WB的转膜和染色(优质参考)

Western实验步骤Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。

Western 可以参考如下步骤进行操作。

1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)、RIPA裂解液等，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。

对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(P0028)。

收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。

根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。

因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。

如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液或RIPA裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)。

2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(P0012A)。

该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。

(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。

5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)(P0015)。

免疫印迹（WB）实验操作具体步骤及详细说明免疫印迹（WB）实验操作具体步骤及详细说明一、试剂和溶液转印缓冲液：0.025M Tris base , 0.187 M 甘氨酸, 25%甲醇氨基黑溶液：0.1% 酸性黑10B 1×TBST：25mM Tris-HCl ( pH 8.0 ) , 0.2 M NaCl , 0.1%Tween 20 封闭液：TBST 配制的5%牛奶抗体稀释液：TBST 配制的5%牛奶显色系统：ECL 显色二、实验步骤1.电泳：将裂解液进行SDS-PAGE 电泳，80v，30 分钟，120v，90 分钟；2.转膜：PVDF 膜在甲醇中浸泡约30 秒左右，滤纸浸泡在转印缓冲液预湿，半干法转印到PVDF 膜上，10v，150 分钟；3.染色：氨基黑染色5 分钟，甲醇褪去背景色，观察条带；4.膜活化：将PVDF 膜置于甲醇活化1min，用纯水洗膜2 次后再用TBST 洗涤3 次；5.封闭：将膜条置于5%牛奶或2% BSA 中，室温混摇2h；6.一抗孵育：将待检抗体用3%牛奶或2% BSA 稀释到合适浓度（参照抗体说明书，根据客户预实验结果，稀释度上下浮动一个数量级都为正常），将膜放入对应的已稀释待检样品中，置4℃混摇孵育过夜；7.洗涤：取出膜放在TBST 中洗涤3×5min；8.二抗孵育：将膜取出放入稀释好的HRP 标记的二抗（参照二抗说明书进行稀释）中，室温混摇2h；9.洗涤：取出膜放在TBST 中洗涤3×5min；10.ECL 显色：将膜取出放入混匀的ECL 显色液中，孵育3min，将膜取出贴在有荧光角标的胶片上，迅速用保鲜膜包好；11.曝光：把底片放在暗盒中，根据荧光强度分别对X 光胶片作不同时间段的曝光，曝光结束后，将底片取出，1min 显影，30s 清洗，1min 定影，30s 清洗，晾干；12.结果分析：用扫描仪将曝光后的X 光胶片扫描，做后续结果分析。

