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BD FACSCalibur流式细胞仪操作与维护程序目的：规范BDFACSCalibur流式细胞仪操作与维护程序，正确使用设备，保证实验顺利进行、操作人员人身安全和设备安全。
适用范围：本规程适用于BD FACSCalibur流式细胞仪的使用操作。
责任者：操作人员：负责按照本规程操作仪器设备，对仪器进行日常维护，并作使用记录。
保管人员：负责监管仪器操作是否符合规程，并对仪器进行定期维护、保养。
科室负责人：负责对仪器设备的综合管理。
内容：1.每日开机程序1.1在气压阀减压的状态下检查鞘液桶，确认：1.1.1鞘液充满状态，约3L1.1.2盖紧盖子1.1.3安上金属挡板1.1.4管路畅通，无扭曲1.2.检查废液桶，确认：1.2.1废液桶充满400ml漂白剂1.2.2管路畅通，无扭曲1.3打开流式细胞仪。
1.4打开电脑。
1.5气压阀置于加压位置，并排除管路中气泡。
1.6做Prime。
1.7等待机器预热5~10分钟后可开始试验。
2.每日关机程序2.1用3mlFACSCIean洗液加入样品管中上样，将样品支撑架置于旁位，以外套管吸入1ml。
2.2将样品支撑架置于中位，以HI RUN运行10分钟，使内管吸入约1ml。
2.3将样品管换成蒸馏水重复1-2步。
2.4放置盛有1ml蒸馏水的试管于样品支撑架上。
2.5选择Standby模式10分钟，将激光冷却后可关掉主机。
2.6退出所有应用软件，关闭电脑。
2.7将流式细胞仪的压力阀置于减压状态。
3.每月维护程序3.1将FACSClean洗液1~2L装入鞘液桶。
3.2旁路鞘液过滤器（过滤器上的快速接口从SANLINEFILTER端断开，将鞘液白色管路液路取下联到SANLINE FILTER 端口），以防伤害。
3.3将盛有3ml FACSClean 洗液的试管置于样品支架上，以HI RUN 30 分钟。
3.4将鞘液和样品换成蒸馏水重复步骤3，以HI RUN 60 分钟。
3.5将鞘液桶装满鞘液，恢复过滤器。
2019年流式细胞技术复习题一、简答题1简述流式细胞仪的分析检测原理。
用于流式细胞仪检测的样品必须是从标本制备的单细胞悬液，经荧光染料（或荧光素标记的单克隆抗体）染色后上机检测。
流式细胞仪通常以激光作为激发光源,经过聚焦整形后的光束垂直照射在样品流上,细胞悬液样本通过高速流动的液流系统，细胞排成单行,一个一个经过检测区，在检测区中,经荧光染料染色的细胞经激光照射产生散射光信号和荧光信号，由光电倍增管接受,转换成脉冲信号, 入计算机系统后经过专业软件的处理后储存为数据文件，可形成细胞理化特性分析图进行各种分析。
2流式细胞仪散射光信号有哪两种，有何意义。
细胞的散射光参数代表了细胞最基本的物理性的光学参数，无论细胞是否经过荧光抗体或者荧光染料的染色标记，均可以检测到细胞的这两种散射光参数。
而且，通常在检测细胞的特异性荧光参数的前（或同时），均需要对细胞的这两种散射光的参数进行测量和分析，特别实在检测混合细胞群体的时候。
1)前向散射光(Forward scatter, FSC/FS): 表示细胞大小，FSC信号越大,表示细胞越大。
2)侧向散射光(Side scatter, SSC/SS): 表示细胞的颗粒性程度，包括细胞核大小, 细胞器，胞质的数量及细胞膜粒度等，而SSC信号越大,表示细胞粒度越大。
反之,则越小荧光信号也有两种,一种是细胞自发荧光它一般很微弱,一种是细胞样本经标有特异荧光素的单克隆抗体染色后经激光激发发出的荧光，它是我们要测定的荧光,荧光信号较强。
自发荧光信号为噪声信号，在多数情况下会干扰对特异荧光信号的分辨和测量。
一般说来，细胞成分中能够产生的自发荧光的分子(例核黄素、细胞色素等)的含量越高，自发荧光越强；培养细胞中死细胞/活细胞比例越高，自发荧光越强；细胞样品中所含亮细胞的比例越高，自发荧光越强。
3流式细胞术中，常用的标记染色方法有哪几种。
488nm激光光源常用的荧光染料有FITC（异硫氰酸荧光素）、PE（藻红蛋白）、PI （碘化丙啶）、PreCP(叶绿素蛋白)。
淋巴细胞亚群流式
