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图1高效液相色谱仪的系统流程图原理

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高效液相色谱HPLC基本原理ppt课件

高效液相色谱HPLC基本原理ppt课件

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3）示差折光检测器
原理：利用两束相同角度的光照射溶剂相和样 品+溶剂相，利用二者对光的折射率不同，其中一束 （通常是通过样品+溶剂相）光因为发生偏转造成两 束光的强度差发生变化，将此差示信号放大并记录， 该信号代表样品的浓度。
为通用型检测器，灵敏度为10-7g/mL。但对温 度变化敏感，且不适于梯度淋洗。
当采用粘度较大的试剂，如CC4，CH3OH, 丙酮，二氧杂环已烷、THF 等。 填充方法：
填充时，按上述方法制作匀浆液，用流动相充满色谱柱及其延长管中， 然后将匀浆液倒入匀浆填充器，在较高压力下迅速将其注入色谱柱内。要 求填充速度快(防凝聚、沉降或结块)、且无空气进入(影响填充均匀性)。
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3. 色谱柱
1）对色谱柱的要求：内壁光滑的优质不锈钢柱，柱接头的死体积尽可能小。 柱长多为15~30cm，内径为4~5mm(尺寸排阻色谱柱常大于5mm，制备色谱 柱内径更大)； 2）柱的填充：主要采用匀浆法。根据使用匀浆试剂的性质不同可分为： 平衡密度法：
即使溶剂密度和填充颗粒密度相近，此时颗粒沉降速度趋于0。常用的 匀浆试剂有四氯乙烯、四溴乙烷和二碘甲烷等； 非平衡密度法：
Deuterium lamp
Lens
Lens system Holmium filter Detector cell
Optical slit
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Diode Array
Grating 33
Time msec
LIGH T
PHOTODIOD E
Wavelength nm

图1高效液相色谱仪的系统流程图原理

图1高效液相色谱仪的系统流程图原理
HPLC成为解决生化分析问题最有前途的方法。因而被广 泛应用到生物化学、食品分析、医药研究、环境分析、无机分 析等各种领域。高效液相色谱仪与结构仪器的联用是一个重要 的发展方向。
液相色谱- 质谱连用技术受到普遍重视, 如分析氨基甲酸酯 农药和多核芳烃等; 液相色谱- 红外光谱连用也发展很快,如在环 境污染分析测定水中的烃类, 海水中的不挥发烃类, 使环境污染 分析得到新的发展。
高效液相色谱仪的应用
高效液相色谱法只要求样品能制成溶液, 不受样品挥发性的 限制,流动相可选择的范围宽,固定相的种类繁多,因而可以分离 热不稳定和非挥发性的、离解的和非离解的以及各种分子量范 围的物质。
与试样预处理技术相配合,HPLC 所达到的高分辨率和高灵 敏度, 使分离和同时测定性质上十分相近的物质成为可能,能够 分离复杂相体中的微量成分。随着固定相的发展, 有可能在充分 保持生化物质活性的条件下完成其分离。
（2）高压输液泵容易出现的问题是：①压力升不上去：检查一下桌面上是否 有漏下的液滴，如果有拧紧漏液处即可。②压力过高：看一下抽取流动相的 塑料管里是否有气泡，如果有，则按一下Stop，这时候千万别抽气泡，等压 力降下来，最好到0Psi，这时候抽出气泡。如果在过高的压力下抽气泡，后 果会非常严重，流通池会被鼓破，无法分析样品，并且会给你带来很多困 惑，当然如果有经验的话会及时发现，因为流通池破了后会流出蓝色的墨水 样的液体。
高速——流速为0.1～10.0 mL/min。 高效——塔板数可达5000/米。在一根柱中同时分离成份可达 100种。 高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品 少。 HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：
速度快——通常分析一个样品在15～30 min，有些样品甚至在 5 min内即可完成。

