荧光分析法实验(有思考题答案)

分子荧光法测定水杨酸和乙酰水杨酸一、实验目的1、学习荧光分析法的基本原理。

2、掌握应用分子荧光法测定乙酰水杨酸、水杨酸的分析方法。

3、了解F-3501型荧光分光光度计的主要结构及工作原理，掌握其正确的使用方法。

二、实验原理某些物质经紫外光或波长较短的可见光照射后，会发射出较入射波长更长的荧光。

荧光光谱反映了物质的特性，建立在测量荧光光谱基础上的分析方法称为荧光分析法。

当进行荧光测定时，总要选择不同波长的光波进行测定，即一个为激发光——物质所吸收的光；另一个为物质吸收后发出的光称为发射光或荧光。

对同一物质而言，在稀溶液（即A = abc < 0.05）中，荧光的强度F与该物质的浓度C 有以下关系：F = 2.3φabcI0式中φ为荧光过程的量子效率，a为荧光分子的吸光系数，b为试样的吸收光程，I0为入射光的强度。

当I0及b 不变时，上式变为：F= KC其中，K为常数。

荧光分析法具有灵敏度高（一般超过分光光度法2~3个数量级）、取样少、方法快速等特点，现已成为食品、生物医药、天然产品、农业、环境保护、化工等领域中的重要分析方法之一。

但由于许多物质本身不会发生荧光，故在使用范围上受到一定的限制。

乙酰水杨酸（ASA，即阿司匹林）水解能生成水杨酸（SA），而在乙酰水杨酸中，或多或少都存在着水杨酸。

由于两者都有苯环，也有一定的荧光效率，因而在以三氯甲烷为溶剂的条件下，可用荧光法进行测定。

从乙酰水杨酸和水杨酸的激发光谱和荧光光谱中可以发现：乙酰水杨酸和水杨酸的激发波长和发射波长均不同，利用此性质，可在各自的激发波长和发射波长下分别测定。

三、仪器与试剂1、仪器F-3501型荧光分光光度计、电子天平、离心机、真空泵、石英比色皿、移液管、棕色容量瓶、比色管、烧杯、砂芯抽滤装置、量筒、洗耳球、洗瓶等。

荧光分析法实验报告实验目的本实验旨在学习和掌握荧光分析法的原理和操作方法，以及了解荧光分析法在实际应用中的意义和限制。

实验器材和试剂•器材：荧光分析仪、量筒、移液管、烧杯等。

•试剂：待测样品溶液、荧光分析标准品溶液、荧光分析试剂盒等。

实验步骤1. 样品制备1.将待测样品溶解于适宜的溶剂中，以得到一定浓度的待测样品溶液。

2.将荧光分析标准品溶解于相同的溶剂中，以得到一系列浓度的标准品溶液。

2. 仪器准备1.打开荧光分析仪电源，等待其预热。

2.检查仪器是否正常工作，如灯泡是否亮起等。

3. 实验操作1.使用移液管分别取一定体积的标准品溶液和待测样品溶液，分别转移到烧杯中。

2.使用量筒等器材，加入适量的荧光分析试剂盒中的试剂。

3.摇匀烧杯中的混合液，并将其转移到荧光分析仪的样品槽中。

4.设置荧光分析仪的参数，如激发光源波长、检测光源波长等。

5.启动荧光分析仪，记录仪器给出的荧光强度值。

4. 数据分析1.对于标准品溶液，绘制荧光强度与浓度的标准曲线图。

2.使用标准曲线，根据待测样品的荧光强度值，计算其对应的浓度。

3.根据计算结果，分析待测样品中目标物质的含量或其他相关信息。

结果与讨论根据实验操作步骤，我们成功制备了待测样品溶液和一系列不同浓度的荧光分析标准品溶液。

在荧光分析仪的帮助下，我们获得了待测样品和标准品的荧光强度值。

通过绘制标准曲线和计算待测样品的浓度，我们可以得出目标物质在样品中的含量。

荧光分析法由于其高灵敏度和选择性，被广泛应用于环境监测、生物医学研究等领域。

然而，荧光分析法也存在一些限制，例如对样品的预处理要求较高，以及某些干扰物质可能影响荧光信号的准确性。

实验总结通过本次实验，我们深入了解了荧光分析法的原理和操作方法。

我们学会了如何制备样品溶液、使用荧光分析仪进行测量，并通过数据分析得出目标物质的含量。

荧光分析法作为一种重要的分析方法，具有广泛的应用前景。

在实际应用中，我们需要根据具体情况选择合适的荧光试剂和仪器参数，以确保结果的准确性和可靠性。

荧光分光光度法测维生素B2的含量一、实验目的1.了解荧光分析法的原理2.学习荧光公光光度计的使用方法二、实验原理维生素B2在230—490nm范围波长的照射下，激发出峰值在526nm左右的绿色荧光，在pH=6-7的溶液里荧光最强，在pH=11时荧光消失。

