注射法RNAi 研究几丁质合成酶基因A 的生理功能几丁质合成酶作为几丁质合成通路的重要控制靶标，以两种形式存在于昆虫体内。
RNAi在昆虫基因功能研究中的应用进展作者：张涛郅军锐叶茂来源：《山地农业生物学报》2018年第06期摘;要：RNA干扰（RNA interference，RNAi）是由小分子dsRNA引起目的基因mRNA序列特异性降解，导致靶标基因沉默或表达量下调的现象。
RNAi在昆虫重要生理酶相关基因功能的研究中起着至关重要的作用。
本文主要对RNAi不同方法的应用、各方法的优缺点及影响RNAi效率的因素进行了综述，总结了RNAi不同方法对昆虫功能基因沉默效果的差异，及在昆虫基因功能研究中的应用进展。
关键词：RNA干扰;基因功能;脱靶效应;害虫防治中图分类号：S476文献标识码：A文章编号：1008-0457（2018）06-0063-07;国际DOI编码：10.15958/ki.sdnyswxb.2018.06.011昆虫的RNA干扰（RNA interference，RNAi）主要指外源双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的，通过阻碍特定基因的翻译或转录，引起内源靶标mRNA降解，从而导致靶标基因沉默或表达量明显下调的现象[1]。
对于揭示昆虫生长发育及抗性相关基因的功能具有不可或缺的作用。
近年来，基于昆虫基因组学[2-3]、转录组学[4]、代谢组学[5]、蛋白质组学[6]等分子生物学技术的发展。
RNAi自1998年在对秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans 进行基因沉默的研究中发现以来[7]，RNAi技术已经被广泛应用于现代农业领域，其应用主要包括作物品种改良、生物防治、昆虫抗药性功能基因研究等方面[1]。
精确地说就是应用于基因功能和信号传导通路研究[8]。
近年来，RNAi技术在昆虫基因功能方面的研究也是如火如荼，不仅可以用于控制害虫，也可以利用RNAi保护益虫[9]。
RNAi方法自从被发现至今，就备受害虫防治研究领域的学者们青睐。
昆虫的RNAi因其具有较强的特异性、对环境相对友好以及高效等特点，在基因功能、抗药性研究和害虫防治等方面的研究不断取得新的进展[10-11]。
RNAi技术的发展与进展RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种基因调控机制，它通过降解靶基因的mRNA，从而抑制或靶向基因表达。
自从RNAi被发现以来，它已经成为了生物研究、医学治疗，甚至是基因编辑的主要方法。
本文将探讨RNAi技术的发展与进展。
1. RNAi的发现和原理RNAi最早是在1998年由Andrew Fire和Craig Mello以线虫为模型生物发现的。
随后，RNAi被证明成为了所有真核生物都存在的现象。
RNAi的原理是利用双链RNA（dsRNA）的某一个部分诱导RNA内切酶复合物（RISC）的结合并裁剪其与mRNA互补的同源序列的mRNA，从而降低其表达。
RNAi还可以通过特殊的RNAs载体将siRNA引入到细胞中，从而实现特定基因表达的精确控制。
2. RNAi在基因敲除中的应用RNAi是基因敲除的一种基本技术。
在RNAi中，siRNA（short interfering RNA）可以被特异地引导RISC与mRNA靶向结合并降低基因表达水平。
这个过程是高度特异性，并且能够准确地敲除一个特定的靶基因。
因此，RNAi在基因敲除领域中成为了不可或缺的一种工具。
3. RNAi在研究中的应用RNAi在基因功能研究中广泛应用。
通过siRNA介导的RNAi治疗，可以实现对基因的精确控制，以便探究基因的功能和调控机制。
通过RNAi技术敲除一个基因还可以帮助人们揭示该基因的功能是否与某种疾病相关，并且可以用RNAi技术探究不同类型肿瘤细胞中的基因表达情况，从而进一步理解肿瘤发生和发展的机制。
4. RNAi在药物研发中的应用RNAi技术在药物研发中也有很大的潜力。
利用RNAi技术可以快速地识别和验证新的潜在药物靶点，并且能够对药物的作用实施更直接、更细致的监测和反馈。
因此，RNAi被视为一种快速、高效的药物筛选平台。
同时，RNAi还可以用于治疗许多由基因突变引起的疾病，包括癌症、感染和遗传性疾病。
生物学中的RNAi技术及其应用前景RNAi技术是指通过RNA介导的基因沉默作用，对靶向基因进行剪切或阻止转录，从而达到控制某种生物过程的目的。
RNAi技术近年来得到了广泛的关注和应用，其在基础生物学研究、生物技术和医药领域均有着重要的应用前景。
RNAi技术的基本原理是通过外源RNA分子（RNA干扰分子）进入细胞，切断靶向RNA分子（载体mRNA），从而避免其参与相应基因的表达，使该基因的表达水平下降。
RNA干扰分子可以是小干扰RNA（siRNA）或microRNA （miRNA）。
siRNA是双链RNA分子，通过与特定RNase酶的结合，进入RNA诱导沉默复合体（RISC）并沉默靶向基因；miRNA则是单链RNA，其通过与RISC的结合实现对基因的沉默。
RNAi技术的应用十分广泛，它可以用于基础生物学实验室中探索基因的功能、研究基因调控网络和信号通路。
例如，RNAi技术可以用于筛选靶向基因，帮助研究人员了解特定基因的功能和相互作用。
此外，RNAi技术也可以用在生物技术领域，例如基因治疗。
研究人员可以将具有治疗作用的siRNA送入人体细胞，从而沉默其特定基因，以达到治疗疾病的目的。
RNAi技术也可以用于农业生产中，例如通过沉默植物高度调控基因，以提高作物耐旱、抗病、高产等特性。
此外，RNA干扰还可以用于研究肿瘤基因并开发靶向性抗癌药物等方面。
然而，在RNAi技术的应用中，还存在一些问题和挑战。
例如，RNAi技术在使用非转染方法时，往往存在进入效率低、沉默效果不稳定等问题；而在使用转染方法的情况下，很容易发生细胞毒性等问题。
此外，RNA干扰分子的大量制备和稳定性也是RNAi技术应用的另一个难点。
因此，我们需要对RNAi技术进行不断的改进和优化，以更好地适用于不同的生物实验和应用领域。
总之，RNAi技术是一种非常有前途的生物技术手段，其广阔的应用前景将在未来的生命科学研究和医药产业中发挥越来越重要的作用。
