巨噬细胞培养

一、实验材料准备1. 动物：各个品系的小鼠2-4只。

2. 试剂：RPMI1640培养基(含酚红)，小牛血清，双抗，培养液(10%小牛血清、RPMI1640、双抗)，台盼兰等。

碘酒绵球和酒精绵球。

3. 器械：一次性注射器、手术器械。

二、实验方法如果采用刺激物，则可在实验前三天腹腔注射3%巯基乙醇酸钠每只2 mL，获得的巨噬细胞数要多一些。

不采用刺激物，直接开始下面的步骤。

1. 拉颈处死小鼠，在75%酒精浸泡1-2分钟，移入超净台中，仰卧位固定于解剖板上，碘酒消毒腹部皮肤，酒精绵球脱碘。

用手术直剪充分剪开腹部皮肤，暴露腹部肌层，再用酒精绵球消毒腹部肌层。

2. 用注射器抽取5 mL含双抗的RPMI1640培养基注入腹腔，用绵球轻揉腹部1-2 min，然后，用眼科镊稍提起腹腔，并用眼科剪剪开一个小口，用吸管吸取细胞悬液，移入离心管中(个人认为，此法比用注射器抽吸好一些)。

3. 1 000 rpm离心5 min后，用含双抗的RPMI1640培养基洗涤一次，再次离心，重悬细胞于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中，如果是作为饲养细胞使用，则选择相应的培养液。

台盼蓝拒染法计数，将细胞稀释到目的浓度后，接种即可。

4. 如果是作为饲养细胞使用，调整浓度至2x105个/mL，接种到96孔板中，每孔100-200 μL；如果作为其它实验使用，可以调整成2x106/mL，加到24孔平底培养板中，1 mL/孔；5% CO2温箱孵育2 h后，换液，并用RPMI1640培养基洗1-2次，弃去未粘附细胞，贴壁细胞为单层的巨噬细胞。

用4度遇冷的1640培养基做，细胞在外面一直放在冰里。

三、结果巨噬细胞刚贴壁时偏圆形，或者类似鹅卵石形状，然后慢慢伸出伪足，铺开呈三角形或多角形。

巨噬细胞有吞噬的特性，当与细菌混合在一起的时候，在40倍物镜下可以看到巨噬细胞吞噬细菌，因此，巨噬细胞作为饲养细胞可以清除部分污染的细菌、支原体和部分细胞碎片。

共培养巨噬细胞和成骨细胞的方法下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。

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巨噬细胞属天然免疫细胞，具有趋化运动、吞噬、分泌和参与免疫调节等功能，是科学工作者研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。

巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。

巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周多用做原代培养，不易长期生存。

巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l 等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。

目前，单核巨噬细胞株也有，比如RAW264.7，但价格比较贵，且保存也不方便。

培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，目前以小鼠腹腔取材法最为实用，而目前获取小鼠巨噬细胞的方法有两种，一种是直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞，还有一种方法向动物腹腔中注射刺激物（如牛血清，淀粉，糖原，脂多糖，矿物油，PRMI1640培养液等），这样使机体产生大量巨噬细胞后再腹腔灌洗，但由于许多刺激物能激活巨噬细胞，而被激活的巨噬细胞大量吞噬刺激物，有此得到的巨噬细胞培养用于培养时，细胞中的刺激物不能很快被消化而残留在细胞中，影响细胞代谢，同时也不能很好的模拟体内环境，所以我们直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞。

我们选择6周龄的昆明小鼠是因为此年龄小鼠能产生最多的巨噬细胞。

2试验材料昆明种小鼠 10只体重约18g～25g（约6周龄）由广西医科大学动物实验中心提供公鸡 1只PRMI1640培养基新生小牛血清HEPESD-Hanks液青霉素链霉素3试验仪器无菌操作台手术刀解剖剪解剖镊止血钳 5m注射器注射针，试管、培养瓶（12），12孔培养板(12)等。

二氧化碳培养箱生物显微镜高速冷冻离心机4实验步骤4．1细胞培养液的制备及消毒制备方法:将RPMI1640干粉一袋，HEPES4. 77g加入800m1三蒸水中，充分溶解后缓慢加入碳酸氢钠并逐步添加三蒸水，使溶液的pH值处于7. 2-7. 4之间，容积为1000m1。

