20×SSC缓冲液使用说明

北京雷根生物技术有限公司
双链DNA 变性缓冲液
简介：
双链DNA 变性缓冲液又称为中性转移缓冲液，由1.5M NaCl 、微量NaOH 等组成，不含蔗糖，可用于核酸杂交等，尤其适用于Southern blot 实验。

本试剂仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

组成：
操作步骤(仅供参考)：
1、 按实验具体要求操作。

注意事项：
1、 如果每次的使用量很小，可以适当分装后再使用。

2、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

有效期： 12个月有效。

相关：
编号 名称 NH0079 Storage 双链DNA 变性缓冲液 100ml RT 使用说明书 1份 编号 名称
DG0005 糖原PAS 染色液
NE0011 CTAB 抽提液
NH0043 SSC 缓冲液(20×,pH7.0)
NH0053 变性鲑鱼精DNA(10mg/ml)
NR0001 DEPC 处理水(0.1%)
PW0082 丽春红S 染色液(1×Ponceau S)
TC0699 葡植物总糖和还原糖检测试剂盒(硝基水杨酸法)。

Southern 杂交实验Southern 杂交的原理是将待检测的DNA分子用限制性内切酶消化，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按照其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其他标记物标记的DNA探针进行反应。

如果待测物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补原理进行结合，游离的探针洗涤后用显影或其他合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。

一、溶液配制(1)20 X SSC(1000 mL) :组分浓度 3.0M的Nacl，0.3M的柠檬酸钠NaCl 175.32g柠檬酸钠88.26gNaOH调PH值到7.0，高温高压灭(2)洗涤缓冲液Washing buffer 200ml组分浓度：0.1M Maleic acid, 0.15M Nacl; pH 7.5(20℃); 0.3%(v/v) Tween20.Maleic acid：2.32gNacl： 1.75gTween20 0.6mlNaOH固体约1.7g调Ph值7.5(3)马来酸缓冲液Maleic acid buffer 200ml组分浓度：0.1M Maleic acid, 0.15M Nacl; pH 7.5 (20ºC)Maleic acid：2.32gNacl： 1.75gTween20 0.6mlNaOH固体约1.7g调Ph值7.5(4)检测缓冲液Detection buffer 100ml组分浓度：0.1M Tris-HCl, 0.1M Nacl, pH 9.5(20ºC)Tris 1.21g,NaCl 0.584gMgCl2 1.01g调ph值到9.5(5)变性溶液(500 mL)： 1 mol／L NaCl (43.83 g)， 0.5 mol／L NaOH (10 g)，(6)中和溶液(500 mL)：0.5 mol / L Tris (30.27 g)，3 mol／L NaCl (87.66 g)，用1 mol／L HCl调(7)5 × TBE (250 mL)：13.5g Tris 6.9g硼酸, 0.9 g EDTA-Na2，定容250 mL(8)6 ×溴酚蓝载样液：0.25 ％溴酚蓝，40 ％蔗糖(9)4 mol／L EDTA 100 mL(10)1M Tris-HCl (pH 8.0): 称取12,。

生物化学实验常用缓冲液的配制方法1、0.2mol/L 磷酸缓冲液 *组份浓度0.2mol/L （pH 6.0）*配制量1L*配置方法 1. 称取磷酸氢二钠.12水8.82 g。

2. 称取磷酸二氢钠.2水27.34g。

3. 用去离子水溶解并定容至1L。

室温保存。

注意：此为母液，使用时稀释40倍使用。

2、洗脱液*组份浓度0.15mol/L （含0.15mol/L 氯化钠的0.005mol/L pH 6.0的磷酸缓冲液）*配制量10L*配置方法 1.称取氯化钠87.66g。

2.用0.2mol/L pH6.0的磷酸缓冲液250mL溶解。

3.用去离子水稀释至10L。

室温保存。

3、0.3mol/L 磷酸缓冲液*组份浓度0.3mol/L （pH7.8）*配制量0.5L*配置方法 1.准确称取磷酸氢二钠.12水49.150g。

2.磷酸二氢钠.2水2.000g。

3.用去离子水溶解并定容至0.5L。

室温保存。

注意：此为母液，使用时稀释10 倍使用。

4、0.2mol/L 乙酸缓冲液*组份浓度0.2mol/L （pH4.6）*配制量2L*配置方法 1.准确称取乙酸钠.3水54.44g。

2.加入23mL冰乙酸，溶解。

3.用去离子水溶解并定容至2L。

4℃保存。

5、0.2mol/L 磷酸-柠檬酸缓冲液（pH 2.6、4.6、6.6）*组份浓度0.2mol/L *配制量各1L*配置方法 1.母液A（0.2mol/L 的Na2HPO4溶液）：称取Na2HPO4.12 水143.256g，用去离子水定容至2L。