三、仪器与试剂荧光分光光度计、容量瓶、玻璃棒10.0ug/ml维生素B2标准液：称取10.0mg维生素B2，先溶解于少量的1%乙酸中，然后用1%乙酸定容至1000ml。

溶液应该保存在棕色瓶中，置于阴凉处。

四、实验步骤1. 标准系列溶液的配制取6个25ml比色管，分别加入0、0.5、1.0、1.5、2.0ml及2.5ml维生素B2标准溶液，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。

2．测定荧光激发光谱和发射光谱取上述第3号标准系列溶液，测定激发光谱和发射光谱。

先固定发射波长为525nm，在400—500nm区间进行激发波长扫描，获得溶液的激发光谱和荧光最大激发波长λex再固定激发波长为λex，在480—600nm区间进行发射波长扫描，获得溶液的发射光谱和荧光最大发射波长λem。

3.标准曲线的绘制（1）波长的设定：将激发波长和发射波长分别设定为上述得到的λex T和λem 值。

（2）绘制标准曲线：用1号标准系列溶液将荧光强度“调零”，然后分别测定2—6号标准系列溶液的荧光强度。

4.未知试样测定取未知试样溶液2ml置于25ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，测定此溶液的荧光强度。

五、实验数据及结果（1）从绘制的维生素B2的激发光谱和发射光谱曲线上，确定其最大激发波长和最大发射波长；（2）从绘制维生素B2的标准曲线，并从标准曲线上确定未知试样溶液中维生素B2的浓度；（3）计算出原始未知试样中维生素B2的浓度。

六、注意事项测定的顺序要从稀到浓，以减小测量误差。

七、思考题（1）什么是荧光激发光谱？如何绘制荧光激发光谱？（2）什么是荧光发射光谱？如何绘制荧光发射光谱？。

荧光分析法测定维生素B2一、实验目的1.学习与掌握荧光光度分析法测定维生素B2的基本原理与方法;2.熟悉荧光分光光度计的结构及使用方法;3、学习掌握固体及液体试样的荧光测试方法。

二、实验原理当用一种波长的光照射某种物质时,这种物质会在极短的时间内,发射出一种比照射光波长较长的光,这种发射出来的光就叫做荧光。

当照射光停止照射时,荧光也随之很快地消失。

利用某些物质被紫外光照射后所产生的、能够反映出该物质特性的荧光,以进行该物质的定性分析与定量分析,称为荧光分析。

实验证明,荧光通常发生于具有刚性平面的л-电子共轭体系分子中。

随着л-电子共轭度与分子平面度的增大,荧光也就越容易产生。

因此几乎所有对分析化学有用的荧光体系都含有一个以上的芳香基团,芳环数越多,荧光愈强。

能发荧光的纯无机物很少,通常就是利用有机配位体与金属离子形成荧光络合物进行无机离子的分析。

图1.荧光分光光度计的结构原理图荧光分光光度计工作原理(图1)可简述为:光源发出的光束经激发单色器色散,提取所需波长单色光照射于样品上,由样品发出的荧光经发射单色器色散后照射于检测器上,检测器把荧光强度信号转变为电信号并经放大器放大后,由信号显示系统显示或者记录。