巨噬细胞与软骨细胞共培养
巨噬细胞是一种免疫系统中的主要细胞类型，主要功能是吞噬和
消化体内的病原体或异物。

而软骨细胞是一种特殊的结缔组织细胞，
主要存在于软骨组织中，起到维护和修复软骨组织的功能。

巨噬细胞与软骨细胞共培养可以模拟一些炎症和损伤等生理或病
理过程。

在共培养中，巨噬细胞可以受到刺激，产生一系列的炎症因子，包括细胞因子和趋化因子，这些因子可以通过细胞间相互作用传
递到软骨细胞，对软骨细胞的生理状态和功能产生影响。

研究已经显示，巨噬细胞激活可以导致软骨细胞的炎症反应和损伤，同时也可以激活软骨细胞的修复和再生机制。

此外，巨噬细胞还
可以影响软骨细胞的分化和增殖，并调节软骨组织的胶原合成和分解。

通过巨噬细胞与软骨细胞共培养，可以更好地理解巨噬细胞和软
骨细胞之间的相互作用及其在炎症和修复过程中的作用机制，有助于
深入了解相关疾病的发病机制，并为开发相关治疗策略提供理论依据。

小鼠原代腹腔巨噬细胞培养一．实验用品：器材：眼科镊，眼科剪，Pe铝箔，离心管（50ml两个），针管（5ml和1ml），酒精灯，移液枪，枪头，酒精棉球，75％酒精，酒精喷壶，烧杯。

器械：显微镜，细胞计数版，计数器。

试剂：PBS（磷酸盐缓冲液），TF,TG(巯基乙醇酸钠），含10％TBS的RPMI-1640培养液（重悬细胞）。

二．实验步骤：1.提取小鼠巨噬细胞前3-5天：向每只小鼠腹腔注射2ml-2.5ml的3％的TG(诱导巨噬细胞向M1型转化），充分酒精消毒。

2.前1天：高压器械（剪刀，镊子，铝箔纸，烧杯）3.提取巨噬细胞：三．结果：巨噬细胞：刚贴壁时偏圆形，或者类似鹅卵石形状，然后慢慢伸出伪足，铺开呈三角形或多角形。

巨噬细胞有吞噬的特性，当与细菌混合在一起的时候，在40倍物镜下可以看到巨噬细胞吞噬细菌，因此，巨噬细胞作为饲养细胞可以清除部分污染的细菌、支原体和部分细胞碎片。

巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。

巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。

巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周，多用做原代培养，难以长期生存。

小鼠腹腔巨噬细胞原代培养的应用：（1）用于细胞保种；（2）用于分子生物学研究；（3）用于基因治疗研究。

*注意：1. 巨噬细胞是终末分化细胞，不会增殖。

2. 很难消化下来，所以接种的时候，必须直接接种到目的培养器皿中。

3. 严格无菌操作，在超净台内进行。

4. 为避免交叉感染，每一只小鼠更换注射器。

5. 吸管吸取细胞悬液的时候，尽量不要吸到大小肠，否则容易引起成纤维细胞污染。

换液：培养液从4度取出回温，超净台中操作，用移液枪换液即可。

bmdms培养方法
BMDMS是指骨髓来源的巨噬细胞（Bone Marrow-Derived Macrophages）。

它们是一种重要的免疫细胞，常被用于研究免疫学、生物学和疾病模型等方面。

下面我将从多个角度介绍BMDMS的培养
方法。

1. 材料准备。

常用培养基包括DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）或RPMI 1640培养基，其中含有10%胎牛血清（FBS）或去
血清培养基，还有抗生素如青霉素/链霉素。

2. 培养骨髓细胞。

首先需要从小鼠或大鼠的骨髓中分离细胞。

通常使用灭菌的
方式，将小鼠或大鼠的胫骨和腓骨取出，用培养基冲洗骨髓腔，将
细胞悬浮液通过滤网筛选，得到单个的骨髓细胞。

3. 培养和分化。

将分离得到的骨髓细胞接种在培养皿中，培养基中含有巨噬细胞分化因子如M-CSF（巨噬细胞集落刺激因子）。

细胞培养在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中，每隔2-3天更换一次培养基，培养7-10天左右，即可得到成熟的BMDMS。

4. 细胞纯化。

有时为了得到更纯净的BMDMS，可以利用差速贴壁法（adherence method）或密度梯度离心分离等技术进行细胞纯化。

总之，BMDMS的培养方法是一个复杂而精细的过程，需要严格控制培养条件和培养基的配方，以确保得到高质量的巨噬细胞。

同时，培养过程中的细胞分化、纯化等步骤也需要根据具体实验的要求进行调整和优化。

希望以上信息能够对你有所帮助。

小鼠巨噬细胞RAW264.7的培养技巧及经验总结小鼠巨噬细胞RAW264.7的培养技巧及经验总结引言：巨噬细胞是免疫系统中重要的成分，广泛存在于骨髓、血液、淋巴组织等处。