WB实验的基本原理及操作流程WB实验（Western Blotting）是一种用于检测和分离蛋白质的实验方法，广泛应用于生物医学和生物化学领域。

它通过将复杂的蛋白质混合物按照分子大小分离，并使用特异性抗体来探测目标蛋白质。

本文将介绍WB实验的基本原理及操作流程。

一、基本原理WB实验主要基于蛋白质的电泳分离和免疫染色原理。

具体步骤如下：1.样品制备：首先，需要从细胞或组织中提取蛋白质，并经过适当的处理，如裂解细胞、破碎细胞膜等，以获取纯净的蛋白质样品。

2. SDS-电泳：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamide Gel），随后进行电泳。

这一步骤会根据蛋白质的分子大小进行分离。

3.转膜：将分离的蛋白质从凝胶转移到聚乙烯2.2-羟基苯基酮（PVDF）或硝酸纤维素膜上，这样可以更容易进行免疫染色。

4.封闭：将转膜后的膜进行封闭，通常使用牛血清白蛋白（BSA）或脱脂奶粉等阻断非特异性结合位点。

5.抗体反应：加入目标蛋白质特异性的抗体，使其与特定抗原位点结合。

6.洗涤：将膜洗涤以去除非特异性的抗体。

7.免疫染色：加入酶标记的辅助抗体，它与目标抗体结合，并携带可检测信号物质（如酶或荧光染料）。

8.显色：加入合适的底物，使酶标记的辅助抗体产生可视化的颜色或荧光信号。

9.分析：通过成像设备（如X射线胶片或荧光成像系统）观察和记录目标蛋白质的表达。

二、操作流程下面是一份WB实验的基本操作流程，具体步骤可能因实验目的和实验条件而有所变化。

1.样品制备：a.收集细胞或组织样品，并使用适当的缓冲液裂解细胞膜。

b.添加蛋白质提取试剂，并彻底裂解细胞。

c.离心裂解后的细胞，收集上清液，其中含有目标蛋白质。

2.SDS-电泳：a.准备好聚丙烯酰胺凝胶，通常使用8%至12%的分辨胶。

b.加载待测样品和分子量标记蛋白质到凝胶中。

c.进行电泳，常用条件为100V持续电解，直到样品顶到凝胶底部。

3.转膜：a.准备合适大小的PVDF或硝酸纤维素膜，并剪成和凝胶一样大小。

献给初学者：westernblot操作步骤详解（下）上回说到如何进行蛋白质的样品制备、蛋白质定量及 SDS－PAGE 电泳，如果你还没看过，点此详见：《献给初学者：western blot 操作步骤详解（上）》。

下面就跟大家讲讲接下来的步骤。

四、转膜我们实验室使用的是半干转膜电泳槽。

对于转印90 kd 以下的蛋白，转膜液都不用加SDS,如果是蛋白分子量大的话可以加入0.037% 的 SDS。

1.在电泳结束前20 min 开始准备转膜所需的东西。

转一张膜需准备 6 张的滤纸（长一般为 8.1~8.3 cm，宽度根据裁的胶大小实际测量，但胶一般会缩水，所以裁 8 cm 就行）和 1 张 PVDF 膜。

切滤纸和膜时一定要戴干净手套，因为手上的蛋白会污染膜。

PVDF 膜使用前用无水甲醇中浸泡 1 min~2 min。

目的是为了活化 PVDF 膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。

2.将玻璃板撬开才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。

撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板（撬时一定要小心，玻板很脆弱，我用的是冰箱里附带的塑料除霜铲，效果出奇的好）。

除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去，要避免把分离胶刮破。

也可取10 ml 注射器吸满转印缓冲液，往玻璃板与凝胶之间注水，使液体的压力将两者自然分开。

取出凝胶后应注意分清上下，可以在右上角裁一个小角。

之后有两种方法供选择，一是按照marker 指示，把含有自己感兴趣的蛋白的胶裁下来，二是把整张胶转膜，前一种方法更加节约材料，但操作稍微麻烦了一点。

在加有转移液的培养皿里放入裁好的胶、浸过甲醇的PVDF 膜和滤纸，平衡10 min 左右，也是为了除去滤纸和转移膜中的气泡以及胶上多余的 SDS。

3.带上手套，平放转移槽的底座，依次在石墨电极上叠放3 张浸泡过缓冲液的滤纸、PVDF 膜（此时可在PVDF 右上角减去一个角，以辨明转膜后的蛋白面与非蛋白面）、刚刚完成电泳的凝胶和另外3 张浸泡过缓冲液的滤纸。

超详细的Western实验步骤及结果分析Western实验步骤1. 电泳(Electrophoresis)（1）SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶进行配制，配方试剂去离子水，Arc-HCL(29:1)，10%APS，SDS,TEMED。

一般按分子大小配胶，现实验分离胶配12%-15%的胶，浓缩胶10%的胶。

配胶步骤：1.清洗玻璃板，装好（注意不要漏即玻璃板要对齐）。

2.按比例配分离胶（8ml-10ml）3.加水压胶，待分离胶凝固后（可见有分离胶与水有分隔线，一般凝固时间30分钟-1小时左右），吸走上层水面4.按比例配浓缩胶（3ml-4ml），加入分离胶上层，插入梳子，（注意别有气泡），待凝。

（如果今日不上样可以放入4°C冰箱）注意：玻璃板要洗得干净；玻璃板要装好，不要漏；制胶过程中，一定要充分混匀，而且避免有气泡；（2）样品处理1.准备无菌EP管，向EP管内加入样品蛋白质体积的1/4体积的SDS缓冲液（5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，现样品加3.5ul），之后加入相应蛋白样品（要制冰，蛋白质样品要放置在冰上），充分吹打混匀2.100℃水浴加热5分钟，以充分变性蛋白。

3.12000r离心5分钟。

（3）上样与电泳1.将玻璃板装入电泳槽中，加电泳缓冲液至泳槽的的2/3左右2.蛋白质样品冷却到室温后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可，样品两边加蛋白质Maker(6ul)（注意上样蛋白质顺序，一定不要弄错）。

