卵形鲳鲹PPARα基因cDNA序列的克隆、组织表达及生物信息学分析

卵形鲳鲹一例疑似神经性病毒病的初步分析蔡小辉;文雪;徐力文;贾友宏;梁志辉;王志成【期刊名称】《水产科学》【年(卷),期】2012(031)010【摘要】对疑患病毒性神经坏死症、身体失去平衡、漂浮水面螺旋状游泳、体色发黑、大规模死亡的海水网箱养殖卵形鲳鲹幼鱼,采用组织病理切片观察和分子生物学技术对其病原进行初步分析和跟踪调查.组织病理学结果显示,病鱼脑和眼均呈现神经坏死病毒典型的空泡化现象；利用神经坏死病毒特异性引物nest-PCR检测发现,病鱼一扩阳性率100％,摄食游泳正常鱼一扩和二扩阳性率均为46.67％,显示港区苗种多自身携带病毒株；序列比对显示该病毒株属于赤点石斑神经坏死病毒基因型；对神经坏死病毒跟踪发现,成鱼一扩均为阴性,二扩阳性率则高达86.7％.初步认为,外界因子可能作为诱导因子,致使本身携带病毒鱼苗免疫降低致使此次流行病爆发,且神经坏死病毒潜伏于鱼体的时间较长.【总页数】5页(P597-601)【作者】蔡小辉;文雪;徐力文;贾友宏;梁志辉;王志成【作者单位】广西海洋研究所广西海洋生物技术重点实验室,广西北海 536000;广西海洋研究所广西海洋生物技术重点实验室,广西北海 536000;中国水产科学研究院南海水产研究所,广东广州 510300;北海市正泰珍珠研究所,广西北海536000;广西海洋研究所广西海洋生物技术重点实验室,广西北海 536000;广西海洋研究所广西海洋生物技术重点实验室,广西北海 536000【正文语种】中文【中图分类】S943【相关文献】1.一例疑似犬细小病毒病的诊治体会 [J], 袁发明;严得宝;张成涛2.一例疑似猪圆环病毒病与猪蓝耳病混合感染的诊疗体会 [J], 徐卫青;雷胜辉;李金龙;齐新永;吴昊旻3.一例疑似鹅细小病毒病的诊断和治疗 [J], 李金龙; 陈丽艳; 高敬昕4.一例疑似白鸭呼肠孤病毒病的临床诊治 [J], 莫志莲5.一例疑似鹅副黏病毒病的诊断与治疗 [J], 张美良;陈建荪因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

卵形鲳鲹组织蛋白酶L基因的克隆及其表达分析作者：侯树鉴黎江胡舒何肇强廖永岩朱鹏陆专灵韦友传来源：《南方农业学报》2018年第06期摘要：【目的】明確卵形鲳鲹组织蛋白酶L基因（TroCatL）的遗传进化规律及其组织表达水平，为研究CatL生物学功能及其对病原的抗病机理提供理论依据。

【方法】应用RT-PCR和RACE技术克隆TroCatL基因全长cDNA，采用生物信息学方法对其序列特征进行分析；并以实时荧光定量PCR（qPCR）检测TroCatL基因在健康组织中的表达情况及其表达与溶藻弧菌感染的关联性。

【结果】TroCatL基因全长cDNA为1492 bp（GenBank登录号MH036350），包括开放阅读框（ORF）1011 bp、5'端非翻译区（5'-UTR）120 bp和3'端非翻译区（3'-UTR）361 bp。

TroCatL基因编码336个氨基酸残基，其理论等电点（pI）5.7，预测分子质量37.93 kD，且存在CatL特有的保守结构域（ERFNIN、GNFD和GCXGG基序）及由139Cys、279His和303Asn组成的半胱氨酸蛋白酶保守活性位点。