2.母液B（0.1mol/L 的柠檬酸溶液）：称取柠檬酸.1水42.028g 用去离子水溶解定容至2L。

3. pH2.6、4.6、6.6的三种缓冲液如下表配制：pH值A（mL）B（mL）2.6 109.0 891.04.6 467.5 532.56.6 727.5 272.54.按上表混匀后，4℃保存。

6、20×SSC 缓冲液*配制量1L（pH7.0）*配置方法 1.准确称取175.2g氯化钠。

三、核酸电泳相关试剂、缓冲液的配制方法50×TAE Buffer (pH8.5)组份浓度2 M Tris-醋酸，100 mM EDTA 配制量 1 L配制方法1.2.3.加入57.1 ml 的乙酸，充分搅拌。

4.加去离子水将溶液定容至l L 后，室温保存。

10×TBE Buffer (pH8.3)组份浓度890 mM Tris- 硼酸，20 mM EDTA 配制量 1 L配制方法l.2.3.加去离子水将溶液定容至l L 后，室温保存。

10×MOPS(3-吗啉基丙磺酸)Buffer组份浓度200 rnM MOPS，20 mM NaOAc，10 mM EDTA 配制量 1 L配制方法1.称41.8 g MOPS，置于1 L 烧杯中。

2.加约700 ml DEPC 处理水，搅拌溶解。

3.使用2 N NaOH 调节pH 值至7.0。

4.5.用DEPC6.用0.45 m 滤膜过滤除去杂质。

7.室温避光保存。

注：溶液见光或高温灭菌后会变黄。

变黄时也可使用，但变黑时不要使用。

溴乙锭(10 mg/ml) 组份浓度10 mg/ml 溴乙锭配制量100 ml 配制方法 1.称量 1 g 溴乙锭，加入到100 ml 容器中。

2.加入去离子水100 ml ，充分搅拌数h 完全溶解溴乙锭。

3.将溶液转移至棕色瓶中，室温避光保存。

4.溴乙锭的工作浓度为0.5 g/ml 。

注意：溴乙锭是一种致癌物质，必须小心操作。

Agarose 凝胶配制方法1. 配制适量的电泳及制胶用的缓冲液（通常是0.5×TBE 或1×TAE）。

2.根椐制胶量及凝胶浓度，准确称量琼脂糖粉，加入适当的锥形瓶中。

3.加入一定量的电泳缓冲液（总液体量不宜超过锥形瓶的50%容量）。

注：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须统一。

4.在锥形瓶的瓶封上保鲜膜，并在膜上扎些小孔，然后在微波炉中加热熔化琼脂糖。

加热过程中，当溶液沸腾后，请戴上防热手套。

SOUTHERN BLOTTING实验操作流程A.小麦基因组DNA的提取1)采集5g鲜嫩的小麦幼苗，将其剪成2cm左右的片段，用液氮冷冻后在研钵中将其研成粉末（研磨15min左右）。

2)将研磨好的样品转移到预冷的50ml离心管中，加入20ml预热的S buffer，颠倒混匀。

S Buffer成分100mM Tris.Cl pH8.5100mM NaCl50mM EDTA pH8.02％ SDS3)于65℃水浴锅中温育1-2h，并不时轻柔混匀。

4)加入20ml（等体积的）酚/氯仿，轻柔地颠倒混匀，直至呈乳状（注意：保证混匀。

为有效除去蛋白，此步可以重复）。

5)用水平转子离心机以2000rpm的转速离心20-30min。

6)加入等体积的氯仿，轻柔地颠倒混匀，2000rpm离心20min。

7)转移上清到1个灭菌的50ml离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置一段时间，用玻璃勾将DNA钩出。

8)用70％的乙醇清洗DNA 2-3次后，将其挑在玻璃钩上晾干，然后溶解在5ml 1×TE中。

9)待DNA完全溶解后接入10μl RNase，于37℃恒温箱中温育1h。

10)加入等体积的酚/氯仿，轻柔颠倒混匀，以2000rpm的转速离心15min。

11)转移上清至1个灭菌的离心管中，加入等体积的氯仿，混匀，以2000rpm的转速离心15min。

12)转移上清至1个灭菌的离心管中，加入1/10 体积 3M pH 5.0的乙酸钠（终浓度为0.3M），混匀后再加入2倍体积95％的乙醇，混匀。

13)用玻璃勾将DNA钩出，然后用70％的乙醇清洗2-3次，晾干后加入1.8-2ml 1×TE溶解。

14)待DNA完全溶解后，取1μL DNA电泳，检测DNA的浓度和完整性。

15)DNA样品可以放在4℃保存备用。

B.小麦基因组DNA的酶切1）通常情况下采用下列酶进行谷类作物DNA分析。

识别6碱基序列的酶识别4碱基序列的酶Apa I Hind III Bam HI Alu I Mbo I Hha ISal I Bgl I Sst I Dde I Msp I Taq IDra I Pvu II Eco RV Hae III Rsa I Hinf IEco RI Xba I2）如果一次酶切DNA的量在10μg左右，一般采用30μL反应体系。