高效液相色谱仪 工作原理

高效液相色谱仪 工作原理

高效液相色谱仪工作原理
一、压力流动
高效液相色谱仪中的压力流动是靠高压泵来实现的。

高压泵是产生高压输送液体的装置，它将储液器中的溶剂经流经进样阀的液体送入色谱柱，并使柱内液体流动保持一定流速。

在高效液相色谱中，为了获得一致的柱压，流速必须是恒定的。

在排除压力波动等因素后，只要柱压恒定，流速就恒定。

二、吸附/洗脱过程
在高效液相色谱中，分离过程本质上是溶液中被分离物质在两相之间进行分配的过程。

在固定相和流动相之间，被分离物质依据其在两相之间的分配达平衡后进行分离。

这个过程分为两个步骤：在两相间达到平衡和从两相中分离。

三、分离
分离是高效液相色谱仪中的核心部分，主要通过色谱柱实现。

色谱柱由固体吸附剂或涂层填充剂填充于直径约为1-5mm的玻璃或金属球体中制成。

样品溶液经过高压泵注入，进入色谱柱。

在色谱柱中，不同组分依据其在固定相和流动相之间的分配系数差异进行分离。

四、检测
检测器是高效液相色谱仪中的重要部分，用于对被分离的组分进行检测和测量。

检测器根据物质的物理或化学属性将组分转化为可测量的电信号，如紫外-可见光吸收、荧光、电化学等。

这些信号被记录并用于确定被分离组分的浓度和数量。

五、数据处理
数据处理是高效液相色谱仪中的最后一步，通过计算机软件对采集到的数据进行处理和分析。

数据处理主要包括数据采集、数据预处理、色谱峰识别和定量分析等步骤。

数据处理结果以图谱形式呈现，通过图谱可以直观地了解样品中各组分的含量和分布情况。

高效液相色谱的原理与构造.pptx

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2.4 HPLC的基本类型：
等度： —吸光度相同； —在整个运行过程中溶剂组成保持不变 (60:40 甲醇/水)
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梯度： —在运行过程中溶剂组成变化； —渐变或台阶式变化。 100% H20/ 0% MeOH 到0% H2O/100% MeOH
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三、HPLC分离公式与术语
色谱图：—样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称 色谱流出曲线(elution profile)。这是一张由仪器提供的表示分离状况的色谱图，这张色谱图含有丰富的信息，现在我们来测量色谱图并以此对一些基本理论展开讨论。
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（2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体） 30～40μm的玻璃微球，表面附着一层厚度为1 ～ 2μm的多孔硅胶。 表面积小，柱容量底；
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（3）化学键合固定相
化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广； c. 硅碳键型： ≡Si—C d. 硅氮键型： ≡Si—N
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四元泵包括一个溶剂槽、一个真空脱气机和一个四通道梯度泵。四通道的梯度泵包括一个高速配量阀和一个泵组件。它通过低压混合来产生梯度。
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四元泵的液路图
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4.3 自动进样器
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流路中为高压力工作状态；通常使用耐高压的六通阀进样装置；其结构如图所示：
（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。
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高效液相色谱仪的工作原理幻灯片课件

高效液相色谱仪的工作原理幻灯片课件
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气相色谱法的特点
（1）分离效能高。对物理化学性能很接近的复杂混 合物质都能很好地分离，进行定性、定量检测。有 时在一次分析时可同时解决几十甚至上百个组分的 分离测定。 （2）灵敏度高。能检测出ppm级甚至ppb级的杂质含 量 （3）分析速度快。一般在几分钟或几十分钟内可以 完成一个样品的测定。 （4）应用范围广。气相色谱法可以分析气体、易挥 发的液体和固体样品。就有机物分析而言，应用最 为广泛，可以分析约20%的有机物。此外，某些无机 物通过转化也可以进行分析。
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气相色谱仪的常用检测器
• 1.TCD（热导检测器） • 2.FID（氢火焰离子化检测器） • 3.FPD（火焰光度检测器）
• 4.NPD（氮磷检测器）
• 5.ECD（电子捕获检测器）
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热导检测器TCD
原理：气流中样品浓度发生变化，则从热敏元件上 所带走的热量也就不同，从而改变热敏元件的电阻 值，由于热敏元件为组成惠斯顿电桥之臂，只要桥 路中任何一臂电阻发生变化，则整个线路就立即有 信号输出。 特点：此检测器几乎对所有可挥发的有机和无机物 质均能响应。但灵敏度较低，被測样品的浓度不得 低于万分之一。属非破坏性检测器。
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氢火焰离子化检测器FID
• 原理：在氢氧焰的高温作用下，许多分子均将 分裂为碎片，并有自由基和激态分子产生，从 而在氢焰中形成这些高能粒子所组成的高能区， 当有机分子进入此高能区时，就会被电离，从
而在外电路中输出离子电流信号。
• 特点：体积小，灵敏度高，死体积小，应答时
间快，但对部分物质如H2、O2、N2、CO、CO2、
氮磷检测器NPD
• 原理:在FID中加入一个用碱金属盐制成的玻璃珠
当样品分子含有在燃烧时能与碱盐起反应的元素 时，则将使碱盐的挥发度增大，这些碱盐蒸气在