巨噬细胞具有特殊的吞噬能力，能够吞噬病原菌及其代谢产物，调控免疫反应和清除废物，对维持人体内环境稳定起着重要作用。

因此，很多研究都需要使用巨噬细胞进行相关实验，本文将介绍一种常用的实验动物模型小鼠巨噬细胞RAW264.7的培养技巧及经验总结。

一、材料和试剂1. 培养基：DMEM高糖培养基（Dulbecco's Modified Eagle Medium）。

2. 补充剂：10%胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS），1%青霉素-链霉素溶液。

3. 漂洗液：DPBS（Dulbecco's Phosphate Buffered Saline）。

4. 消化液：0.25%胰酶溶液。

5. 凝胶：1%琼脂糖凝胶。

6. 染色剂：Trypan Blue。

二、培养条件1. 温度：37℃。

2. 湿度：95%。

3. CO2浓度：5%。

三、培养步骤1. 培养皿的处理将培养皿倒置放在培养柜中，加入少量95%酒精进行消毒，再倒置晾干入培养箱。

2. 细胞传代1) 将细胞培养液放入离心管中，500g离心5分钟，倒掉上清液。

2) 加入适量的DPBS定量漂洗。

3) 加入适量的0.25%胰酶溶液，室温静置10分钟，观察细胞的脱落程度。

4) 加入适量的DMEM高糖培养基，将细胞悬浮液用吸管吸取到离心管中。

5) 500g离心5分钟，倒掉上清液。

6) 加入适量的DMEM高糖培养基进行细胞计数。

3. 细胞接种1) 取出一支分装好的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞冻存管，迅速放入37℃的水中解冻。

2) 将细胞悬浮液滴加入新培养皿中，加入足够的DMEM高糖培养基使细胞浓度达到合适的浓度（一般为10万/mL）。

3) 等待24-48小时，观察细胞生长情况，细胞覆盖率达到80%以上即可进行下一步实验。

巨噬细胞的实验原理是啥
巨噬细胞的实验原理是通过体外培养的方式，将目标细胞（如细菌、病毒或异物）与巨噬细胞接触，观察和分析巨噬细胞的生物学功能和作用。

巨噬细胞通常参与机体的免疫防御，通过吞噬、杀伤和降解外来病原体或异物，维持机体的内稳态和健康状态。

具体实验步骤可以包括以下内容：
1. 制备巨噬细胞：从实验动物或人体中获取巨噬细胞，通过培养基培养和增殖，使其获得足够的数量。

2. 培养实验细胞：将巨噬细胞放入培养皿中，提供合适的培养基和条件（如温度、湿度、适宜的营养物质），使其继续生长和分化。

3. 处理标的细胞：将待测的目标细胞（如细菌）加入到巨噬细胞培养皿中，使其与巨噬细胞接触。

4. 观察和分析：观察巨噬细胞对目标细胞的处理过程，可以通过显微镜观察和记录形态学变化，或者通过其他实验技术（如流式细胞术、PCR等）检测相关指标，如细胞增殖、细胞毒性、细胞吞噬能力等。