免疫沉淀（Immunoprecipitation IP ）美国芝加哥大学分子肿瘤实验室提供一、准备试剂：IP裂解液配制方法（100毫升体积）：50mM Tris-HCl pH 7.5 1M 5ml100mM NaCl 5M 2ml0.5% NP-40 (10% stock) 10ml0.3mM NaVO3 5.52mg50mM Na F 210mg20mM Na Pyrphosphate 892mg1mM PMSF 17.42mg加水至总体积达到100 ml二、实验步骤：（本方法适用于从细胞培养来源的蛋白质）1．将细胞培养液移去，加入裂解液-蛋白酶抑制剂混合液（IP-PI buffer）（T25培养瓶中加入1毫升，T75中加入3毫升），充分裂解后，将混合液转入微量离心管中。

2．冰上放置20分钟，偶尔轻微震荡。

3．4℃下，微量离心机最高速离心5分钟。

将上清液转移至另一微量离心管中。

4．加入30ul protein G- Sepharose beads（与IP-PI buffer 1：1混合）至样品中，4℃下充分混合震荡反应1小时。

5．微量离心机最高速离心1分钟，将上清转移至另一微量离心管中。

6．加入抗需要沉淀的蛋白质的抗体（2-5ug/ 样品），4℃下充分混合震荡反应1小时。

7．加入30ul protein G- Sepharose beads，4℃下充分混合震荡反应1小时。

8．微量离心机最高速离心1分钟，将上清吸弃，收集beads沉淀。

9．沉淀中加入2ul 2-巯基乙醇，煮沸10分钟，离心后取上清，行SDS-PAGE胶电泳及Wester-blotting 检测。

Western Blot(NC膜)重庆医科大学感染病分子生物学实验室一、SDS－PAGE胶电泳1. 75％酒精擦洗洁净玻片及加样梳，组装制胶槽；2. 配制分离胶：1）根据分子量选择分离胶的浓度；2）依次加入ddH2O、30％丙烯酰胺（普通滤纸过滤，避光保存）、1.5MTris－Cl（pH8.8）、10％SDS、10％过硫酸胺、TEMED，充分混匀，将混合液加至双层玻片之间；注意：1、TEMED是促凝剂，加了以后应迅速灌胶；2、分离胶的高度为插上加样梳后梳子下缘下1cm；3）以ddH2O封闭，室温放置1h以上；（可以加大促凝剂和催化剂的量，这样可以在短时间内完成分离胶配制；4）当水和分离胶有了可见的明显界限，倒掉上层水，以滤纸吸尽多余的水分（或将制胶器倾斜用加样枪吸去水即可）；注意：手法轻柔一些，不可损伤分离胶；3. 配制积层胶：1）浓度均为5％，只需选择体积，宁多勿少；2）配制方法同上，灌至平低玻片上缘，插上加样梳，小心不能产生气泡；3）室温放置1h以上；（可以加大促凝剂和催化剂的量，节省时间）注意：1、BioRad的两块板需要分离胶7ml，积层胶3ml；2、此时Tris－Cl为1.0M（pH6.8）；3、加样梳不能做平行移动，只能上下移动；4. 样品处理：1）细菌和细胞离心所得沉淀以PBS（也可以直接加入上样buffer）重悬，体积根据细菌量和细胞数调节；2）以等倍体积2×蛋白上样缓冲液混匀；3）沸水煮3－5分钟；注意：时间不宜过长，尤其是Marker；（Marker参看说明书要求，MBI的比较好，Prome ga的较差）4）离心，取上清加样；5. 电泳：1）电泳装置组装完毕后，加入甘氨酸电泳缓冲液，拔出加样梳；2）依次加样；（Marker最好选用预染型，这样在电泳时就可方便的判断目的蛋白的位置）；3）积层胶电压宜小，90－120V，分离胶可增至120－180V。