高效液相色谱HPLC流程示意图PPT课件

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样品所含组分的最少个数； 定性分析（保留值）； 定量分析（峰高或面积）； 分离效能（保留值及区域宽度）； 两相选择的依据（峰间距离）
论文内容
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高效液相色谱(HPLC)流程示意图
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HPLC组成图
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HPLC组成示例
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高效液相色谱法的特点
▪ 高压：一般可以达到150~300kg/cm2 ▪ 高速：一般可以达到1~10mL/min ▪ 高效：一般可以达到60000理论塔板/米 ▪ 高灵敏度 ：微升数量级的就可以进行全分析
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➢分类：液—液分配色谱
液—固分配色谱 离子交换色谱 排斥色谱
➢选择：样品的分子量范围
溶解度 分子结构
❖20世纪60年代后期 液相色谱法得到了快速
发展
论文内容
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❖ 分配系数 K和分配比k K=(溶质在固定相中的浓度)/(溶质在流动相中的
浓度) =Cs / Cm
K为每一溶质的特征值，仅为固定相和温度有关， 与两相体积论文内容、柱管特性及仪器无关。 k=(组分在固定相中的质量)/(组分在流动相中的质 量)
论文内容
➢ 色谱分析方法发展概述 ➢ 分类 ➢ 基本原理
➢流出曲线及有关术语 ➢高效液相色谱简介
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❖1903年 Tswett创立色谱法（在碳酸钙上分 离了叶绿素）
❖20世纪四五十年代 出现了纸色谱（PC)和 薄层色谱法（TLC)
❖1952年 James和Martin提出了气相色谱法 （GC)
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高效液相色谱的应用
高效液相色谱，特别适用于分离 沸点高和热稳定性差的物质，目前已 广泛应用于化工、食品、医药、生化、 卫生、环境保护和高能化合物等生产 和科研工作中。

高效液相色谱仪的结构

高效液相色谱仪的结构

四、高效液相色谱仪的结构高效液相色谱仪由高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、记录系统 部分组成(图3-1-2 )。

分析前，选择适当的色谱柱和流动相，开泵，冲洗柱子，待柱子达到平衡而且基线平直后，用微量注射器把样品注入进样口，流动相把试样带入色谱柱进行分离， 分离后的组分依次流入检测器的流通池， 最后和洗脱液一起排入流出物收集器。

当有样品组 分流过流通池时，检测器把组分浓度转变成电信号，经过放大，用记录器记录下来就得到色谱图。

色谱图是定性、定量和评价柱效高低的依据。

图3-1-2高效液相色谱仪的结构示意图1•高压输液系统高压输液系统由溶剂贮存器、高压泵、梯度洗脱装置和压力表等组成。

(1) 溶剂贮存器。

溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或氟塑料制成，容量为1〜2L ,用来 贮存足够数量、符合要求的流动相。

(2) 高压输液泵。

高压输液泵(图 3-1-3)是高效液相色谱仪中关键部件之一，其功能是将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分 离过程。

由于液相色谱仪所用色谱柱径较细， 所填固定相粒度很小，因此，对流动相的阻力较大， 为了使流动相能较快地流过色谱柱，就需要高压泵注入流动相。

对泵的要求：输出压力高、 流量范围大、流量恒定、无脉动，流量精度和重复性为 0.5%左右。

此外，还应耐腐蚀，密封性好。

高压输液泵，按其性质可分为恒压泵和恒流泵两大类。

恒流泵是能给出恒定流量的 泵，其流量与流动相粘度和柱渗透无关。

恒压泵是保持输出压力恒定，而流量随外界阻力变 化而变化，如果系统阻力不发生变化，恒压泵就能提供恒定的流量。

等五大流动招出口I 肮动10逬口图3-1-3恒流柱塞泵（3）梯度洗脱装置。

梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一 定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、 pH 值或离子强度相应地变 化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。

