补肾通络方对去卵巢大鼠破骨细胞组织蛋白酶K表达的影响(一)
- 格式：docx
- 大小：14.40 KB
- 文档页数：2
补肾通络方对去卵巢大鼠破骨细胞组织蛋白酶K表达的影响(一)
作者：林一峰，梁祖建，何铭涛
【摘要】【目的】探讨组织蛋白酶K(cathepsinK，CK)在骨质疏松症发病中的意义，观察补肾通络方对去卵巢大鼠破骨细胞CK表达的影响。
【方法】选用30只雌性SD大鼠随机分成3组：假手术组、模型组及补肾通络方组(中药组，剂量为-1·d-1);后2组切除双侧卵巢，4周后中药组给予补肾通络方灌胃。
分别于第6、12周测定各组大鼠全身骨密度(BMD)，并采用Westernblot及逆转录—聚合酶链反应法测定体外分离培养破骨细胞中CK 的蛋白及基因表达。
【结果】体外分离培养椎骨来源的破骨细胞具有成熟破骨细胞的表型特征，去卵巢模型大鼠骨密度在时效上与CK的表达呈现负相关;补肾通络方以时效方式下调CK蛋白及CKmRNA的表达水平(均。
【结论】CK的过度表达是导致骨密度下降的重要原因，是骨质疏松症发生的潜在危险因子;以时效方式下调CK蛋白及CKmRNA的表达进而治疗骨质疏松症可能是补肾通络方的作用机制之一。
【关键词】骨质疏松症/中药疗法;补肾通络方/药理学;组织蛋白酶K;破骨细胞/病理学;疾病模型，动物;大鼠
骨质疏松症(osteoporosis，OP)是以骨量减少，骨组织微细结构退化，骨强度下降，骨折危险性增加为特征的一种全身性的骨代谢疾病。
研究表明，组织蛋白酶K(cathepsinCK)在破骨细胞中选择性、特异性地表达，参与骨吸收的重要调节1]。
CK是防治OP的一个非常重要的靶点，其选择性地在破骨细胞引起的骨吸收中起特殊的作用2]。
本研究拟探讨补肾通络方对去卵巢大鼠破骨细胞CK表达的影响，现报道如下。
1材料与方法
动物6月龄清洁级雌性SD大鼠，体质量190～240g，购于广州中医药大学实验动物中心(合格证号：0058908)。
所有大鼠自由摄食和饮水，保持室温18℃～22℃，相对湿度40%～60%，自然光照。
药物补肾通络方由杜仲10g，龟板30g，当归15g，熟地10g，鸡血藤10g等12味中药组成(药材由广州中医药大学附属骨伤科医院药房提供，经药剂科鉴定均为纯正药材)。
将中药制成粗粉，煎煮2次，合并2次药液过滤，用旋转蒸发仪将药液浓缩至含生药量。
药液常温冷却后，置4℃冰箱内保存备用。
主要试剂及仪器培养基及胎牛血清(FBS，美国Gibcol公司)，聚偏氟乙烯(PVDF)膜公司)，超敏发光液(北京利莱公司)，Trizol总RNA提取试剂(美国Invitrogen公司)，塑料薄膜封口机(温州兴业公司)，CO2培养箱(德国Heraeus公司)，倒置相差显微镜(日本Olympus公司)，超净台(苏州净化设备有限公司)，冷冻离心机(珠海黑马医学仪器有限公司)，DYY2C型电泳仪、迷你型垂直电泳槽、半干转移槽(北京六一仪器厂)，精密天平(瑞典Ohaus公司)，GeneAmp2400PCR扩增仪(美国Invitrogen公司)，双能X 线吸收测量仪(美国Lunar公司)。
模型复制3]、分组及给药所有大鼠随机分为假手术组、模型组及补肾通络方组(中药组)，每组10只。
各组大鼠按腹腔注射100mg/L水合氯醛溶液，10min后麻醉成功，将大鼠俯卧位固定，无菌操作，背侧切口，模型组和中药组在无菌条件下手术切除双侧卵巢后缝合，假手术组不摘除双侧卵巢，仅切除卵巢周围少量脂肪组织。
手术结束后，每只动物皮下注射青霉素抗感染3d，所有动物在20℃～25℃、湿度55%～70%，通风良好的SPF级动物房饲养。
造模4周后，假手术组、模型组给予自来水灌胃，中药组灌胃给予补肾通络方中药，剂量为12-1·d-1。