3.通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为100分钟（一般为90-120分钟）。

设置定时可以避免经常发生的电泳过头。

通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。

（为了避免电泳过头，最好是在电泳设定时间的提前30分钟观察电泳）注意：上样时尽量避免样本被上漏出孔外；注意电泳时间的把握；最重要的是一定要记录上样顺序，必要时记录在本子上。

Western blot 步骤：配胶制胶跑胶转移胶（转膜）封闭和孵抗体扫膜一.配胶这些小孔的孔径随“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔径达到最小值。

SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小相差只有3% 的蛋白质。

1.分离胶（按照自己目的蛋白的大小说明选择合适的浓度）2.浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100, 分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000）PAGE配胶的试剂和配方比例对电泳结果的质量当然有决定性的影响，这个配胶的比例，在《分子克隆》上有详细的论述，相信大家都不难查到。

容易忽视的问题主要在于过硫酸铵（AP）一定要新鲜——最好用小指管配AP（写日期）保存在-20度，超过2周的AP扔掉算了，或者已经反复打开使用多次的AP都别用，二制胶1.灌入2/3的分离胶后应立即封胶，即压线。

30分钟胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。

封胶后切记，勿动。

如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴10%的AP最好现配现用，如在4℃存放勿超过两周。

30%的丙烯酰胺如有沉淀，最好弃掉过硫酸铵（APS）(10%;w/v)取3g过硫酸铵，溶于去离子水，至终体积为30mL。

此溶液4℃下在短暂的数日内是稳定的，但建议，对每一组新胶均应新鲜配制但摇动溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气2.灌积层胶5%（统一）40min说明：可延长，宁长勿短。

Western blot实验检测蛋白表达，抗体很重要，用到的有一抗、二抗、内参抗体WB步骤1 蛋白样本处理：(1)一部分采用完全变性的方法（加入β-巯基乙醇）：加入适量5×SDS-PAGE loading buffer，100ºC沸水加热处理5min，使蛋白充分变性，12000 rpm离心5 min，取上清备用。

(2) 一部分采用非完全变性的方法（未加入β-巯基乙醇）：加入适量5×SDS-PAGE loading buffer，100ºC沸水加热处理5min，使蛋白充分变性，12000 rpm离心5 min，取上清备用。

2 分离胶浓缩胶配方如下：分离胶的浓度要根据蛋白的大小来决定，如下表所示：SDS-PAGE分离胶浓度（%）最佳分离范围（kD）6 50-1508 30-9010 20-8012 12-6015 10-40不同浓度的分离胶与5%浓缩胶，配方如下：分离胶5%浓缩胶试剂8% 10% 12% 15% 试剂体积去离子水（mL) 5.52 4.8 3.96 2.76 去离子水（mL) 4.0 30%丙烯酰胺（mL) 3.24 3.96 4.8 6.0 30%丙烯酰胺（mL) 1.01.5mol/lTris.cl(PH8.8)（mL) 3.0 3.0 3.0 3.01.0mol/lTris.cl(PH6.8)（mL)1.010%SDS（mL) 0.12 0.12 0.12 0.12 10%SDS（μL)80.0 10%AP（mL) 0.12 0.12 0.12 0.12 10%AP（μL)60.0 TEMED（μL)7.2 4.8 4.8 4.8 TEMED（μL)8.0 总体积（mL) 12.0 12.0 12.0 12.0 总体积（mL) 6.03 制胶：加入分离胶溶液至2/3处，加水饱和正丁醇封胶，室温放置40 min后加浓缩胶至顶，插入梳子，静置10 min。

2.将A液和B液按比例混合(1/5~1/10)在EP管中，混匀。
3.打开压片板，撕下保鲜膜铺在压片板上（一边留外面），用小镊子夹起膜Marker表达的一边，在纸上将多余的TBST溶液吸干，按照顺序，写字的一面朝上。
4.用枪头在膜上铺上发光剂，完全覆盖膜，显色1~5min，关上灯，查看膜是否显色，若显色后，用实验纸从膜边缘发光剂（抬起压片板）。
器械：装有超纯水的200ml烧杯装有冰水混合物的200ml烧杯超纯水喷壶实验纸
操作：先将匀桨器的旋转头用超纯水清洗，再用旋转头放入EP管中，将组织推到液体中，打开开关，边搅拌边打碎组织，然后将旋转头用超纯水喷壶冲洗，再放进超纯水中打开开关冲洗旋转头内部，再次用喷壶冲洗，甩干水迹，实验纸擦干旋转头确保冲洗干净，再进行下一个组织。
孵育二抗
1.复温30min。
2.清洗一抗：1XTBST溶液，清洗一次就可。
3.二抗：1:10000，5%脱脂奶粉-TBST稀释，培养皿中摇床40min。
4.清洗二抗：1XTBST溶液清洗5minX5。
制胶片
1.准备：保鲜膜、两个1.5mlEP管，实验纸、大小镊子、手电、枪、枪头、显影剂、定影剂、ECL发光剂
200ul
300ul
80ul
160ul
240ul
TEMED
25ul
40ul
50ul
25ul
35ul
40ul
20ul
35ul
45ul
15ul
30ul
40u60ml
20ml
40ml
60ml
20ml
40ml
60ml
20ml
40ml
60ml
A液、B液、C液是配胶，10%APS、TEMED催化凝胶

