新型复合生物乳化剂的性质及其在多环芳烃降解中的作用
- 格式：pdf
- 大小：364.41 KB
- 文档页数：5
44卷 3期2004年6月微生物学报Acta Microbiologica SinicaV ol.44June N o.32004基金项目:国家“863计划”(2002AA601150);中国科学院知识创新项目(K SCX 22SW 2113)3通讯作者。
T el :86210262554043;E 2mail :liuzhipei @作者简介:李习武(1978-),男,湖北省武汉市人,中国科学院微生物研究所2000级硕士生。
收稿日期:2003207223修回日期:2003210208新型复合生物乳化剂的性质及其在多环芳烃降解中的作用李习武 刘志培3 刘双江(中国科学院微生物研究所 北京 100080)摘 要:对一株能利用多种石油烃的Em1菌株产生的生物乳化剂,采用柱层析方法进行分离纯化,其表面活性组分存在于氯仿、甲醇、浓盐酸混合物(V ΠV ΠV =5∶1∶0101)的洗脱液中,挥发洗脱溶剂即为纯化的生物乳化剂。
该生物乳化剂可使蒸馏水的表面张力由72mN Πm 降至30mN Πm ,其临界胶团浓度(C MC )为75mg ΠL 。
它不含糖类、蛋白、中性脂、磷酸基团和α2氨基酸,采用红外光谱(IR )、气质联用(G C ΠMS )和核磁共振(NMR )测定其化学组成和结构,表明其主要由十六烷酸、脂肪醇类、酯类和脂肪酰胺类等组成,这些物质的协同作用是该生物乳化剂高表面活性的关键。
该生物乳化剂可明显促进菌株对多环芳烃的降解作用,可将降解率提高20%,其促进降解的机制主要是提高多环芳烃在水中的溶解度,平均可提高约10倍的溶解度。
关键词:石油污染,芳烃降解,生物乳化剂,协同作用中图分类号:Q93 文献标识码:A 文章编号:000126209(2004)0320373205 石油污染是我国面临的主要污染源之一,其中所含的多环芳烃(PAHs )是一类具有三致效应的有机污染物,对环境和人类健康构成极大威胁,其中多数早在1978年就被美国环保局(EPA )列为首要污染物。
因此在石油污染的治理研究中,主要集中在多环芳烃降解的研究,国外对多环芳烃的微生物降解研究起步较早,近十年来又分离出了一些新的降解菌株[1～3],并总结归纳了几种多环芳烃的降解途径[4,5]。
由于石油烃类化合物的水不溶性,限制了活性微生物与底物的作用,使得能提高石油烃类与活性微生物作用效率的生物乳化剂的研究与应用成为石油污染治理中的又一研究热点。
生物乳化剂应用于环境污染(尤其是石油污染)的生物治理,在国外已有一些成功的先例[6]。
生物乳化剂是一类由生物产生的具有表面活性的化合物,其分子结构由一个疏水部分和一个亲水部分构成,疏水部分为饱和、不饱和或羟化的烃链;亲水部分更加多样化,可简单如脂肪酸的羧基,也可复杂如糖脂的多聚糖基。
疏水部分和亲水部分的结合可通过酯键、酰胺键或糖苷键[7]。
生物乳化剂根据亲水基团的性质可分为:糖脂、脂蛋白、脂肪酸、磷脂和中性脂[8]。
生物乳化剂的表面活性作用以及对热、pH 的稳定性均与化学合成的乳化剂相当,更具有一般的化学合成乳化剂所无法媲美的优点———与环境的兼容性,即它没有毒性,并可被生物降解,不对环境造成不利的影响,因此生物乳化剂在石油开采、环境治理以及食品饮料、化妆品生产等领域具有广阔的应用前景。
但目前国内对生物乳化剂及其产生菌的研究还较少[9]。
本实验室从胜利油田土壤样品中分离得到一株能降解多种石油芳烃且能利用正十六烷为碳源产生物乳化剂的细菌Em1菌株[10],本文主要研究了该菌株所产乳化剂的化学组成和性质及其对蒽、菲、芘降解的影响。
1 材料和方法111 菌株和培养基实验所用菌株赤红球菌(Rhodococcus ruber )Em1[10]为本实验室自胜利油田原油污染土壤中分离纯化所得。
降解实验所用培养基为无机盐培养液,其组成为K 2HPO 4・3H 2O 1g ,KH 2PO 41g ,MgS O 4・7H 2O 015g ,NH 4NO 31g ,CaCl 20102g ,FeCl 301001g ,定容至1L ,初始pH 为7。
蒽、菲、芘以粉末形式直接加入培养基。
产乳化剂培养基见文献[10]。
112 菌株生长的测定菌株生长以721型分光光度计所测得的培养液在波长460nm 处的浊度表示。
113 蒽、菲、芘的测定将待测样品的pH调至2,以等体积的正己烷萃取2min,待分层后取上层有机相做HP LC。
所用的色谱柱为HP2Extender2C18反相柱,色谱条件为乙腈∶水=60∶40,流动相流速为1m LΠmin,蒽、菲、芘的监测波长分别为254nm、251nm和240nm。
根据标准曲线计算蒽、菲、芘的量。
114 表面张力的测定采用山东淄博科森公司的Auto2tensiometer Z L22型表面张力测定仪(圆环法)测定其表面张力。
115 乳化剂的分离纯化[11]将乳化剂发酵液250m L于分液漏斗中静置1h,取上层约50m L培养液以等体积的甲醇、氯仿混合物(VΠV=1∶1)萃取2min,10000rΠmin离心10min,取有机相真空抽吸使溶剂挥发,将剩余物溶于少量正己烷做柱层析。