荧光光谱包括激发光谱与发射光谱两种。

激发光谱就是就是指发射单色器波长固定,而激发单色器进行波长扫描所得到的荧光强度随激发光波长变化的曲线。

荧光发射光谱就是指激发单色器波长固定,发射单色器进行波长扫描所得到的荧光强度随发射光波长变化的曲线。

一般所说的荧光光谱实际上仅指荧光发射光谱。

这一光谱为分析指出了最佳的发射波长。

荧光定性定量分析与紫外可见吸收光谱法相似。

定性时,就是将实验测得样品的荧光激发光谱与荧光发射光谱与标准荧光光谱图进行比较来鉴定样品成分,一般荧光定性的依据就是荧光光谱峰的个数、位置、相对强度及轮廓。

定量分析时,一般以激发光谱最大峰值波长为激发光波长,以荧光发射光谱最大峰值波长为发射波长,测量样品的荧光强度。

实验四荧光分光光度法测定维生素B2一、实验目的1．了解F 96 荧光分光光度计的性能及操作。

2．掌握荧光分析法的基本原理。

3．学习荧光分析法测定维生素B2 的含量。

二、实验原理维生素B2 是一种具有强烈荧光特性的化合物。

其水溶液在pH = 6～7 时荧光最强，其最大激发波长为λex= 465 nm ，最大发射波长为λem = 520 nm。

在低浓度时，λex = 465 nm 时在520 nm 处测得的荧光强度与维生素B2 成正比。

即：I F＝Kc采用校正曲线法可测定复合维生素片剂中维生素B2 含量。

当pH 在11以上时，荧光猝灭。

图 4 维生素B2 的激发光谱（a）和荧光光谱（b）三、仪器与试剂1．仪器：F96 型荧光分光光度计；容量瓶；移液管。

2．试剂：1％HAc 溶液；维生素B2；复合维生素片剂。

四、实验步骤1．维生素B2 标准溶液的配制称取10.0 mg 维生素B2，先溶解于少量1％HAc中，然后转移至 1 000 mL容量瓶中，用1％HAc稀释至刻度，摇匀，即配制成10.0 μg/mL的维生素B2 标准溶液。

溶液保存在棕色容量瓶中，置阴凉暗处。

2．标准系列溶液的配制取5个50 mL的容量瓶，分别加入1.00、2.00、3.00、4.00 及 5.00 mL 维生素B2 标准溶液，用水稀释至刻度，摇匀，待测。

3．未知样品溶液的配制取复合维生素片剂适量，于100 mL小烧杯中，以1％HAc溶解，转移至50 mL容量瓶中，以水稀释至刻度，待测。

4．将标准系列溶液及未知样品溶液，分别置于F96 荧光分光光度计上，选择合适的激发波长和测定波长，测定其荧光强度，绘制工作曲线，查出未知样品中维生素B2 的含量。

五、数据处理1．由记录仪记录所得荧光光谱图上查出标准系列不同浓度维生素B2 相应的荧光强度，作工作曲线。

2．在荧光光谱图上查出未知样品的荧光强度，在工作曲线上查出对应浓度，进行换算后求出片剂中维生素B2 的含量。

荧光分析法思考题和习题1．如何区别荧光、磷光、瑞利光和拉曼光？如何减少散射光对荧光测定的干扰？荧光：是某些物质吸收一定的紫外光或可见光后，基态分子跃迁到激发单线态的各个不同能级，然后经过振动弛豫回到第一激发态的最低振动能级，在发射光子后，分子跃迁回基态的各个不同振动能级。

这时分子发射的光称为荧光。

荧光的波长比原来照射的紫外光的波长更长。

磷光：是有些物质的激发分子通过振动弛豫下降到第一激发态的最低振动能层后，经过体系间跨越至激发三重态的高振动能层上，再通过振动弛豫降至三重态的最低振动能层，然后发出光辐射跃迁至基态的各个振动能层．这种光辐射称为磷光。

磷光的波长比荧光更长。

瑞利光：光子和物质分子发生弹性碰撞时．不发生能量的交换，仅是光子运动的方向发生改变，这种散射光叫做瑞利光，其波长和入射光相同。

拉曼光：光子和物质分子发生非弹性碰撞时，在光子运动方向发生改变的同时，光子与物质分子发生能量交换，使光于能量发生改变。

当光子将部分能量转给物质分子时，光子能量减少，波长比入射光更长；当光子从物质分子得到能量时，光子能量增加，波氏比入射光为短。

这两种光均称为拉曼光。

为了消除瑞利光散射的影响，荧光的测量通常在与激发光成直角的方向上进行，并通过调节荧光计的狭缝宽度来消除为消除拉曼光的影响可选择适当的溶剂和选用合适的激发光波长2．何谓荧光效率？具有哪些分子结构的物质有较高的荧光效率？荧光效率又称荧光量子效率，是物质发射荧光的量子数和所吸收的激发光量子数的比值称，用Ψf表示。

