实验3 化脓性球菌的分离鉴定

灭菌：1．热力灭菌法干热灭菌法：160-170℃，2h高压蒸汽灭菌法：103.4kPa (121℃)，15-30min 2．紫外线灭菌：265-266nm，破坏DNA构型培养基：1.液体培养基——基础培养、生化反应、糖发酵管2.固体培养基（斜面培养基）——纯培养、短期保存菌株3.半固体培养基——检测细菌动力化脓性球菌的分离鉴定：致病性肠道杆菌的分离鉴定：平板划线法接种工具：接种环培养基——化脓菌：血平板，肠道菌：SS平板注意事项：菌量适当；遵守无菌操作原则，全程避免杂菌污染；划线力度、划线角度观察细菌的形态特征1.单染色法：观察细菌形态，但不能鉴别2.复染色法（观察形态，鉴别细菌）革兰染色法、抗酸染色法3.特殊染色法——特殊结构或特殊成分的染色常见应用：荚膜、芽胞、鞭毛、异染颗粒染色革兰染色法：1.涂片标记载玻片→滴加标本→用接种环涂布均匀，形成直径约1cm菌膜2.干燥：空气中，或酒精灯火焰上方热空气中3.固定：迅速通过酒精灯外焰三次，冷却4.染色初染：滴加结晶紫，覆盖菌膜，静臵1min，流水冲洗(背面) 媒染：滴加卢戈碘液，覆盖菌膜，静臵1min，流水冲洗脱色：玻片浸入95%乙醇中，冲洗至染料不再溶下为止，水洗(背面)复染：滴加石炭酸稀释复红，覆盖菌膜，静臵30s，流水冲洗(背面)5.干燥(滤纸吸干水分)、镜检(油浸镜)甘露醇发酵实验培养基：甘露醇发酵管接种工具：接种针方法1灭菌接种针2从斜面沾取菌落3接种至培养基液面下4灭菌接种针5培养18-24h结果判定阳性：蓝→黄致病性葡萄球菌血浆凝固酶实验玻片凝集试验方法1玻片划分两格2灭菌接种环3分别取盐水或兔血浆于两4取待检菌，盐水中研磨5灭菌接种环6取待检菌，兔血浆中研磨7摇动玻片，2min内观察结果判断阳性：出现凝集致病性葡萄球菌常(+)药敏试验培养基：普通平板方法：药片扩散法按照无菌操作原则，用接种环取少量纯培养物接种于平板上，反复交叉密集划线镊子灭菌，冷却，分别取4种药片，平贴于平板上，轻轻压药片间距>24mm、药片距平板边缘>15mm静臵15min，平板倒臵培养16-18h，观察结果因子血清鉴定步骤鉴定属：A-E多价血清鉴定组：A-E单价0抗体血清鉴定种：H抗体血清注意事项血清量足够，避免干燥每格研磨后，灭菌接种环，避免交叉污染2min内观察结果在SS琼脂平板上，致病性肠道杆菌菌落特征是直径小，无色或淡红色半透明，非致病性肠道杆菌的菌落特征是直径中等大小，深红色。

实验设计:局部化脓性炎症病原菌的分离鉴定及敏感药物筛选小组成员：范子文孙琦黄必胜雍之瑶【实验病例】刘正春，男，38岁，建筑工人，上班时被石头砸断了胳膊，由于长时间不接受正规治疗，他的胳膊上的伤口感染开始化脓，发热1天，伤口肿胀疼痛体检：体温39℃，伤口局部红肿，有黄色粘稠脓汁血象：血白细胞12x109/L，中性粒细胞80%，淋巴细胞28%。

要求：1 脓汁标本病原菌的分离和鉴定；2 选择敏感抗生素治疗【实验目的】掌握病原菌的分离和鉴定，掌握化脓性细菌的主要特点选择合理的敏感抗生素进行治疗【设计思路】球菌是细菌中的一个大类，根据格兰染色的不同，可分为革兰阳性和革兰阴性两类。

阳性：葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、肠球菌等阴性：脑膜炎球菌、淋球菌等病原性球菌中常引起人类化脓性疾病的细菌，又称为化脓性球菌。

上述细菌均为化脓性球菌，它们形态、培养上各有特点，可供鉴别。

所可能用到的检查方法：染色镜检、分离培养、生化反应、血清学实验、动物接种。

所以，我们小组的实验设计即围绕取样，检查，确定，选用抗生素治疗的主线流程，结合上述检查方法，最终确定出引起患者化脓的致病菌并治疗。

【初步观察】在病例中，患者的明显体征为伤口局部红肿，有黄色粘稠脓汁，根据金黄色葡萄球菌的致病特点，在发生局部感染时，皮肤化脓感染的特点是脓汁粘稠，病灶局限，界限清楚。

其中患者黄色粘稠脓汁与此特征相符，初步怀疑为金黄色葡萄球菌，需要进一步检验。

肺炎球菌多导致呼吸道炎症，大叶性肺炎，与胳膊外伤无关，可排除。

肠球菌所致感染中常见的为心血管系统感染和尿路感染，可以排除。

脑膜炎球菌主要有呼吸道感染转变为菌血症或者败血症，可以排除。

淋球菌引起人类泌尿生殖系统急慢性化脓性感染，可以排除。

所以实验的目的为分辨引起患者伤口化脓的细菌是葡萄球菌还是链球菌，或者二者兼有。

【标本采集】在本病例中，患者为伤口感染化脓，即开放性脓肿，所以我们采取标本的方法为：用无菌棉拭采取脓液及病灶深部分分泌物。

脓汁标本中病原性球菌的鉴定实验目的：1 、掌握病原性球菌的形态和培养特性。

2 、熟悉病原性球菌的分离和鉴定程序。

实验材料：（1）标本：脓汁（2）培养基：血琼脂平板、液体培养基（3）其他：试管、载玻片、酒精灯、接种环等实验方法（1）化脓性球菌常用标本：化脓部位脓液或分泌物、痰液、咽镊子、血液、脑脊液、泌尿道分泌液。