蛋白免疫印迹（western blot）实验实验步骤：一、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。

2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。

3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。

4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。

5. 膜染色液：考马斯亮兰 0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。

包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。

6. 显色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸镍胺 0.1 ml；H202 1.0 μl。

【晶莱生物】二、蛋白样品制备1.单层贴壁细胞总蛋白的提取（1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。

（2）每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。

平放轻轻摇动1 min洗涤细胞，然后弃去洗液。

重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。

将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。

（3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。

（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。

）（4）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。

（5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。

（整个操作尽量在冰上进行。

蛋白电泳（制胶、SDS-PAGE电泳）实验材料：SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、电泳缓冲液、提取的蛋白或全细胞裂解液、广谱彩虹预染中分子量蛋白Marker、SDS-PAGE Loading Buffer（还原，5×）、G250蛋白快速染色试剂、若干蒸馏水实验仪器、耗材：蛋白电泳仪、制胶仪、水平摇床、15ml离心管、5ml移液器、微量移液器、离心管、塑料饭盒（可在微波炉里加热使用）配制溶液：配制10%APS溶液：-20度保存APS + 5ml蒸馏水、2.5g APS + 25ml蒸馏水配制200 ml电泳缓冲液：CW0045 Tris-Glycine SDS（,10×）20 ml Tris-Glycine SDS + 180 ml 蒸馏水配制1 ml loading buffer：]200 ul 5×loading buffer +800 ul蒸馏水实验步骤：一．制胶：1.参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。

2.根据分离蛋白的大小配制分离胶和浓缩胶。

SDS-PAGE分离胶浓度最佳分离范围6%胶50-150kD8%胶.30-90kD10%胶20-80kD12%胶12-60kD15%胶10-40kD3.配制10%分离胶：将不同体积的30%Acr-Bis(29:1)、分离胶缓冲液和双蒸水在小烧杯或试管中混合。

加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。

|配制SDS-PAGE分离胶4.待胶灌至距离玻璃板顶端1.5cm的时候停止灌胶，加入蒸馏水水封。

静置40分钟至1小时。

5.待分离胶凝固后（水层胶层中间出现折线），倒掉蒸馏水，用滤纸将水溶液吸干。

6.配制5%浓缩胶：…配制5%SDS-PAGE浓缩胶7.^8.将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。

注意：灌胶速度要快，防止凝胶。

9.将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。

静置20分钟，等待浓缩胶聚合。

Western Blot相关实验方法与试剂（湿转法）人工肝实验室学习姚瑶（一）目的蛋白提取：（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：1、倒掉细胞培养液，加入Hanks液洗涤一次后倒掉，根据所用细胞决定是否用胰酶消化，加入适量（约5ml ）新鲜细胞培养液后，将贴壁细胞吹起，并转移至4支离心管内，配平后，1500转离心10min。

2、倒掉上清，用4度预冷PBS溶液洗涤沉淀，1500转离心10min。

共洗三次，每次十分钟。

3、倒掉上清，吸净，每管加入50ul细胞裂解液RIPA，吹散，加入后由于DNA的释放可迅速变粘稠，故应尽快转移至1.5ml EP 管内，-20C裂解30min。

5、4C, 12000 转离心10min。

6、将上清转移至0.5ml EP管中，每管100ul,冰浴待用。

（2）组织中总蛋白的提取：1、取约100mg肝组织于研磨器内，加入500ul细胞裂解液RIPA，研磨后吸出于1.5ml EP管内，再加入500ul RIPA，研磨后吸出于上EP管内。