以下分子结构的物质有较高的荧光效率：(1)长共轭结构：如含有芳香环或杂环的物质。

(2)分子的刚性和共平面性：分子的刚性和共平面性越大，荧光效率就越大，并且荧光波长产生长移。

(3)取代基：能增加分子的π电子共轭程度的取代基，常使荧光效率提高，荧光长移，如-NH2、-OH、-OCH3、-CN等。

3．哪些因素会影响荧光波长和强度？(1)温度：物质的荧光随温度降低而增强。

氨基酸类物质的荧光光谱分析【摘要】荧光物质吸收特定频率辐射能量后会产生荧光,不同荧光物质的最大吸收波长、最大激发波长以及荧光谱图不同,以此可以鉴定未知物质。

荧光还与物质浓度在一定范围内有线性关系,可以通过测定未知浓度的已知物荧光吸收强度来测定浓度。

【实验目的】１、熟悉荧光分析法的基本原理;2、了解RＦ–53０1 型荧光分光光度计的构造、原理,掌握荧光分析法的基本操作;３、掌握荧光分析技术应用于定量分析的原理及方法。

【基本原理】原理概述:利用荧光物质分子在吸收特定频率辐射能量后,由基态跃迁至激发态的任一振动能级,在溶液中以热的形式损失部分能量后回到第一电子激发态的最低振动能级，再以辐射形式去活化跃迁到电子基态的任一振动能级，便产生荧光。

荧光的产生:荧光物质分子在吸收特定频率辐射能量后,由基态跃迁至第一电子激发态(或更高激发态）的任一振动能级,在溶液中这种激发态分子与溶剂分子发生碰撞,以热的形式损失部分能量后,而回到第一电子激发态的最低振动能级(无辐射跃迁)。

然后再以辐射形式去活化跃迁到电子基态的任一振动能级,便产生荧光。

能产生强荧光的物质分子，一般都具有大的共轭π 键结构或具有刚性平面结构等特征。

发射光谱与吸收光谱:荧光分析法的特点：优点:灵敏度高、选择性好、工作曲线线性范围宽,能提供激发光谱、发射光谱、发光强度、发光寿命、量 子产率、荧光偏振等诸多信息；缺点:由于能够产生强荧光的物质相对较少，荧光分析法的应用不太广泛;改进：对于没有强荧光或没有荧光的物质的测定可设计相应的反应使其生成具有荧光特性的配合物进行测定。

氨基酸：含有氨基和羧基的一类有机化合物,是生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质。

色氨酸（Tｒy)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)是天然氨基酸中仅有能发射荧光的组分,可以用荧光法测定。

【仪器与试剂】1、仪器：F－4600 型荧光分光光度计，10 ｍL 带玻璃塞的比色管1０只，移液管图1荧光光谱仪结构示意图2、试剂：标准溶液a:４×10-4ｍｇ/mＬ的酪氨酸溶液;标准溶液b:1×１0－3mg/mＬ的苯丙氨酸溶液；标准溶液c：１×１０-3mg/mＬ的色氨酸溶液;色氨酸待测样;去离子水。

实验八、荧光光度法测定维生素B2的含量内容：P94-97和P208-210一、实验目的1、学习荧光分光光度计的工作原理2、熟悉荧光分光光度计的结构及使用方法3、掌握荧光光度分析法测定维生素B2的方法二、实验原理在紫外光或波长较短的可见光照射后，一些物质会发射出比入射光波长更长的荧光。

以测量荧光的强度和波长为基础的分析方法叫做荧光光度分析法。

对同一物质，若alc << 0.05，即对很稀的溶液，荧光强度F与该物质的浓度c有以下的关系：F = 2.3 Φf I0alc，I0和l不变时，F = K⋅c (K为常数)。

因此，在低浓度的情况下，荧光物质的荧光强度与浓度呈线性关系。

维生素B2在430～440 nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，其峰值波长为535 nm。