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PBS 磷酸盐缓冲液(20×)
简介：
平衡盐溶液(Balanced Salt Solution ，BSS)与细胞生长状态下的pH 值、渗透压等环境状态一致，具有维持渗透压、控制酸碱平衡、供给细胞生存代谢所必需的能量和无机盐成分等作用，可满足体外实验中细胞生存并维持一定的代谢的基本需要。

Leagene PBS 磷酸盐缓冲液(20×)主要由磷酸氢二盐、磷酸二氢盐组成，含少量氯化钠，不含钙离子和镁离子，，主要用于免疫组化、组织切片或其他常规用途。

该试剂为20×浓缩液，应稀释为1×使用，稀释后pH 值约为7.2～7.4。

组成：
操作步骤(仅供参考)：
1、 用去离子水或蒸馏水稀释为1×使用。

注意事项：
1、 PBS 磷酸盐缓冲液由于不含有钙离子，不易产生沉淀，出现该种情况后，一般置于温浴至沉淀溶解即可, 如果产生较多沉淀应弃用。

2、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

有效期： 12个月有效。

编号 名称 IH0145 IH0145 Storage PBS 磷酸盐缓冲液(20×) 500ml 2L RT 使用说明书 1份。

分子生物学常用缓冲液、试剂和贮存液的配制1、6*Loading Buffer（DNA电泳用，50ml配方）组分浓度：100mM EDTA, 40%(V/V) 蔗糖, 0.05%（W/V）xylene cyanol FF, 0.05%（W/V）溴酚蓝配制方法：称取25mg溴酚蓝，25mg xylene cyanol FF，5ml 0.5MEDTA，加入约20ml去离子水，加热搅拌，充分溶解，加入20g蔗糖，去离子水定容至50ml。

2、10*PBS（pH7.2～7.4，分子克隆推荐配方）组分浓度：NaCl 137 mmol/L，KCl 27 mmol/L，Na2HPO4 100 mmol/L，KH2PO4 20 mmol/L配置方法：用800ml去离子水溶解80 g NaCl, 2 g KCl，14.4 g Na2HPO4和2.4 g KH2PO4。

用盐酸调节pH 至7.4，加水定容至1 L，高温高压灭菌，室温保存。

3、20*SSC （pH约7.0）组分浓度：300 mmol/L 柠檬酸三钠，3 mol/L 氯化钠配制方法：称取柠檬酸三钠·2H2O 88.23 g，氯化钠175.3 g，加入800 ml去离子水充分溶解，用14 N HCl 调pH为7.0，去离子水定容至1 L，高温高压灭菌后室温保存。

4、10*Tris-甘氨酸转膜液（pH约8.3）1 L组分浓度：0.25 M Tris，1.92 M 甘氨酸配制方法：甘氨酸144.13 g，Tris 30.29 g，去离子水溶解定容至1 L。

使用前，100 ml 10*转膜液，加入200 ml甲醇，700 ml去离子水成为1*转膜液5、10*Tris-甘氨酸-SDS 电泳缓冲液（SDS-PAGE电泳缓冲液，pH约8.6）组分浓度：0.25 M Tris，1.92 M 甘氨酸，1%（W/V）SDS配制方法：称取30.29 g Tris，,144.13 g甘氨酸，5 g SDS，加入800 ml去离子水搅拌溶解，定容至1 L，常温保存。

北京雷根生物技术有限公司
氯化铵缓冲液(0.2mol/L,pH8.0-10.0)
简介：
氯化铵(Ammonium Chloride)分子量为53.49，CAS 号为12125-02-9，化学式为NH 4Cl 。

氯化铵是一种强电解质，溶于水电离出铵根离子和氯离子，可中和酸性内膜成分,抑制神经鞘氨基的合成，具有多种用途。

氯化铵缓冲液(0.2mol/L,pH8.0-10.0)又称氨-氯化铵缓冲液，由氯化铵、氨水等组成，可根据客户需求在8.0-10.0范围内调pH 值。

组成：
操作步骤(仅供参考)：
1、 根据具体实验操作。

注意事项：
1、注意密闭保存，否则易导致pH 值发生变化。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

有效期： 12个月有效。

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编号 名称 R00940 Storage 氯化铵缓冲液(0.2mol/L,pH8.0-10.0) 500ml RT 使用说明书 1份 编号 名称
DC0032 Masson 三色染色液
NH0043 SSC 缓冲液(20×,pH7.0)
NH0053 变性鲑鱼精DNA(10mg/ml)
NR0001 DEPC 处理水(0.1%)
NR0042 RNase A(10mg/ml,DNase free)
PT0013 考马斯亮蓝快速染色液
TC0713 葡萄糖检测试剂盒(GOD-POD 比色法)。