通过巨噬细胞实验，可以研究巨噬细胞与外源物质的相互作用过程、潜在细胞信
号通路和免疫机制等。

这些实验结果有助于理解巨噬细胞的生物学功能、疾病发生机制以及新药物和疫苗研发的方向。

胆固醇巨噬细胞共培养
胆固醇是一种重要的脂质化合物，对于细胞膜的结构和功能至关重要。

然而，高胆固醇水平与心血管疾病等健康问题密切相关。

巨噬细胞是免疫系统中的重要成分，其主要功能是清除体内的异物和细胞垃圾。

最近的研究表明，胆固醇与巨噬细胞之间存在着密切的相互作用，这为胆固醇代谢和免疫系统之间的关联提供了新的视角。

共培养是一种常见的实验技术，用于研究不同类型细胞之间的相互作用。

在胆固醇巨噬细胞共培养实验中，研究人员通常将巨噬细胞与含有不同胆固醇水平的细胞或培养基一同培养，以模拟体内胆固醇水平的变化对巨噬细胞功能的影响。

研究发现，高胆固醇水平可以显著影响巨噬细胞的活性。

一方面，高胆固醇水平可能导致巨噬细胞的过度激活，增加炎症因子的分泌，从而加剧炎症反应。

另一方面，高胆固醇水平也可能影响巨噬细胞的吞噬功能，使其对细胞垃圾和异物的清除能力下降。

这些结果揭示了胆固醇与巨噬细胞活性之间的密切关联，为进一步探究胆固醇代谢异常与免疫系统失调之间的关系提供了重要线索。

此外，胆固醇巨噬细胞共培养实验也为开发新的治疗策略提供了启示。

通过调节胆固醇水平或干预巨噬细胞的活性，可能有助于预防或治疗与胆固醇代谢异常相关的疾病，如动脉粥样硬化等。

因此，深入研究胆固醇巨噬细胞共培养的相互作用机制，对于促进相关疾病的治疗和预防具有重要意义。

总之，胆固醇巨噬细胞共培养实验为我们揭示了胆固醇与免疫系统之间的复杂相互作用，为相关疾病的研究和治疗提供了新的思路和方法。

相信随着进一步的研究，我们将能够更好地理解胆固醇代谢异常与免疫系统失调之间的关系，并为相关疾病的预防和治疗开发出更加有效的策略。

巨噬细胞培养操作方法
巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分
子免疫学的重要对象。

巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。

巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周，多用做原代
培养，难以长期生存。

巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331、 S774A.1、RAW 309Cr.l等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代
和瓶壁分离，但难以建株。

培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，以小鼠腹腔取材
法最为实用，其法如下：
1、实验前三天，向小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤 lml（勿注入肠内！），以刺流产生大量的巨噬细胞。

2、引颈处死小鼠。

3、手提鼠尾将其全浸入70%乙醇中 3－5秒。

4、置动物于解剖台，用针头固定四肢，持镊撕开腹部皮肤，但勿伤及
腹膜壁，把皮肤拉向上下两侧，暴露出腹膜壁。

5、用70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中，同时
用手指从两侧压揉腹膜壁，使液体在腹腔内流动。

6、用针头轻挑起腹壁并微倾向一侧．使腹腔中液体集中于针头下吸取
入针管内。

7、小心拔出针头，把液体注入离心管。

8、4℃下250g离心10分钟后，去上清，加10ml Eagle培养基。

9、计数细胞。

每只鼠可产生20一30×106细胞，其中 90%为巨噬细胞。

10、以3×105个贴附细胞/平方厘米接种。

11、接种数小时后，除去培养液，可去除其它白细胞，纯化培养细胞，用Eagle液冲洗1一2次，再加新Eagle培养液置CO2温箱中。

巨噬细胞培养细胞培养准备一、实验器材：1.培养瓶离心管注射型滤器（正压过滤器）2.手术器材：镊子手术剪止血钳注射器针头3.包装用品支架：饭盒包装纸硫酸纸棉线准备：1.清洗：刷洗，煮沸后加洗剂冲洗，振荡冲洗15-20次酸泡，烤干后泡24h浸泡，去离子水2次，每次24h，新玻璃器材5%HCL2.包装：瓶管口，双层纸；盖玻片条；瓶塞；吸管，管底垫棉花，管头塞棉花；饭盒：盒底垫纱布，瓶口向下，液体瓶插针头，盖纱布、盖子滤菌器，双层滤纸3.消毒高压蒸汽，紫外线，滤过消毒化学消毒，酒精，新洁尔灭，过氧乙酸（无菌室），火焰消毒二、实验仪器：CO2培养箱：电源，温度，湿度，5%CO2注意事项：1.定期紫外线，酒精消毒2.CO2气压定期测试3.供气中断拧紧瓶盖4.定期加水，保持湿度5.培养瓶酒精消毒入箱倒置显微镜普通光学显微镜24孔培养板酸度计蒸汽灭菌器离心机超净工作台血球计数板三、药品及细胞用液：药品：75%酒精，0.4%台盼蓝1.平衡盐溶液：HANK’S 液：甲液：NaCl 80.0gKCl 4.0gCaCl2 1.4gMgSO4·7H2O 2.0g乙液：Na2HPO4·12H2O 1.52gKH2PO4 0.6g葡萄糖10.0g丙液：1％酚红溶液16ml将甲、乙各种试剂按顺序分别溶于450ml 蒸馏水中，之后将乙液缓缓加入甲液中，边加边搅拌，再加入丙液，补蒸馏水至1000ml，用滤纸滤过后，加入氯仿2.0ml，置于2-8℃保存。