维生素B2的荧光在pH值为6～7时最强，在pH值为11时消失。

荧光分析实验首先选择滤光片，使测量获得最强荧光，且受背景影响最小。

激发光谱受选择激发滤光片的依据，该滤光片的最大透射比与待测物质激发光谱的最大峰值波长相近。

荧光光谱是选择荧光滤光片的主要依据。

本实验使用的Cary Eclipse荧光分光光度计，其预扫描功能可自动识别出该容积的拉曼、瑞利及二级散射峰，并在扫描结束后自动给出最佳的激发/发射波长。

本实验采用标准曲线法来测定维生素B2的含量。

三、实验仪器与试剂（略）四、实验内容1、扫描测定取待测液2.50 mL置于50 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，用Cary Eclipse 荧光分光光度计进行扫描测定，选择最佳的激发/发射波长。

2、浓度测定在5个50 mL容量瓶中，分别加入1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL和5.00 mL 维生素B2的标准溶液，稀释，定容。

选定扫描测定确定的最佳激发/发射波长，用Cary Eclipse荧光分光光度计依次从稀到浓测量系列标准溶液和待测液稀释液的荧光强度。

五、结果与分析1、标准系列溶液的荧光强度绘制标准曲线。

第一章荧光分光光度分析法1.1概述1.1.1 基本原理由高压汞灯或氙灯发出的紫外光和蓝紫光经滤光片照射到样品池中，激发样品中的荧光物质发出荧光，荧光经过滤过和反射后，被光电倍增管所接受，然后以图或数字的形式显示出来。

物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子吸收激发光后变为激发态,这些处于激发态的分子是不稳定的，在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光。

不同物质由于分子结构的不同，其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱，因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。

在溶液中，当荧光物质的浓度较低时，其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系，即IF=KC，利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析，与紫外-可见分光光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。

1.1.2 基本结构图1 荧光分光光度计工作原理示意图（1）光源：为高压汞蒸气灯或氙弧灯，后者能发射出强度较大的连续光谱，且在300nm～400nm 范围内强度几乎相等，故较常用。

（2）激发单色器：置于光源和样品室之间的为激发单色器或第一单色器，筛选出特定的激发光谱。

（3）发射单色器：置于样品室和检测器之间的为发射单色器或第二单色器，常采用光栅为单色器。

筛选出特定的发射光谱。

（4）样品室：通常由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。

测量液体时，光源与检测器成直角安排；测量固体时，光源与检测器成锐角安排。

（5）检测器：一般用光电管或光电倍增管作检测器。

可将光信号放大并转为电信号。

1.1.3 仪器操作规程1.1.3.1 开机a. 确认所测试样液体或固体，选择相应的附件。

b. 先开启仪器主机电源，预热半小时后启动电脑程序RF-5301PC，仪器自检通过后，即可正常使用。

1.1.3.2 测样（1）spectrum模式a. 在“Acquire Mode”中选择“Spectrum”模式。

第十二章荧光分析法(药学)A型题1.若需测定生物试样中的微量氨基酸应选用下述哪种分析方法()。

A、荧光光度法B、磷光光度法C、化学发光法D、X荧光光谱法E、原子荧光光谱法答案:A2.分子荧光分析比紫外-可见分光光度法选择性高的原因是()。

A、分子荧光光谱为线状光谱,而分子吸收光谱为带状光谱B、能发射荧光的物质比较少C、荧光波长比相应的吸收波长稍长D、荧光光度计有两个单色器,可以更好地消除组分间的相互干扰E、分子荧光分析线性范围更宽答案:B3荧光量子效率是指()。

A、荧光强度与吸收光强度之比B、发射荧光的量子数与吸收激发光的量子数之比C、发射荧光的分子数与物质的总分子数之比D、激发态的分子数与基态的分子数之比E、物质的总分子数与吸收激发光的分子数之比答案:B4.激发光波长和强度固定后,荧光强度与荧光波长的关系曲线称为()。