液相色谱仪工作流程图

液相色谱仪工作流程图

液相色谱仪工作流程图(原理）南京科捷是分析仪器生产型厂家，专业生产气相色谱仪、液相色谱仪、色谱仪配件、色谱零件，并提供色谱仪售前售后服务。

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现在的液相色谱仪一般都做成一个个单元组件，然后根据分析要求将各所需单元组件组合起来.最基本的组件是高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器和数据系统（记录仪、积分仪或色谱工作站)。

此外,还可根据需要配置流动相在线脱气装置、梯度洗脱装置、自动进样系统、柱后反应系统和全自动控制系统等.图８-1是具有基本配置的液相色谱仪的工作流程图。

液相色谱仪的工作过程：输液泵将流动相以稳定的流速（或压力)输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导入，流动相将样品带入色谱柱,在色谱柱中各组分因在固定相中的分配系数或吸附力大小的不同而被分离,并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据系统记录、处理或保存.图8-1是具有基本配置的液相色谱仪工作流程图：进样器从液相色谱仪工作流程图看出,进样器是将样品溶液准确送入色谱柱的装置，分手动和自动两种方式。

ﻫ进样器要求密封性好，死体积小，重复性好，进样时引起色谱系统的压力和流量波动要很小。

现在的液相色谱仪所采用的手动进样器几乎都是耐高压、重复性好和操作方便的六通阀进样器，其原理与气相色谱中所介绍的相同。

色谱柱１. 色谱柱的构成从液相色谱仪工作流程中看到，色谱柱是实现分离的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能稳定。

柱性能与柱结构、填料特性、填充质量和使用条件有关.色谱填料：经过制备处理后,用于填充色谱柱的物质颗粒，通常是5-10粒径的球形颗粒. 色谱柱管: 内部抛光的不锈钢管。