TroCatL氨基酸序列与其他鱼类CatL氨基酸序列的同源性高达83.9%～95.2%，尤其与鲈形目鰤鱼的亲缘关系最近。

TroCatL基因mRNA在健康卵形鲳鲹组织中均有表达，以在肝脏中的表达最高，在脑组织中的表达最低。

经溶藻弧菌感染后，TroCatL基因mRNA在肝脏、脾脏和血液中的表达水平均上调，肝脏和脾脏中的TroCatL基因mRNA在攻毒后24 h达峰值，血液中的TroCatL基因mRNA在感染后12 h达最高值。

【结论】TroCatL蛋白结构域及其催化活性位点在遗传进化过程中较保守，通过参与机体的免疫应答反应，在卵形鲳鲹抵御细菌或病毒侵染的过程中扮演重要角色。

关键词：卵形鲳鲹；组织蛋白酶L（CatL）；溶藻弧菌；克隆；表达分析中图分类号： S965.331 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）06-1215-08Abstract：【Objective】The aim of the study was to definite genetic evolution rule and tissue expression level of cathepsin L gene in Trachinotus ovatus（TroCatL）， provide theoretical basis for researching biological function and disease resistant mechanism of CatL. 【Method】The full length cDNA sequence of TroCatL were cloned by using RT-PCR and RACE technology， and the sequence features were analyzed by using bioinformatics methods. Real-time fluorescence quantitative PCR（qPCR） was used to detect the expression of TroCatL gene in healthy tissues and its correlation with Vibrio alginolyticus infection. 【Result】The full length of TroCatL cDNA was 1492 bp（GenBank accession number：MH036350）， including a 1011 bp open reading frame （ORF）， a 120 bp 5' untranslated region（5'-UTR） and a 361 bp 3' untranslated region（3'-UTR）. The TroCatL gene encoding 336 amino acid residues with theoretical isoelectric point（pI）of 5.7 and predicted molecular weight of 37.93 kD. It contained conservative domain structure （ERFNIN， GNFD and GCXGG motifs）， and a cysteine protease active site formed by139Cys， 279His and 303Asn. The amino acid sequences of TroCatL shared 83.9%-95.2% homology with CatL amino acids of other fish species， especially sharing the closest relative relationship with Seriola dumerili. TroCatL mRNA were expressed in all detected tissues from healthy T. ovatus while the highest level was in liver and the lowest was in brain. TroCatL mRNA were significantly up-regulated in liver， spleen and blood after being infected by V. alginolyticus. TroCatL mRNA in liver and spleen reached the peak value 24 h post infection， while that in blood reached the peak value 12 h post infection. 【Conclusion】TroCatL protein domains and catalytic active sites are evolutionarily conserved in T. ovatus， and play an important role in against of bacteria or virus infection by participating in host immune response.Key words： Trachinotus ovatus； cathepsin L（CatL）； Vibrio alginolyticus； clone；expression analysis0 引言【研究意义】组织蛋白酶L（Cathepsin L，CatL）是半胱氨酸蛋白酶中木瓜蛋白酶C1家族的主要成员，是一种重要的溶酶体半胱氨酸蛋白内肽酶，广泛存在于动植物体内，具有蛋白水解酶活性（Barrett and Rawlings，2001；杨东辉等，2012）。

卵形鲳鲹生肌调节因子基因家族的鉴定及在胚胎中的表达余艳玲;罗洪林;罗辉;冯鹏霏;潘传燕;宋漫玲;肖蕊;张永德【期刊名称】《浙江农业学报》【年(卷),期】2022(34)4【摘要】为研究卵形鲳鲹生肌调节因子(MRF)在胚胎发育中所发挥的重要作用,对卵形鲳鲹MRF基因家族进行了全基因组鉴定和生物信息学分析,并对其在13个胚胎发育阶段的基因表达进行了定量分析。

结果表明:在卵形鲳鲹基因组中共鉴定出5个MRF基因家族成员:MyoD1、MyoD2、Myf5、Myf6和MyoG,分别编码297、263、240、231、250个氨基酸。