淋巴细胞亚群流式是一种通过流式细胞术检测淋巴细胞亚群的方法。
流式细胞术是一种用于分析细胞特性和功能的生物技术，通过将单个细胞与特异性抗体结合，对细胞表面和内部标记物进行定量和定性分析。
在淋巴细胞亚群流式中，通过使用特异性抗体标记不同的淋巴细胞亚群，如T细胞、B细胞、NK细胞等，然后利用流式细胞仪对标记后的细胞进行快速分析和计数。
这种方法可以获得淋巴细胞亚群的相对百分比和绝对值，从而评估机体的免疫状态。
淋巴细胞亚群流式在临床诊治中发挥了重要作用。
例如，在白血病诊断和治疗中，通过监测异常淋巴细胞亚群及绝对计数结果，可以为临床初步判断信息提供依据。
同时，在诊疗阶段，更为明确的白血病分型及MRD监测有助于为治疗方案选择、临床疗效分析、预后判断、复发监测等方面提供更加精准的医学决策支持。
此外，在免疫重建过程中，多参数流式细胞术结果对于及时评价患者的细胞免疫功能，指导免疫抑制剂等药品的使用种类和剂量等方面均具有重要价值。
需要注意的是，临床检测都有标准化的检测方案，可以直接上机调用建立好的内置模板，使用比较方便。
基础知识考核试卷姓名：部门：分数：日期：一、不定项选择题（既有单项选择题，也有多项选择题，每题3分）1.CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PerCP标记的CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+细胞均为( A )A.T淋巴细胞B.单核细胞C.粒细胞D.B淋巴细胞2.QB细胞因子试剂的有效期为（ D ）A.8个月B.10个月C.12个月D.18个月3．BKM流式细胞仪特有的荧光素是（ C ）A、FITCB、PEC、ECDD、PE-Cy54．QB多因子检测试剂的检测方法为（ A ）A. 双抗体夹心法B.竞争法C.间接法5．QB多因子检测试剂推荐的样本类型是（ B ）A.血浆B.血清C.外周血D.骨髓血6. QB多因子检测试剂所用的微球大小有（CD ）A.2μmB.3μmC.4μmD.5μm7. QB多因子检测试剂所用的微球的荧光强度共有（D ）种A.6B.8C.10D.128.Th2分泌的代表性细胞因子为（B ）A.IL-2B.IL-4C.IL-12D. INF-γ9.HIV病毒攻击的对象为（A ）A.CD4细胞B.CD8细胞C.B细胞D. NK细胞10.某带通滤光片标识为BP 500/50,则其限定接收的波长范围为（B ）A.450-550B.475-525C.400-600D. 450-50011.QBCD3/CD8/CD45/CD4淋巴亚群试剂适用于下列哪种流式细胞仪（ABD）A. CaliburB.CANTO IIC.FC500D.Navios12. 正常人细胞亚群CD3 ＋CD19 ＋CD16/CD56 ＝（A ）A. 100±5%B. 100+5%C. 100-5%D. 100±3%13.下列的单克隆抗体属于QB拥有的为（ B ）A.UCHT1B.HIT3aC.MEM-57D.SK314.下列的荧光素属于QB自有的为（ B ）A.PE-Cy7B.QB500C.APCD.APC-Cy715.革兰氏阴性菌感染中可明显升高10倍以上的细胞因子包括（CD ）A.IL-2B. IL-4C. IL-6D. IL-1016.下列CD4+T中主导细胞免疫反应的为（ A ）A.TH1B. TH2C. TH17D. Treg17.应用TS-SPOT.TB产品时，感染下列哪种环境分枝杆菌时有可能出现假阳性（ABCD ）A. 堪萨斯分枝杆菌（M.kansasii）B. 戈登分枝杆菌（M.gordonae）C. 海分枝杆菌（M.marinum）D. 苏尔加分枝杆菌（M. szulgai)18. TS-SPOT.TB可否用于卡介苗接种人群的结核病检测（ A ）A. 可以B. 不可以C. 仅适用于儿童D. 仅适用于成人19. 下列公司的产品中基于ELISPOT方法学的有（CD ）A. WT TB-IGRAB. KJ QuantiFERONC. NJ T-SPOT.TBD. TS TS-SPOT.TB20.TS-SPOT.TB出现阳性结果表明样本中存在针对结核分枝杆菌特异的效应T淋巴细胞。