A、吸收光谱B、激发光谱C、荧光光谱D、工作曲线E、标准工作曲线答案:C5.荧光波长固定后,荧光强度与激发光波长的关系曲线称为()。

A、吸收光谱B、激发光谱C、荧光光谱D、工作曲线E、标准工作曲线答案:B6.一种物质能否发出荧光主要取决于()。

A、分子结构B、激发光的波长C、温度D、溶剂的极性E、激发光的强度答案:A7.下列结构中荧光效率最高的物质是()。

A、苯酚B、苯C、硝基苯D、苯甲酸E、碘苯答案:A8.下列因素会导致荧光效率下降的有()。

A、激发光强度下降B、溶剂极性变小C、温度下降D、溶剂中含有卤素离子E、激发光强度增大答案:D9.为使荧光强度和荧光物质溶液的浓度成正比,必须使()。

A、激发光足够强B、吸光系数足够大C、试液浓度足够稀D、仪器灵敏度足够高E、仪器选择性足够好答案:C10.在测定物质的荧光强度时,荧光标准溶液的作用是()。

A、用做调整仪器的零点B、用做参比溶液C、用做定量标准D、用做荧光测定的标度E、以上都不是答案:D11.荧光分光光度计与分光光度计的主要区别在于()。

荧光分析法测定邻羟基苯甲酸和间羟基苯甲酸一、实验目的1.学习荧光分析法的基本原理和操作。

2.掌握邻间羟甲基苯甲酸的荧光性质。

二、实验原理使用荧光光度计测定邻—羟基苯甲酸(亦称水杨酸)和二组分混合物的荧光强度,邻—羟基苯甲酸(亦称水杨酸)和间—羟基苯甲酸分子组成相同,均含一个能发射荧光的苯环,但因其取代基的位置不同而具不同的荧光性质。

在pH= 12的碱性溶液中,二者在310nm附近紫外光的激发下均会发射荧光;在pH= 5. 5的近中性溶液中,间—羟基苯甲酸不发荧光,邻—羟基苯甲酸因分子内形成氢键增加分子刚性而有较强荧光,且其荧光强度与pH= 12时相同。

利用此性质,可在pH= 5. 5时测定二者混合物中邻羟基苯甲酸含量,间—羟基苯甲酸不干扰。

另取同样量混合物溶液,测定pH= 12时的荧光强度,减去pH= 5. 5时测得的邻—羟基苯甲酸的荧光强度,即可求出间—羟基苯甲酸的含量。

三、仪器与试剂仪器：日立M850型荧光分光光度计；10 ml 比色管；分度吸量管。

试剂：邻羟基苯甲酸标准溶液：60 u g/ml（水溶液）；间羟基苯甲酸标准溶液：60u g/ml（水溶液）；Hac-NaAc缓冲溶液：47gNaAc和6g冰醋酸溶于水并稀释至1L，得pH5.5的缓冲液；NaOH溶液：0.1 mol/L。

四、实验内容与步骤配置标准系列和未知溶液1、分别移取0.40,0.80,1.20,1.60,和2.00 mL邻羟基苯甲酸溶液于已编号的10mL比色管中，各加入1.0mLpH 5.5 HAc-NaAc缓冲液，用去离子水稀释至刻度，摇匀备用。

2、分别移取0.40,0.80,1.20,1.60,和2.00 mL间羟基苯甲酸溶液于已编号的10 mL比色管中，各加入1.20 mL 0.1 mol/L NaOH溶液，用去离子水稀释至刻度，摇匀备用。

3、取未知溶液各2.0 mL于10 mL比色管中，其中一份加入1.0 mL pH 5.5的HAc-NaAc缓冲溶液，另一份加入1.2 mL 0.1 mol/L NaOH溶液，均用去离子水稀释到刻度备用。

荧光分析法实验报告荧光分光光度法一、 实验目的1、学习荧光分光光度法的基本原理；2、学习荧光光谱仪的结构和操作方法；3、学习激发光谱、发射光谱曲线的绘制方法。

二、 实验原理荧光分光光度法（fluorescence spectroscopy, FS ）通常又叫荧光分析法，具有灵敏度高、选择性强、所需样品量少等特点，已成为一种重要的痕量分析技术。

荧光（fluorescence ）是分子吸收了较短波长的光（通常是紫外光和可见光），在很短的时间内发射出比照射光波长较长的光。

由此可见，荧光是一种光致发光。

任何荧光物质都有两个特征光谱，即激发光谱（excitation spectrum ）和发射光谱（emission spectrum ）或称荧光光谱（fluorescence spectrum ）。

激发光谱表示不同激发波长的辐射引起物质发射某一波长荧光的相对效率。

绘制激发光谱时，将发射单色器固定在某一波长，通过激发单色器扫描，以不同波长的入射光激发荧光物质，记录荧光强度对激发波长的关系曲线，即为激发光谱，其形状与吸收光谱极为相似。