MRF家族基因存在典型的BASIC与HLH结构域,其中MyoD1、MyoD2与MyoG分别定位于9号、1号与2号染色体,而Myf5与Myf6基因均定位于22号染色体且位于同一基因座。

MRF家族基因胚胎定量表达研究表明,MyoG在受精卵到胚体形成期表达量极低,在眼囊、耳囊与心脏跳动期表达量迅速升高,而到晶体出现期表达量又有所降低,推测其可能在眼囊、耳囊与心脏跳动期发挥主要的生肌调节作用,而后期在维持肌肉形态或肌肉发育中仍发挥重要作用。

MyoD1、MyoD2、Myf5与Myf6在受精卵到原肠中期表达量较低,而从原肠末期到晶体出现期表达量迅速升高(P<0.05),表明其主要从原肠末期开始发挥生肌调控作用。

结果表明,MRF家族成员在胚胎发育过程中发挥重要的作用,但不同的MRF家族成员发挥作用的时间及功能可能不同。

【总页数】11页(P695-705)【作者】余艳玲;罗洪林;罗辉;冯鹏霏;潘传燕;宋漫玲;肖蕊;张永德【作者单位】广西水产科学研究院广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室;西南大学动物科学学院【正文语种】中文【中图分类】S917.4【相关文献】1.鳜鱼生肌调节因子基因(mrf4)的克隆及其在成鱼和胚胎中的表达2.生肌调节因子在绵羊不同胎儿期心肌和骨骼肌中的表达3.卵形鲳鲹Myostatin基因克隆及其在胚胎发育中的表达分析4.二花脸猪和大白猪背最长肌中肌肉生长抑制素和生肌调节因子基因的表达及其性别特点5.五指山猪不同组织中肌细胞生成素基因Myf4及生肌调节因子Myf6的表达因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

银鲳ERα基因片段的克隆及卵黄发生期间饲料n-3LC-PUFA对其组织表达的影响彭士明;李云莉;高权新;施兆鸿;张晨捷;王建钢【摘要】本研究克隆获得银鲳(Pampus argenteus)雌激素受体α(estrogen receptorα,ERα)基因的部分cDNA序列,长度196 bp,编码65个氨基酸.经BLAST 比对,与其它鱼类ERα基因序列的一致性在89％～93％之间,证明实验所得序列为银鲳ERα基因的部分片段.以1年龄雌性银鲳为实验对象,配制了4组等氮、等能及等脂的实验饲料,分别以100％鱼油(FO组)、70％鱼油和30％大豆油(FSO组)、30％鱼油和70％大豆油(SFO组)、100％大豆油(SO组)为脂肪源,研究银鲳在卵黄发生期间组织中ERα基因表达量的变化以及饲料n-3LC-PUFA对其组织表达的影响,实验周期185 d.结果表明,在卵黄发生中期与后期,肝脏与卵巢中ERα基因表达量均显著高于卵黄发生前期(P＜0.05);卵黄发生后期肝脏组织中ERα基因表达量虽较卵黄发生中期呈升高趋势,但除了SO组之外,两者之间无显著性差异(P＞0.05);而卵巢组织中ERα基因表达量在整个卵黄发生期间均呈现显著升高趋势(P＜0.05).饲料n-3LC-PUFA对肝脏与卵巢ERα基因表达量的影响在卵黄发生前期均未表现出明显的组间差异,但在卵黄发生中期与后期,饲料中较高的n-3LC-PUFA含量显著提高了组织中ERα基因表达量.在卵黄发生中期与后期,FO与FSO组肝脏与卵巢组织中ERα基因表达量均分别显著高于SO组(P＜0.05).双因素方差分析结果表明,饲料n-3LC-PUFA与卵黄发生时期对银鲳组织中ERα基因表达量均具有显著性影响,且两者对组织中ERα基因表达量存在显著性的交互作用.【期刊名称】《海洋渔业》【年(卷),期】2016(038)002【总页数】9页(P157-165)【关键词】银鲳;雌激素受体α;卵黄发生;n-3LC-PUFA;基因表达【作者】彭士明;李云莉;高权新;施兆鸿;张晨捷;王建钢【作者单位】中国水产科学研究院东海水产研究所,上海 200090;中国水产科学研究院东海水产研究所,上海 200090;上海海洋大学水产与生命学院,上海 201306;中国水产科学研究院东海水产研究所,上海 200090;中国水产科学研究院东海水产研究所,上海 200090;中国水产科学研究院东海水产研究所,上海 200090;中国水产科学研究院东海水产研究所,上海 200090【正文语种】中文【中图分类】S968.1雌二醇（E2）是影响鱼类卵巢发育、成熟及排卵的一种重要的性类固醇激素[1]。