根据病变部位，无菌采集，并置于无菌容器中。

（2）分离程序1）用无菌接种环取材料少许，拇指推开皿盖。

2）在点燃的酒精灯附近操作。

先平行划线拇指端和食指端平皿直径的三分之一，旋转平皿90度，接种环灭菌，此为第一区。

用无菌接种环从第一区带出细菌作为第二区的开始，再连续划线，大约划平皿面积的四分之一，再次灭菌接种环，再旋转90度，此区为第二区。

第三区方法同第二区。

第三区与第四区之间，接种环不灭菌直接划线划满平皿其他区域。

3）在平皿底部用玻璃铅笔注明班级、姓名、日期等信息。

置于37摄氏度温箱，皿底向上，培养18到24小时，备用。

4）待血琼脂平板第四区上出现菌落，用无菌接种环挑取平皿中菌落在点燃的酒精灯附近接种在液体培养基，用于增菌并编号。

5) 试管上用玻璃铅笔注明班级、姓名、日期等信息。

置于37摄氏度温箱，皿底向上，培养18到24小时，备用。

（3）鉴定程序1）取各液体培养基中的菌液经过涂片→干燥→固定→染色（HE）→显微镜观察。

根据染色结果分为：紫色的革兰染色阳性菌：葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌红色的革兰染色阴性菌：淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌2）对革兰染色阳性菌（葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌）进行溶血实验。

根据结果分为：完全透明溶血环：葡萄球菌、链球菌草绿色溶血环：肺炎链球菌3）对出现完全透明溶血环的细菌做过氧化氢酶实验，根据结果分为：阳性：葡萄球菌阴性：链球菌4）对革兰染色阳性菌（淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌）进行分解麦芽糖实验，根据结果分为：不分解麦芽糖：淋病奈瑟菌分解麦芽糖产酸不产气：脑膜炎奈瑟菌（4）确诊程序根据鉴定程序得出的初步诊断，再进行确诊1）葡萄球菌的确诊①血浆凝固酶试验，鉴定致病性葡萄球菌②耐热核酸酶试验，用于检测金黄色葡萄球菌产生的耐热核酸酶③甘露醇发酵试验，金黄色葡萄球菌可发酵甘露醇，该试验为阳性2）链球菌的确诊①杆菌肽试验敏感试验，出现抑菌环者即可初步鉴定为A群链球菌②胆盐溶菌试验，肺炎链球菌阳性，草绿色链球菌阴性③血清学鉴定试验，检测链球菌群的特异性抗原，出现凝集者为阳性3）肺炎链球菌的确诊①荚膜肿胀试验，呈现阳性则为肺炎链球菌②菊糖发酵实验，肺炎链球菌可以发酵菊糖③胆盐溶菌试验，肺炎链球菌阳性4）淋病奈瑟菌的确诊①革兰染色后镜检若发现中性粒细胞内有革兰阴性双球菌5）脑膜炎奈瑟菌的确诊①分解葡萄糖、麦芽糖、产生少量酸②氧化酶试验阳性③血清凝集试验阳性鉴定图解。

化脓性球菌分离鉴别的流程英文回答：Identification of Pus-Forming Cocci.The identification of pus-forming cocci, such as Staphylococcus and Streptococcus species, is essential for appropriate antibiotic therapy and infection control measures. The following steps outline a general procedure for their identification:1. Specimen Collection: Collect specimens from the infected site, such as wound swabs, blood, or sputum.2. Gram Staining: Perform Gram staining on the specimen to determine the morphology and staining characteristics of the bacteria. Pus-forming cocci are typically Gram-positive and appear as cocci (round or oval cells).3. Colonial Morphology: Culture the specimen onappropriate media, such as blood agar or chocolate agar, and observe the colony morphology. Staphylococcus species often form colonies that are round, opaque, and golden or white in color, while Streptococcus species tend to form colonies that are beta-hemolytic, meaning they cause a clear zone of hemolysis around the colonies.4. Catalase Test: Differentiate between Staphylococcus and Streptococcus species using the catalase test. Staphylococcus species produce the enzyme catalase, which breaks down hydrogen peroxide into water and oxygen, creating bubbles during the test. Streptococcus species do not produce catalase and therefore do not elicit a positive result.5. Coagulase Test: Further differentiate Staphylococcus species using the coagulase test. Staphylococcus aureus, a common pathogen, produces the enzyme coagulase, which converts fibrinogen into fibrin, causing clot formation in the test. Other coagulase-negative Staphylococcus species do not produce this enzyme.6. Hemolysis Test: Determine the hemolytic propertiesof Streptococcus species on blood agar plates. Beta-hemolytic Streptococcus species cause a clear zone of hemolysis around the colonies, while alpha-hemolyticspecies produce a greenish zone of hemolysis, and non-hemolytic species do not cause any hemolysis.7. Lancefield Grouping: Further differentiate Streptococcus species based on their Lancefield group antigens. This involves using specific antibodies to determine the group (A, B, C, D, etc.) to which the Streptococcus species belongs.8. Antibiotic Susceptibility Testing: Performantibiotic susceptibility testing to determine the appropriate antimicrobial agents for treating the infection.中文回答：化脓性球菌分离鉴别流程。