荧光光谱表示在所发射的荧光中各种波长的相对强度。

绘制荧光光谱时，使激发光的波长和强度保持不变，通过发射单色器扫描以检测各种波长下相应的荧光强度，记录荧光强度对发射波长的关系曲线，即为荧光光谱。

激发光谱和荧光光谱可用于鉴别荧光物质，而且是选择测定波长的依据。

荧光强度（F ）是表征荧光发射的相对强弱的物理量。

对于某一荧光物质的稀溶液，在一定波长和一定强度的入射光照射下，当液层的厚度不变时，所发生的荧光强度和该溶液的浓度成正比，即该式即荧光分光光度法定量分析的依据。

使用时要注意该关系式只适用于稀溶液。

三、 仪器与试剂F-4500荧光光谱仪；比色管（10mL ）；牛血清白蛋白（BSA ）四、 实验内容1、 开机准备：接通电源，启动电脑。

打开光谱仪主机电源，预热15分钟。

2、 运行FL solution 软件，设定检测方法和测量参数：EX （激发波长）：280nmEM （发射波长）：340nmEX 扫描范围：210nm ～330nmEM 扫描范围：290nm ～450nmEX 缝宽：2.5nm ，EM 缝宽：2.5nm扫描速度：240nm/minPMT 电压：700V3、 激发光谱和发射光谱的绘制：先固定激发波长为280nm ，在290～450nm 测定荧光强度，获得溶液的发射光谱，在343nm 附近为最大发射波长λem ；再固定发射波长为λem ，测定激发波长为200nm ～λem 时的荧光强度，获得溶液的激发光谱，在280nm 附近为最大激发波长λex 。

荧光光度分析法测定维生素B2一、实验目的1．学习和掌握荧光光度分析法的基本原理和方法。

2．熟悉荧光分光光度计(或荧光光度计)的结构和使用方法。

二、实验原理在紫外光或波长较短的可见光照射后，一些物质会发射出比入射光波长更长的荧光。

以测量荧光强度和波长为基础的分析方法叫做荧光分光光度分析法。

对同一物质而言，若alc<<0.05，即对很稀的溶液，荧光强度F与该物质的浓度c有以下的关系F = 2.3φf I0 alc式中：φf —荧光过程的量子效率；I 0—入射光强度；a—荧光分子的吸收系数；l—试液的吸收光程。

I 0和l不变时F = Kc式中K为常数。

因此,在低浓度的情况下，荧光物质的荧光强度与浓度呈线性关系。

维生素B2(即核黄素)在430 ~ 440 nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，其峰值波长为535nm。

维生素B2的荧光在pH=6~7时最强，在pH=11时消失。

荧光分析实验首先选择激发光单色器波长和荧光单色器波长，基本原则是使测量获得最强荧光，且受背景影响最小。

激发光谱是选择激发光单色器波长的依据，荧光物质的激发光谱是指在荧光最强的波长处，改变激发光单色器的波长测量荧光强度，用荧光强度对激发光波长作图所得的谱图。

大多数情况下，荧光物质的激发光谱与其吸收光谱相同。

荧光光谱是选择荧光单色器波长的主要依据，荧光物质的荧光光谱是将激发光单色器波长固定在最大激发光波长处，改变荧光单色器波长测量荧光强度，用荧光强度对荧光波长作图所得的谱图。

图1为维生素B2的吸收（激发）光谱及荧光光谱示意图。

本实验采用标准曲线法来测定维生素B2的含量。

激发光单色器波长选440 nm。

荧光单色器波长选535 nm，可将440nm的激发光及水的拉曼光（360 nm）滤除，从而避免了它们的干扰。

三、主要仪器与试剂1．仪器日立F-4500型荧光光度计容量瓶（50 mL，1 L）吸量管（5 mL）棕色试剂瓶（500 mL）洗瓶（500 mL）冰箱2．药品（1）100.0 mg · L－1 维生素B2标准贮备液准确称取0.1000 g 维生素B2,将其溶解于少量的1% 乙酸中，转移至1 L容量瓶中，用1%乙酸稀释至刻度，摇匀。