流式细胞术检测肺泡灌洗液T淋巴细胞亚群的诊断价值洪燕燕;杨芝红【摘要】目的探讨支气管肺泡灌洗液(BALF)中T淋巴细胞免疫活性对几种常见肺部疾病的临床诊断价值.方法选取该院2013-2015年住院患者61例,其中肺癌15例,肺结核10例,结节病13例,肺部感染15例,特发性肺间质纤维化(IPF)8例.流式细胞仪检测BALF中T淋巴细胞亚群水平.结果 CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+在肺癌组和结节病组变化最明显,与其他组比较,差异有统计学意义(P<0.05).肺癌组CD3+、CD4+下降,CD8+升高,CD4+/CD8+明显下降;而结节病组CD4+升高,CD8+降低,CD4+/CD8+明显升高.肺结核组与肺部感染组也表现为CD4+下降,CD8+相对升高,CD4+/CD8+下降,与结节病组及IPF组比较,差异有统计学意义(P<0.05).IPF组CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+均接近正常值.结论通过流式细胞技术检测BALF中T淋巴细胞亚群水平,在一定程度上可有效区分几种常见的肺部疾病,对了解患者免疫功能、疾病鉴别诊断及预后具有重要的临床价值.%Objective To evaluate the clinical diagnosis value of T-lymphocyte cell activenss in bronchoalveolar lavage fluid(BALF)of patients with several common pulmonary diseases.Methods 61 cases of inpatients in this hospital from 2013 to 2015 were selected,including 15 cases of lung cancer,10 cases of pulmonary tuberculosis,13 cases of sarcoidosis,15 cases of pulmonary infection,8 cases of idiopathic pulmonary interstitial fibrosis(IPF).The levels of T lymphocyte subsets in BALF were detected by flow cytometry.Results CD3+,CD4+,CD8+ and CD4+/CD8+ were obviously changed in the group of lung cancer and sarcoidosis,the difference was statistically significant(P<0.05).In the group of lung cancer,CD3+ and CD4+were lowered,CD8+ was increased,and CD4+/CD8+ was significantly lowered.However,in the group of sarcoidosis,CD4+ was increased,CD8+ was lowered,and CD4+/CD8+ was significantly increased.In addition,in the group of tuberculosis and pulmonary infection,CD4+ was lowered,CD8+ was comparatively increased,and CD4+/CD8+ was significantly lowered,they were significantly different from sarcoidosis andIPF(P<0.05).In the group of IPF,CD3+,CD4+,CD8+ and CD4+/CD8+ were closed to normal value.Conclusion Detecting the level of T-lymphocyte subsets in BALF helps differentiating the above-mentioned pulmonary diseases effectively to some extent,thus it has important value in exploring the immune function of patients and disaese differential diagnosis and prognosis.