典型的液相色谱分析柱尺寸是内径4.6mｍ，长250mm。

色谱柱：也称固定相,是将色谱填料填充到色谱柱管中所构成的，其结构如图8-８所示。

2。

色谱柱的填充干法填充：在硬台面上铺上软垫，将空柱管上端打开垂直放在软垫上,用漏斗每次灌入５０—100mｇ填料，然后垂直台面墩10—2０次。

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原理 基本结构
优点 应用 使用注意事项
检测器
高效液相色谱仪常用的检测器有紫外 吸收、示差折光率、荧光和安培检测 器等，对它们的要求和性能指标与气 相色谱检测仪基本相同。检测器主要 分为紫外吸收检测器、荧光检测器和 示差检测器。
原理 基本结构
优点 应用 使用注意事项
高效液相色谱仪的优点
高压——压力可达150～300 kg/cm2。色谱柱每米降压为75 kg/cm2以上。
组成。储液器中的流动相被高压泵打入系 统, 样品溶液经进样器进入流动相, 被流动 相载入色谱柱(固定相) 内, 由于样品溶液 中的各组分在两相中具有不同的分配系数, 在两相中作相对运动时, 经过反复多次的 吸附- 解吸的分配过程, 各组分在移动速度 上产生较大的差别, 被分离成单个组分依 次从柱内流出, 通过检测器时, 样品浓度被 转换成电信号传送到记录仪,数据以图谱形 式打印出来。
原理 基本结构
优点 应用 使用注意事项
高压泵
泵应耐压、耐腐蚀、密封性好。高压泵主要用 于输送流动相，其压力一般为几兆帕至数十兆 帕。这是液体的黏度比气体大 100 倍，同时由 于固定相的颗粒极细，柱内压降大，为保证一 定的流速，必须借助高压迫使流动相通过柱 子。高压泵应无脉动或脉动极小，以保证输出 的流动相具有恒定的流速，同时采用脉动阻尼 装置可将产生的脉动除去，使流动相的流量变 动范围不宜超过 2%~3%。高压泵主要分为恒 压泵、恒流泵和螺旋传动注射泵三类。
原理 基本结构
优点 应用 使用注意事项
色谱柱
色谱柱是整个色谱系统的心脏，它的质量优劣直接影响 到分离的效果，一般情况下色谱柱通常采用优质不锈钢 管制成，并且柱内壁必须光洁平滑，否则内壁的纵向沟 痕和表面多孔性也会引起谱带的展宽，柱接头的体积应 尽可能小，柱长一般为 10 cm ~25cm，内径 4 mm ~5mm。若使用直径为5μm~10μm 固定相颗粒，理论塔板 可达到 5×104/m。尺寸排阻色谱柱的内径通常大于 5mm，制备色谱柱则会更大 ；为了减少溶剂用量，可采 用微径柱，内径为 1mm，长度为 30mm ~75mm，若采用 3μm 颗粒，理论塔板数高达 1×105/m。为了保护分析柱 不被污染，有时需在分析柱前加一短柱，约数厘米长， 此柱称为卫柱，为了防止卫柱过分增加柱阻力，在卫柱 中使用的颗粒大小约为 10μm ~30μm
分辨率高——可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。 灵敏度高——紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可 达0.1pg。 色谱柱可反复使用——用一根色谱柱可分离不同的化合物。 样品量少，容易回收——样品经过色谱柱后不被破坏，可以收 集单一组分或做制备。
原理 基本结构
优点 应用 使用注意事项
原理 基本结构
优点 应用 使用注意事项
贮液器
贮液器是用于存放溶剂的装置。贮液器 中的溶剂必须很纯，贮液器材料要耐腐 蚀，对溶剂呈惰性，一般情况下通常采 用1升~2升的大容量玻璃瓶，也可采用 不锈钢制成的容器，贮液器应配有溶剂 过滤器，以防止流动相中的颗粒进入泵 内，溶剂过滤器一般用耐腐蚀的镍合金
制成，孔隙大小一般为2μm。
原理 基本结构
优点 应用 使用注意事项
进样器
高效液相色谱仪进样器普遍使用高压进样 阀，用微量注射器将样品注入样品环管，使 用的样品环管分别有不同的尺寸，可根据分 析要求选用。当进样阀手柄放在吸液位置 时，流动相直接通过孔的通路流向色谱柱， 样品通过注射器从另外的位置进入样品环 管，如果有过量的样品则会从出口孔排出， 然后将手柄转到进样位置，此时流动相便将 样品带进了柱子。
原理 基本结构
优点 应用 使用注意事项
脱气器
脱气的目的是为了防止流动相从高压柱 内流出时释放出气泡进入检测器而使噪 声剧增，至使不能正常检测，一般情况 下通常采用氦气鼓泡来驱除流动相中溶 解的气体，因为氦气在各种液体中的溶 解度极低，所以必须先用氯气快速清扫 溶剂数分钟，然后再使氦气以极小流量 不断流过此溶剂。
HPLC成为解决生化分析问题最有前途的方法。因而被广 泛应用到生物化学、食品分析、医药研究、环境分析、无机分 析等各种领域。高效液相色谱仪与结构仪器的联用是一个重要 的发展方向。
液相色谱- 质谱连用技术谱- 红外光谱连用也发展很快,如在环 境污染分析测定水中的烃类, 海水中的不挥发烃类, 使环境污染 分析得到新的发展。
高速——流速为0.1～10.0 mL/min。 高效——塔板数可达5000/米。在一根柱中同时分离成份可达 100种。 高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品 少。 HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：
速度快——通常分析一个样品在15～30 min，有些样品甚至在 5 min内即可完成。
高效液相色谱仪的应用
高效液相色谱法只要求样品能制成溶液, 不受样品挥发性的 限制,流动相可选择的范围宽,固定相的种类繁多,因而可以分离 热不稳定和非挥发性的、离解的和非离解的以及各种分子量范 围的物质。
与试样预处理技术相配合,HPLC 所达到的高分辨率和高灵 敏度, 使分离和同时测定性质上十分相近的物质成为可能,能够 分离复杂相体中的微量成分。随着固定相的发展, 有可能在充分 保持生化物质活性的条件下完成其分离。
高效液相色谱仪
制作人：何朦朦 组 员：沈夏洁
周天逸 吴方威
高效液相色谱仪的原理
原理 基本结构
特点 应用 使用注意事项
高效液相色谱仪的系统流程图如图 1所示。 图 1 高效液相色谱仪的系统流程图
原理 基本结构
优点 应用 使用注意事项
由流程图可以看出系统由储液器、泵、进
样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分
原理 基本结构
优点 应用 使用注意事项
混合物中各组分在 固定相和流动相之 间会发生吸附、溶 色素 解或其他亲和作用， 这种作用存在差异，
玻璃柱
从而使各组分在色 谱柱中的迁移速度 不同得到分离
石油醚 碳酸钙颗粒
原理 基本结构
优点 应用 使用注意事项
高效液相色谱仪的基本结构
贮液器 脱气器 高压泵 进样器 色谱柱 检测器