冰上裂解30min。

2、配平后，4C, 14000转离心10min。

3、将上清分装于0.5ml EP管内，每管100ul,冰浴待用(二)蛋白含量的测定：1、稀释标准品：10ul标准品C液+90ul PBS溶液，混匀。

2、按0、1、2、4、8 12、16、20ul将稀释后的标准品加入于96孔板内，并用PBS将各孔补足20ul。

3、将第2、3排96孔板分别加入样品1ul、0.5ul，(可采用倍比稀释法)，并用PBS将各孔补足20ul。

4、配制工作液：按A液：B液=50：1配制适量工作液，每孔加入200ul。

5、37C水浴30min。

6、酶标仪测定各孔OD值(A570, Mode1)。

7、绘制标准曲线，计算样品蛋白浓度。

(三)SDS-PAGE 电泳：(1)清洗玻璃板(2)灌胶与上样：1、配胶：根据目的蛋白的大小，决定分离胶的浓度。

以5ml 10%分离胶、3ml 5%浓缩胶为例:10% 分离胶5%浓缩胶去离子水2.1ml30%聚丙烯酰胺0.5ml1.5M Tris-HCI ( Ph8.8 )1.9ml 1.7ml 1.3ml1.0M Tris-HCI ( Ph6.8 ) 380ul10%SDS 30ul10%AP 30ulTEMED 50ul 50ul 2ul3ul2、处理蛋白：计算含20-50ug蛋白的溶液体积即为上样量,加入上样量等体积的2X上样缓冲液Buffer，再加入上述总体积1/10 的B -巯基乙醇，混匀后，放入PCF仪内，95C反应10min。