使用时，用蒸馏水稀释10 倍，经116℃，15 分钟灭菌。

使用前用7.5％NaHCO3调pH 至7.2-7.4。

two big0.01M PBS（pH7.2-7.6）：NaCl 8.5gNa2HPO4 1.4gNaH2PO4 0.2g溶于1000ml 蒸馏水中。

Two big2.天然培养基：胎儿牛血清two small3.消化液：胰酶液，胶原酶液，0.3%EDTA,TE4.青链霉素溶液：10ml HANK’S 液中溶解100 万单位硫酸链霉素配成硫酸链霉素溶液，取出8ml硫酸链霉素溶液溶解80 万单位的青霉素钠配成每毫升青霉素、链霉素各10 万单位的母液。

小鼠骨髓巨噬细胞分离培养方法1. 引言1.1 背景介绍小鼠骨髓巨噬细胞是一类重要的免疫细胞，在机体内起着重要的天然免疫作用。

骨髓巨噬细胞是一种具有吞噬活性的专门吞噬异物和死亡细胞的细胞。

通过吞噬和清除宿主体内产生的有害物质，维持机体内环境的稳定。

在炎症、感染和组织受损等情况下，骨髓巨噬细胞的活性会被激活，以保护机体免受损害。

骨髓巨噬细胞的分离培养方法对于研究骨髓巨噬细胞的生物学功能及其在疾病发生发展中的作用具有重要意义。

利用适当的方法将骨髓巨噬细胞分离出来，并在适宜的培养条件下进行培养，有助于深入了解巨噬细胞的生理生化功能。

开发一种简便、高效的分离培养方法对于骨髓巨噬细胞的研究具有重要意义。

本研究旨在探索一种小鼠骨髓巨噬细胞分离培养方法，优化培养条件，建立细胞鉴定和功能评价的方法，从而为进一步研究骨髓巨噬细胞的生物学功能提供方法学支持。

通过深入研究骨髓巨噬细胞的分离培养方法及其功能，在疾病防治和免疫调节等方面具有潜在的应用前景。

1.2 研究目的研究目的：小鼠骨髓巨噬细胞是重要的免疫细胞，具有吞噬和溶解异物的功能，在机体免疫和炎症反应中起着至关重要的作用。

目前关于小鼠骨髓巨噬细胞的分离培养方法仍存在一些局限性，如细胞纯度低、存活率低等问题。

本研究旨在探究一种高效、稳定的小鼠骨髓巨噬细胞分离培养方法，提高骨髓巨噬细胞的纯度和存活率，为进一步研究小鼠免疫功能和炎症反应提供可靠的细胞来源和实验基础。

通过优化培养条件、验证细胞鉴定的方法和评价细胞功能的指标，希望为小鼠骨髓巨噬细胞的研究提供新的思路和方法。

通过本研究的开展，期待能够为相关领域提供有益的实验数据和研究成果，促进小鼠骨髓巨噬细胞研究的深入发展。

1.3 研究意义小鼠骨髓巨噬细胞是一种重要的免疫细胞，在免疫系统中起着关键作用。

研究小鼠骨髓巨噬细胞的分离培养方法，不仅可以帮助我们更深入地了解这一类细胞的特性和功能，还可以为相关疾病的治疗和预防提供重要的理论和实践基础。

肿瘤细胞和巨噬细胞共培养肿瘤细胞和巨噬细胞共培养是一种广泛应用于肿瘤研究领域的方法。

该方法可以模拟肿瘤体内的微环境，并探究肿瘤细胞和免疫细胞之间的相互作用。

在肿瘤体内，巨噬细胞是一种重要的免疫细胞类型，对肿瘤的发展和治疗具有重要的影响。

一、共培养方法及其优缺点共培养方法是将肿瘤细胞和巨噬细胞一起培养在同一培养皿中，以模拟肿瘤体内的微环境。

共培养方法主要有两种：一种是将肿瘤细胞和巨噬细胞混合培养，另一种是先将巨噬细胞培养后，再加入肿瘤细胞共同培养。

两种方法各有优缺点，具体选择应根据实验目的和具体情况决定。

优点：1.模拟肿瘤微环境：共培养可以模拟肿瘤体内的微环境，便于研究肿瘤细胞和巨噬细胞之间的相互作用。

2.增强巨噬细胞的免疫活性：共培养可激活巨噬细胞的免疫活性，促进其对肿瘤细胞的攻击。

3.促进药物筛选：共培养可用于药物筛选，评价药物对肿瘤细胞和免疫细胞的影响，为药物研发提供参考。

1.实验条件较为苛刻：共培养需要保证肿瘤细胞和巨噬细胞的比例和密度，对实验条件要求较高。