【期刊名称】《检验医学与临床》【年(卷),期】2017(014)014【总页数】3页(P2051-2053)【关键词】流式细胞技术;肺泡灌洗液;T淋巴细胞亚群【作者】洪燕燕;杨芝红【作者单位】宁夏医科大学总医院,银川 750004;宁夏医科大学总医院,银川750004【正文语种】中文支气管肺泡灌洗检查可直接获取下呼吸道及肺泡上皮表面衬液，对其所含的炎性细胞、免疫细胞进行细胞计数和淋巴细胞亚群检测，可为肺部恶性肿瘤、肺结核、结节病、肺部感染及特发性肺间质纤维化(IPF)等疾病的鉴别诊断和疗效观察提供帮助[1]。
BD FACSCanto II TM 中文培训手册目 录录FACSCa FACSCanto nto (II)培训所需设备培训所需设备//试剂试剂 (3)FACSCanto(II)开机程序开机程序 (4)FACSCanto(II)关机程序关机程序 (6)BD FACSCanto 临床软件进行仪器日常质控临床软件进行仪器日常质控（（QC QC））........................ 7 HLA HLA--B27校准校准 (99)FACSCanto Clinical 六色免洗淋巴细胞亚群检测六色免洗淋巴细胞亚群检测 (10)FACSCanto Clinical 软件的获取分析的具体操作软件的获取分析的具体操作 (11)FACSCanto Clinical 软件进行HLA-B27分析分析 (14)Diva 软件进行HLA-B27手动获取和分析手动获取和分析 (18)Calibrite 四色小球模拟细胞演示四色实验演示四色实验样本获取和分析样本获取和分析样本获取和分析 (20)Diva 软件进行单色&双色获取和分析双色获取和分析 (23)Cytometer Setup and Tracking （CS&T ）操作流程操作流程 (24)FACSCanto (II)流式细胞仪HTS 操作规程 (31)FACSCanto(II)日常保养和维护日常保养和维护 (33)FACSCa FACSCanto nto (II)培训所需设备培训所需设备//试剂1. 普通低速离心机（实验要求为300g,相当于1000～1500rpm，可调转速调时间，能离心12x75mm 的5ml 试管)；2. 固定或可调节的加样器及相应加样头若干： 20ul,50ul, 100ul, 200ul, 250ul，450ul，1ml；3. 旋涡混匀器；4. 烧杯，量筒或移液管，三个清洁的玻璃或塑料带盖试剂瓶(50-100ml)，一个棕色瓶，漏斗，滤纸；5. 300目过滤尼龙网；6. 可放置12x75mm 的5ml 试管的试管架2－3个；7. PBS 溶液和蒸馏水：0.22µm 滤膜过滤；8. NaClO：分析纯，有效氯浓度10%；9. 每天需要一管2ml 的抗凝的人血样本 (最好是EDTA-K 3抗凝)；10.多聚甲醛。
FACSCanto Clinical 四色免洗淋巴细胞亚群的绝对计数
【实验原理】：用已知总数的荧光微球Beads 作标准内参，加入血中，再加入荧光
抗体，应用流式细胞仪中的获取和分析软件，就可以得出血中CD3、CD4，CD8、B 、NK 细胞的绝对数。
【主要试剂】：
（1） 抗体：CD3/CD8/CD45 /CD4；CD3/CD16+56/CD45 /CD19四色
荧光抗体。
（2）Trucount tube （内含数量已知的Beads ）。
（3）FACS Lysing Solution （溶血素）（10×,使用前用蒸馏水稀释成1×）。
【实验步骤】：