wb实验的原理和步骤WB实验的原理和步骤。

一、实验原理。

WB实验，即Western Blot实验，是一种常用于检测蛋白质的实验方法。

它通过电泳将蛋白质分离开来，然后用特定的抗体结合目标蛋白，最后通过化学发光或染色等方法来检测目标蛋白的存在与表达水平。

在WB实验中，主要包括蛋白质电泳分离、转膜、抗体结合和检测等步骤。

下面将详细介绍WB实验的步骤及操作要点。

二、实验步骤。

1. 蛋白质电泳分离。

首先，将待测样品加入SDS-PAGE凝胶槽中，进行蛋白质电泳分离。

电泳结束后，将蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。

2. 蛋白质转膜。

将电泳分离后的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上，通常采用湿法转膜或半干法转膜。

转膜后，将膜进行封闭处理，以防止非特异性结合。

3. 抗体结合。

将待测蛋白质与特异性一抗进行孵育结合，然后进行洗脱，接着与辣根过氧化物酶标记的二抗结合。

最后再次进行洗脱，以去除非特异性结合。

4. 检测。

通过化学发光或染色等方法来检测目标蛋白的存在与表达水平。

化学发光法是常用的检测方法之一，它通过特定底物的化学反应产生发光信号，用于检测目标蛋白的存在与表达水平。

三、实验操作要点。

1. 实验前的准备工作要做到充分，包括准备好所需试剂、仪器设备的检查和调试等。

2. 在操作过程中要严格遵守操作规程，保证实验的准确性和可靠性。

3. 注意实验中各步骤的时间控制，避免步骤之间的等待时间过长或过短。

4. 蛋白质转膜时要注意膜的完整性和均匀性，避免出现膜上蛋白质分布不均匀的情况。

5. 在抗体结合和检测过程中，要注意洗脱的次数和时间，严格控制非特异性结合的发生。

6. 实验结束后，要及时清洗和维护仪器设备，妥善保存实验结果和数据。

通过以上步骤和操作要点的介绍，相信大家对WB实验的原理和操作有了更清晰的认识。

在进行实验操作时，一定要认真细致，严格按照操作规程进行，确保实验结果的准确性和可靠性。

希望本文对大家有所帮助，谢谢阅读！。

NC膜：硝酸纤维素膜，比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等 过程中容易裂开，依靠疏水性相互作用结合。
转膜效果：可以根据蛋白MARK的转膜情况，来简单判断你的转膜效果，一般 选择一定的转膜条件，对不同分子量的蛋白的转膜效率是不一样的。
膜的选择
几种膜的特点：
NC膜
灵敏度和cm2
SDS：导致蛋白质变性，易于蛋白结合，形成易溶于水的复 合物。
β-mercaptoethanol：作为还原剂，打开二硫键，使蛋白质的 四级或三级结构被破坏，使蛋白成为寡氨基酸链。以与二硫 苏糖醇（DTT）或三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐（TCEP）互换使 用
溴酚蓝：作为一种指示剂，成蓝色，只是我们样品跑胶的一 种程度。
材料质地 ： 干的NC膜易脆
溶剂耐受性 ：
无
价格 ：
价格较便宜
尼龙膜 高 较高
>400 ug/cm2 软而结实 无 便宜
PVDF膜 高 低
125－200ug/cm2 机械强度高
有 较贵
使用范围0.45um：一般蛋白 0.2um：分子量小于20kD蛋白 0.1um：分子量小于7kD蛋白低浓度
丽春红染色的实例
WB的实验基本流程
主要内容
1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation) 2. 电泳(Electrophoresis) 3. 转膜(Transfer) 4. 封闭(Blocking) 5. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 7. 蛋白检测(Detection of proteins)
Biodlight ECL Chemiluminescent HRP Substrate

Western Blot一、从细胞中提取蛋白质：1、收集细胞流程：（1）弃去培养液，用1×PBS（2吸管）冲洗2遍；（2）加入蛋白提取液（6孔板50-100 ul，75ml培养瓶200-300 ul）到培养皿（置于冰上）；（3）用细胞刮，刮取细胞，冰上放置5min（冰上操作）；（4）收集细胞裂解液于1.5 ml EP管（冰上放置裂解30 min）；（5）4℃12000转离心15 min，留取上清液。

2、蛋白提取液：RIPA裂解液（WB009A）100 ul抑制剂（WB009B）1%1ulPMSF（WB009C）1%1ul二、蛋白浓度测定：1、蛋白标准品（BSA）的准备（需提前完成）：a. 取1.2ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(30mg BSA)中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液。

配制后可立即使用，也可以-20ºC长期保存。

b. 取适量25mg/ml蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/ml。

例如取20μl 25mg/ml 蛋白标准，加入980μl稀释液即可配制成0.5mg/ml蛋白标准。

蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。

但是为了简便起见，也可以用0.9% NaCl 或PBS 稀释标准品。

稀释后的0.5mg/ml蛋白标准可以-20ºC长期保存。

2、蛋白浓度测定：（1）倍比稀释法：a.取5个EP管，编号1～5，前4管各加20 μl稀释液（NaCL），第4管与第5管再各加20 μl BSA（0.5mg/ml）；b.第4号管振荡混匀，瞬时离心后，从4号管吸取20 μl混合液置入3号管，以此类推作倍比稀释，到第2管时，吸取20 μl BSA混合液弃掉。

c. 样品测定：加2 ul蛋白+18 ul NaCL；d.倍比稀释后，每管加入BCA 200 ul，振荡混匀后加入到96孔板中，37℃孵育30min；然后于562 nm下测吸光度值。

（BCA工作液的配制：根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA 试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。

WB快速转膜液的使用方法及步骤WB（Western blot）快速转膜液主要用于Western blot实验中的蛋白电泳转膜步骤，下面是其详细的使用方法及步骤：一、实验前准备：1.将WB快速转膜液从-20℃冷冻保存条件迅速转移到4℃冷藏保存条件下，使其溶解均匀，放置2小时。