采用<26mm×300mm的层析柱,填料为硅胶G F254,洗脱程序为:正己烷100m L→氯仿100m L→氯仿、甲醇、浓盐酸混合物(VΠVΠ=5∶1∶0101)100m L→氯仿、甲醇混合物(VΠV=5∶2)200 m L,收集4种洗脱组分,真空抽吸使溶剂挥发,分别取4种剩余物少许溶于20m L蒸馏水中至终浓度100mgΠL,测表面张力以确定有表面活性的组份。
116 生物乳化剂临界胶团浓度(CMC)的测定按参考文献[12]进行。
117 生物乳化剂化学性质的测定糖类组份的定性检测采用α2萘酚法[13];蛋白质的检测采用Brad ford法[14]。
中性脂的检测采用异羟肟酸铁试验[13]。
α2氨基酸的检测采用茚三酮法[14]。
采用Bruker T ens or27红外光谱仪溴化钾薄片法测样品的红外光谱。
气质联用所用的仪器及条件为:美国PE公司(Perkin Elmer)的TurboMass G CΠMS (气相色谱Π质谱联用仪)。
SE254石英毛细管柱,柱长30m;程序升温条件:80℃～300℃(10℃Πmin);采用Bruker DMX2300(W B)型核磁共振仪,以T MS为内标(δ=0),C DCl3作溶剂,测定样品的1H、13C核磁共振谱。
2 结果和讨论211 菌株Em1对石油烃类的降解通过正交实验试验了菌株Em1降解蒽、菲、芘的最佳条件,结果表明,在近似于最佳条件下,即底物浓度100mgΠL,摇床转速200rΠmin时培养18d,对蒽、菲、芘的降解率分别为4810%、5714%和3210%。
事实上,菌株Em1具有很广的底物降解范围,除蒽、菲、芘外,对所试验的正十六烷、苯和萘皆能降解,以上述底物为唯一碳源的无机盐培养液30℃200rΠmin下培养18d(以正十六烷为底物时培养5d)的OD460见表1。
表1 菌株Em1对石油烃的降解T able1 Biodegradation of petroleum hydrocarbonsC oncentration of ChemicalsΠ(mgΠL)Hexadacane(2000)Benzene(400)Naphthalene(300)Anthracene(100)Phenanthrene(100)Pyrene(100)OD460012801150117011201070107212 乳化剂的分离纯化和CMC测定通过柱层析分离纯化可以获得4种不同的组分,测定4种组份的表面活性,结果表明,表面活性物质存在于氯仿、甲醇、浓盐酸混合物(VΠVΠV=5∶1∶0101)的洗脱液中,挥发洗脱剂,得到纯化的生物乳化剂。
该乳化剂可使蒸馏水的表面张力由72mNΠm 下降至约30mNΠm,经测定,其C MC为75mgΠL,远低于一般化学合成表面活性剂,如T ween20的C MC为600mgΠL;在生物乳化剂中也是比较低的[15]。
213 乳化剂化学性质和结构的测定生物乳化剂的α2萘酚试验、Brad ford试验、异羟肟酸铁试验及茚三酮试验结果皆为阴性,说明生物乳化剂中不含糖类、蛋白、中性脂类和α2氨基酸,其红外吸收光谱结果见图1,在721140cm-1[(-CH2图1 生物乳化剂的红外吸收图谱Fig.1 In frared spectra of the bioemulsifier-)n]、1114149cm-1(-C-OH)、1169115cm-1(-C -C-)、1375175cm-1、1463119cm-1、2853178cm-1、2924107cm-1(-C-H)、1744138cm-1(-C=O)、473微 生 物 学 报44卷 3286135cm -1(-NH )等处有相应基团的吸收峰,但并无磷酸基团的相应吸收峰,说明该乳化剂不含磷脂。
现今发现的生物乳化剂根据亲水基团的性质可分为:糖脂、脂蛋白、脂肪酸、磷脂和中性脂,故推测生物乳化剂中有表面活性的物质应为脂肪酸。
生物乳化剂的气质联用气相色谱图如图2所示。
质谱结果表明,十六烷为底物在经过Em1菌株的作用下,形成了不同的产物。
在16189min 处的物质为十六烷酸,在生物乳化剂中所占比重也较大,然而纯十六烷酸只能使水的表面张力下降至5316mN Πm ,远远高于生物乳化剂的30mN Πm ,其余在11108min 、11130min 、12135min 、12197min 、14162min 、15143min 等处的物质为烷烃或脂肪醇类,不具有表面活性,15179min 和17124min 处的物质为酯类,但在生物乳化剂中所占比重较小。
生物乳化剂的核磁共振1H 谱结果见图3。
1H :01878mg ΠL (-CH 3),11255mg ΠL [(-CH 2-)n ],11606mg ΠL (-CH 2-),21317mg ΠL (-CH 2C O ),31389mg ΠL (-CH 2-),41142mg ΠL (-NH or -OH )。
该结果与红外及气质联用结果也是一致的,说明在生物乳化剂的混合物中,主要组分为烷烃、脂肪醇类和脂肪酸,还含有酯类和脂肪酰胺。
根据以上实验结果,Em1菌株产生的生物乳化剂为多组份的生物乳化剂,其有效成分主要为十六烷酸、脂肪醇类、酯类和脂肪酰胺等,是这些组份的协同作用表现出很强的表面活性。
不同系组分的协同作用在化学合成的表面活性剂中早有报道,如C 8H 17S O 4Na 2C 8H 17OH 体系(9∶1)水溶液的表面张力可降至22mN Πm[16],而C 8H 17OH 饱和水溶液的表面张力及C 8H 17S O 4Na 水溶液的最低表面张力皆高于30mN Πm 。