荧光光谱实验—电子俘获材料光谱特性的研究在现代技术中，固体发光在光源、显示、光电子学器件和辐射探测器等方面都有广泛的应用。

在物理研究中，发光光谱是研究固体中电子状态、电子跃迁过程以及电子—晶格相互作用等物理问题的一种常用方法。

本实验主要研究固体的荧光光谱。

通过固体粉末材料—电子俘获材料荧光光谱的测定，了解固体荧光产生的机理和一些相关的概念，学习荧光光谱仪的结构和工作原理，掌握荧光光谱的测量方法，并对荧光光谱在物质特性分析和生产实际中的应用有初步的了解。

一、实验目的1.了解固体荧光产生的机理和一些相关的概念；2.学习荧光光谱仪的结构和工作原理；3.掌握荧光光谱的测量方法；4.对荧光光谱在物质特性分析和实际中的应用有初步的了解。

二、仪器用具970CRT荧光光度分光计，WGZ-10型荧光光度计，计算机，打印机，电子俘获材料试样。

三、实验原理1. 有关光谱的基本概念光谱：光的强度随波长（或频率）变化的关系称为光谱。

光谱的分类：按照产生光谱的物质类型的不同，可以分为原子光谱、分子光谱、固体光谱；按照产生光谱的方式不同，可以分为发射光谱、吸收光谱和散射光谱；按照光谱的性质和形状，又可分为线光谱、带光谱和连续光谱；而按照产生光谱的光源类型，可分为常规光谱和激光光谱。

光谱分析法：光与物质相互作用引起光的吸收、发射或散射（反射、透射为均匀物质中的散射）等，这些现象的规律是和物质的组成、含量、原子分子和电子结构及其运动状态有关的。

以测光的吸收、散射和发射等强度与波长的变化关系（光谱）为基础而了解物质特性的方法，称为光谱分析法。

发射光（发光）：发光是物体内部将以某种方式吸收的能量转化为光辐射的过程，它区别于热辐射，是一种非平衡辐射；又与反射、散射和韧致辐射等不同，其特点是辐射时间较长，即外界激发停止后，发光可以延续较长时期(10-11s以上)，而反射、散射和韧致辐射的辐射期间在10-14下。

荧光1：某些物质受到光照射时，除吸收某种波长的光之外还会发射出比原来所吸收光的波长更长的光，这种现象称为光致发光(phot luminescence ，PL)，所发的光称为荧光。

实验五 荧光分析法测定邻-羟基苯甲酸和间-羟基苯甲酸学号36010712 姓名 张中豪 实验日期 2009 年 3 月 16 日 第 一 组同组姓名 张雪、张琳琳、傅磊、洪延 1. 学习荧光分析法的基本原理和操作；教师评定 .【实验目的】2. 用荧光分析法进行多组分含量的测定。

【实验原理】1、荧光分析法原理：当被测物质受到光照后，被测物分子吸收了具有特征频率的辐射能，分子从基态上升到激发态，分子在较高能级的激发态时，它可能处于激发态中各种振动状态的一种。

然而由于分子通过与溶剂分子、同类分子或其他分子的碰撞，而失去振动能级，降低至激发态时的最低振动能级，在此过程中并不发光。

但当分子从激发态的最低振动能级，即第一电子激发态的最低振动能级跃迁至基态的各个不同的振动能级时，则以光的形式辐射出能量，所辐射出的光既是荧光。

荧光物质的荧光强度与其浓度、分子结构和化学环境（如体系的pH 、温度）有关。

而且与体系所吸收的激发光强度成正比，则：0()F I I =Φ−式中，F 为荧光强度；0I 为入射光的强度；I 为通过厚度为b 的介质后的光强度；Φ为量子效率，为发射的光子与吸收的光子之比。

又比尔定律可得：0(110)bc F I ε−=Φ−式中，ε为荧光分子的摩尔吸光系数；b 为液槽的厚度；c 为荧光物质的浓度。

对于很稀的溶液，投射到样品溶液上被吸收的激发光不到2%时，即bc ε<0.05时，则上式可近似写为：02.303F I bc ε=Φ当入射光强度一定时，实验条件一定时，则 ： F Kc =即在低浓度时，荧光强度与荧光物质的浓度呈线性关系，这就是荧光定量分析的基础。

荧光强度和溶液浓度呈线性关系只限于极稀的溶液，对于较浓的溶液，其吸光度超过0.05时荧光强度与浓度的线性关系将发生偏离。

2、激发光谱和发射光谱： （1）激发光谱：荧光是光致发光，因此必须选择合适的激发光波长，这可以从它们的激发光谱曲线来确定。