2.取出所需的PVDF或NC膜，并用TBST缓冲液浸泡20分钟，去除其中的有机溶剂。

二、电泳结束后进行转膜：1.关闭电泳仪电源，在电泳槽中小心取出胶片和蛋白质凝胶。

2.使用无菌镊子或无菌手套，将蛋白质凝胶上胶及下胶用纸快速剥离，并在电泳槽中洗净。

3.高分子量蛋白质在脱胶缓冲液中洗2次，10分钟/次；低分子量蛋白质在脱胶缓冲液中洗1次，10分钟。

4.将含有蛋白质的凝胶快速转移到已浸泡在TBST缓冲液中的PVDF（或NC）膜上。

5.如有需要，先用标尺切割PVDF（或NC）膜，使其与凝胶大小相匹配。

三、转膜条件：1.将蛋白质凝胶和膜夹在两片不含泡沫的海绵之间，并同时将其与孔板或纸张夹在一起。

2.通过应用约100V的恒定电流进行转膜。

用正极连接电源端口上的红色插孔，负极连接黑色插孔。

3.根据样品大小和此前实验数据，预计转膜时间一般为1-2小时。

如果处理过的样品非常大，转膜时间可能需要延长。

四、将洗膜：1.在转膜完成后，将膜快速从转膜装置中取出，用冷缓冲液迅速冲洗转印膜以去除残余的凝胶。

2.将膜放入含有5%脱脂奶粉的TBST中的封闭沉淀液中，封闭30-60分钟。

五、主要试剂的准备：1. 酶标仪AB染色液准备：根据需要的体积，按照1：50的稀释比例将染色缓冲液（5x）稀释成1x稀释液中。

例如，对于20ml AB染色液，需要将0.4 ml染色缓冲液稀释成20 ml 1x稀释液。

2.抗体溶液准备：将所选择的一抗或二抗按照所需体积稀释成1xTBST中的合适浓度。

六、探测步骤：1.将膜与所选择的抗体孵育，通常在4℃下过夜。

2.将膜置于摇床上，与所选择的一抗或二抗孵育30分钟。

转膜(Trarsmembran)1 转膜的定义将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法.常用的电泳转移方法有湿转和半干转。

两者的原理完全相同,只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同.前者操作容易，转移效率高;而后者适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少.2 转移膜的选择杂交膜的选择是决定Western blot成败的重要环节。

应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。

用于Western blot的膜主要有两种:硝酸纤维素膜（NC) 和PVDF膜。

NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。

根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的NC膜。

因为随着膜孔径的不断减小,膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。

通常用0.45 μm和0。

2 μm两种规格的NC膜。

大于20 kD的蛋白可用0.45 μm的膜，小于20 kD的蛋白就要用0。

2 μm的膜了,如用0.45 μm的膜就会发生“Blowthrough”的现象。

PVDF膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。

但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇浸泡饱和1-5秒钟。

最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸纤维素(Nitrocellulose, NC）膜和聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene Fluoride, PVDF)膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。

尼龙膜和NC膜的特点相似，主要用于核酸杂交。

硝酸纤维素(nitrocellulose, NC）膜:NC与蛋白质靠疏水作用结合，无需预先活化,对蛋白质的活性影响小;非特异性本底显色浅；价格低廉，使用方便.但结合在NC上的小分子蛋白质在洗涤时易丢失； NC韧性较差，易损坏。

不可忽视的转膜和封闭:WesternBlot专题(经验篇)生物通技术专题：既可以定性，又可以半定量的Western是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。

Western印迹要想做的好，当然每个步骤都不能马虎，看看这张图，从电泳，转膜，封闭，一抗，二抗到最后的检测，就像“发现号”升空的120万个步骤那样一个也不能少。

如果忽视了其中的一步，结果做不出来，也是令人非常头痛的。

“工欲善其事，必先利其器”，要想有好的实验结果，好仪器是相当重要的，因此让我们先来看看什么样的仪器能让我们无后顾之忧，顺利痛快的一步到位。

Western 印迹的仪器主要就是电泳系统和电转移系统了，最好的品牌当然是Bio-Rad和Amersham（GE Healthcare）的Hoefer系列了，现在国内出品的物美价廉的电泳系列产品，也是不错的选择，几乎每个实验室都需要至少一套Mini Cell吧？如果还没有你该怎么挑选呢。

一、Bio-Rad经典Mini系列Bio-Rad Laboratories由David Schwartz 先生和妻子化学家Alice Schwartz于1957 年创建，总部位于加州Hercules，下设三大部门——生命科学部，临床诊断部和工业材料部，其中生命科学部成功跻身世界排名前五名。

在2004年，Bio-Rad还低价收购了因侵犯知识产权限于困境的MJ Research，使得伯乐在PCR领域的市场份额骤然扩大。

Bio-Rad生命科学部产品包括蛋白组研究产品、层析仪与填料、蛋白质和核酸电泳产品等，不过最为普通实验室熟悉的莫过于蛋白电泳Mini系列和层析仪。

只要是提到SDS-PAGE，Bio-Rad绝对是每个实验室首先考虑的品牌，经典就是经典呀。

Mini-PROTEAN3电泳系统与MiniTrans-Blot转移系统这一套Mini系列可谓是Bio-Rad最多人熟悉和称道的产品了。

自上个世纪50年代Raymond利用聚丙烯酰胺凝胶的分子筛性质来延缓蛋白质的迁移率从而达到分离蛋白的目的以来，经过这么多年来的发展，SDS-PAGE电泳技术已经基本成熟了。