大鼠骨密度(BMD)测定分别于第6、12周，各组大鼠按腹腔注射100mg/L 水合氯醛溶液腹腔麻醉后，四肢展开平置于双能X线吸收测量仪平台上，通过计算机系统中小动物软件测定全身BMD。
破骨细胞的培养4]将大鼠断颈处死后，在无菌条件下分离腰椎(L1~5)，体积分数75%的酒精浸泡1min，在4℃平衡盐溶液中清除骨表面的软组织、骨膜后，用4℃冲洗液冲洗2次，在培养皿中剪碎骨组织，加冲洗液一起转移入Ⅰ号离心管，在漩涡振荡器上振荡5s，静置7s，将上层细胞悬液经细胞筛网过滤到Ⅱ号离心管中，去掉骨碎片，然后再加入培养液入Ⅰ号离心管振荡，将上层细胞悬液经细胞筛网过滤到Ⅱ号离心管中，重复上述步骤3～4次，收集细胞悬液。
将所收集的细胞悬液在离心机上离心10min，4℃、2000r/min，弃上清，沉淀中加入破骨细胞诱导液，用吸管轻轻吹打混匀。
以血细胞计数器计数，使悬液含细胞数为个/mL，分别加入预置小牛骨片(厚约60μm)的24孔板、预置盖玻片的6孔培养板内，置37℃，含体积分数5%C02的空气，饱和湿度的孵箱中培养，24h后换破骨细胞诱导液1次。
破骨细胞的鉴定5](1)形态学观察：倒置相差显微镜观察培养破骨细胞的形态，苏木素—伊红(HE)染色，光镜观察;甲苯胺兰染色，光镜观察。
(2)抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色：将破骨细胞爬片用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，再置入体积分数戊二醛固定液中，4℃、固定15min，PBS冲洗3次，放入TRAP染色液中，37℃温育1h。
取出破骨细胞爬片，双蒸水冲洗3次，晾干，中性树胶封片，光镜观察。
检测CK蛋白表达水平适时抽提破骨细胞蛋白，取蛋白样品20μL，加2倍上样缓冲液20μL，100℃煮3min，离心5min，取上清15μL上样，进行十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳，浓缩胶浓度50g/L，分离胶浓度100g/L，于200V进行电泳45min。
完整将分离胶取下，于转移缓冲液中静置30min后，转移夹靠PVDF膜，排除气泡，以31mA 转移60min。
取出PVDF膜，在盐缓冲液(TTBS)中摇5min，用封闭液(含50g/Lnonfatdrymilk)室温封闭2h，加1∶500稀释的一抗(CK、，4℃过夜，次日用
，洗PVDF膜3次，然后加1∶1000二抗(辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG)，室温反应1h。
用TBST洗3次，加10mL 的增强化学发光显色试剂(LumiGLOTM)室温下轻摇1min，排去液体，以保鲜膜包裹，用X线光片在增感屏中紧密接触，使X线光片感光1min，显影，定影，冲洗，晾干，拍照。
采用凝胶图像分析软件分析光密度值，以tin光密度比值来表示CK蛋白表达水平。
逆转录一聚合酶链反应法测定CK基因的表达收集培养稳定后的破骨细胞，总RNA提取按照Trizol试剂盒说明书进行，以此RNA为模板，进行逆转录反应合成cDNA，取上述cDNA5μL进行PCR扩增，引物由上海生工生物工程技术服务公司合成。
CK基因上游引物：，下游引物：
上游引物：
，下游引物：
，反应条件：94℃变性5min;94℃、30s，57℃、30s，
72℃、30s，共32个循环;72℃延伸5min，凝胶扫描成像系统记录电泳结果。
采用
凝胶图像分析软件分析光密度值，以CK/GAPDH光密度比值来表示CKmRNA表达水平。
统计学方法应用医用统计软件包进行数据统计学分析。