2.难以分离：共培养后，肿瘤细胞和巨噬细胞可能互相粘附，分离困难。

3.不适用于其他免疫细胞：共培养主要用于模拟肿瘤体内巨噬细胞的作用，不适用于其他免疫细胞。

二、共培养的应用共培养方法已广泛应用于肿瘤研究领域，并取得了一定的研究进展。

下面介绍一些目前较为热门的应用。

1.研究肿瘤免疫逃逸机制共培养肿瘤细胞和巨噬细胞可以研究肿瘤细胞如何逃避巨噬细胞攻击的机制。

肿瘤细胞可以通过表达免疫抑制因子、抑制巨噬细胞的活性，从而逃避免疫攻击。

共培养的方法可以通过实验探究这一过程，有助于加深我们对肿瘤免疫逃逸机制的认识。

2.评价免疫细胞介导的肿瘤治疗效果共培养可以用于评价免疫细胞介导的肿瘤治疗效果。

近年来，免疫细胞疗法已成为肿瘤治疗的一个热门研究领域。

共培养对于评价免疫细胞是否能有效攻击肿瘤细胞、是否可以提高肿瘤细胞的治疗效果具有一定的参考价值。

3.筛选肿瘤免疫抑制因子共培养可以用于筛选肿瘤免疫抑制因子。

巨噬细胞原代培养1、实验前三天，向每只小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤1ml（勿注入肠内）。

2、引颈杀死动物，手提鼠尾将全鼠浸入70%酒精中3～5秒。

3、置动物于解剖台上，用针头固定四肢，双手持镊撕开皮肤拉向两侧，暴露出腹膜，但勿伤及腹膜壁。

4、再用70%酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10mlEagle液注入腹腔中，同时从两侧用手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动。

5、用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针头下吸取入针管内。

6、小心拔出针头，把液体注入离心管中，250g4℃离心10分钟，去上清，加10mlEagle培养基。

7、计数细胞，每只小鼠可产生20～30×105细胞，其中90%为巨噬细胞。

8、为获取3×105帖附细胞/平方厘米，需接种2.5×106/ml。

9、为纯化培养细胞，去除其它白细胞，接种数小时后，去除培养液，用Eagle液冲洗1～2次后，再加新Eagle培养液置37℃CO2温箱中培养.小鼠单核/巨噬细胞RAW 264.71.在ATCC对该细胞传代的描述中是采用细胞刮棒进行的。

我们的经验是，以0.25%胰酶+0.02%的EDTA作为消化液。

使用温至室温的消化液进行消化，消化时镜下观察，并用手掌轻拍细胞贴壁的瓶底，约3~5 min后，待约10%左右的细胞脱离瓶壁即可终止消化，弃去胰酶，以含10%FBS的DMEM培养基吹打细胞。

值得注意的是该细胞对机械损伤比较敏感，所以不要用吸管反复吹打细胞。

该细胞很难将瓶内所有细胞都吹下来，所以换瓶传代就行了。

看了楼主的描述，感觉是细胞难以耐受机械损伤而导致裂解了。

2.消化液：0.5％胰酶、0.2％EDTA，实验前加温到37度以50ml培养瓶为例：1、细胞贴壁生长，长满瓶底80％时，弃去培养液，加D-HANKS 漂洗两次；2. 加入含胰酶和EDTA的消化液1－2ml,消化37℃约2-5min，镜下可见细胞基本圆形回缩即中止消化，弃消化液加D-HANKS 漂洗两次；3.加入新培养液10ml复吹打混悬细胞，按需要分入新的培养瓶3.我得操作如下：实验前将DPBS及DMEM加温到37度使用Flask75培养瓶：1、细胞贴壁生长，长满瓶底70％时，弃去培养液，加DPBS(磷酸盐缓冲液)10ml漂洗一至两次；弃去2. 加入10mlDPBS,然后用scratcher轻轻刮即可，离心后去除DPBS.用DMEM培养液10ml复吹打混悬细胞3.分入新的培养瓶；4. 入37℃5％CO2孵箱，几小时后即可再贴壁。