1、 取两支TruCount Tube ，编号A 和B ；
2、 用反向加样法在Tube 中加入50ul 充分混匀的抗凝全血，注意血不要碰到试管底部的微球（Beads ）。
3、 取20ul CD3/CD8/CD45/CD4抗体加入到A 管中、取20ul CD3/CD16+56/CD45/CD19标记的抗体加入B 中，注意：不要碰到血。
涡旋混匀，室温避光放置15－20min 。
4、 取出加入450ul 1×FACS 溶血素，充分混匀，避光放置15min 。
5、 24小时内上机用FACSCanto Clinical 软件获取2500个淋巴细胞进行检测，上机前应充分混匀。
；
【注意事项】：
1、 样本使用EDTA 抗凝全血，室温放置，24小时内处理，处理前充分混匀。
2、 取血时要采用反向加样法，即加样枪吸取血样时，打到第二档，放时打到第一档，保证血量的准确，减少误差。
3、 染色和溶血步骤应在室温避光进行，并充分混匀过程中，尽量防止血样的飞溅，以免血样留在管壁上。
4、 本实验为免洗试剂，操作简单，减少细胞的丢失提高工作效率和计数精确度。
5、TruCOUNT 管2-25°C 保存，从冰箱取出后，应恢复室温再打开封条，保证TruCOUNT 管包装袋密闭，袋内干燥剂变成粉红色时，TruCOUNT 管应弃去不用。
Beads 获取数 × 样本量
获取细胞数 × Beads 总量 细胞(/µl)=
FACSCanto Clinical软件的获取分析的具体操作：
（1）、执行FACSCanto开机程序，在桌面上点击进入FACSCantoClinical软件。
（2）、在出现的“Logging In”窗口中输入用户名及密码，然后点击“Login”。
（3）、软件进入“Worklist(工作表)”窗口。
（4）、在“Name”栏中输入患者姓名（可选），在“ID”栏中输入患者ID号（必填），在“Case Number”中输入病例号（可选），点击“Panel”栏，在下拉菜单中选择实验组合如：4color TBNK+TruC；
（5）、如需输入试剂及绝对计数微球批号及数量，可点击菜单栏“Tools”，在下拉菜单中选择“Lot ID”，在弹出的对话框中点击“Absolute Count Beads”标签，在窗口中输入微球批号及微球数量（这些信息均在绝对计数管包装袋上），输入完毕后点击“OK”。
（6）、在窗口最上方的“View”的下拉菜单中，选择“Detectors”、“Spectral
Overlap”、“Threshold”、“Staus”，出现相应的四个窗口。
（7）、然后将第一管样本充分混匀，上样，点击“”，软件出现如下提示框时点击。
（8）、软件显示获取图标，并且出现细胞。
如下图：
如图中显示细胞位置不合适，可点击“”，然后再点击“”，即可调整SSC
电压和阈值，调完毕后可点击“”进行数据获取。
（9）、获取完成后，在出现提示后取下样本管。
在把抽吸臂推向左侧的同时握住样本管。
如果在移动抽吸臂时未用手握住试管，则试管有可能从SIT上掉落下
来，你可能会暴露到潜在生物危险样本。
●把试管从SIT中取出来。
●放开抽吸臂。
当抽吸臂到达中心后，SIT进行自动清洗。
（10）、此时显示实验室报告，可点击“Manual Gate”标签人工调整各个门的位置，调整完毕后点击“Continue”。
（11）、软件提示加载下一个样本管。
（12）、此时将第二管样本充分摇匀，上样，点击“OK”，无需进行调节，直接点击“”进行获取，重复（9）、（10）步骤，手动设门完毕后点击“Continue”。
（13）、继续其他实验，或点击菜单栏“File”在下拉菜单中选择“Exit”，退出
FACSCanto Clinical软件。
注意：（1）做相对记数时，用普通的流式试管代替TruCount管，在Panel中选择4color TBNK。
（2）FCS格式数据文件保存于“C:\BDFACSCantoFCSFiles\YYYYM MDD”；实验室报告（Lab Report）保存于“C:\Program Files\BD FACSCanto S oftware\LabReportFiles\ YYYYMMDD””路径中可以日后进行重新分析。