大黄鱼PPAR β全长cDNA的克隆和组织表达钱伦;钱云霞;童丽娟【摘要】利用RT-PCR和SMART RACE的方法从大黄鱼肝脏中克隆了PPAR β全长cDNA.该序列长3390bp,5'端非翻译区146bp,3'端非翻译区1711bp,开放阅读框1533bp,可编码一个由510个氨基酸组成的蛋白质,该蛋白质分子量为57.2kDa、等电点为6.46.氨基酸序列分析表明,PPAR B基因具有较高的保守性,大黄鱼PPAR B与花鲈、金头鲷、欧鲽、大西洋鲑、红鳍东方纯、人、黑猩猩、牛、兔及小鼠等10个物种的同源性为72%～91%,其中与花鲈同源性最高,为91%.用RT-PCR法检测PPAR β基因的组织表达,结果表明该基因在大黄鱼肌肉、眼、脾、肾、肝、鳃、心、肠和脑等9个组织中均有表达,其中肝脏组织表达量最大,肌肉最少.【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2010(027)006【总页数】4页(P1-4)【关键词】大黄鱼;PPAR β;克隆;组织表达【作者】钱伦;钱云霞;童丽娟【作者单位】宁波大学生命科学与生物工程学院,浙江,宁波,315211;宁波大学生命科学与生物工程学院,浙江,宁波,315211;宁波大学生命科学与生物工程学院,浙江,宁波,315211【正文语种】中文【中图分类】Q786PPAR(peroxisome proliferator-activated receptor),即过氧化物酶体增殖剂激活受体,是一类由配体激活的核转录因子,属Ⅱ型核受体家族成员。

PPAR最早由Issemann发现于爪蟾 (Xenopus laevis),接着在小鼠 (M us musculus)中成功克隆到了PPARα基因[1]。

在哺乳动物、鸟类、两栖动物、鱼类中发现 PPAR存在3种亚型,即PPARα、PPARβ(也称PPARδ)和PPARγ。

近年来,在人等哺乳动物中研究发现,PPAR参与机体多种生理和病理过程,尤其和脂代谢有十分密切的关系。

卵形鲳鲹生长抑素家族基因的全基因组鉴定及组织表达特征分析作者：余艳玲冯鹏霏潘传燕林勇宋漫玲张永德罗洪林来源：《南方农业学报》2021年第12期摘要：【目的】明确卵形鲳鲹生长抑素（SST）家族基因的种类及其组织表达特征，为进一步揭示SST家族基因在其生长发育过程中的作用机制打下基础。

【方法】采用HMMER 3.1对卵形鲳鲹全基因组数据进行搜索，然后通过Pfam、SMART及NCBI CDD等数据库确认搜索获得的基因是否属于SST家族基因;采用ProtParam和PSORT等在线软件进行生物信息学分析，并以实时荧光定量PCR检测SST家族基因在卵形鲳鲹不同组织中的表达情况。

【结果】从卵形鲳鲹全基因组中共鉴定出4个SST家族基因（SST1、SST3、SST5和SST6），分别编码122、127、106和110个氨基酸残基，对应的编码蛋白分子量介于12249.3～14316.1 Da，理论等电点（pI）介于6.51～7.43，均定位于细胞外。

4个卵形鲳鲹SST基因结构较简单且相似，均包含2个外显子和1个内含子;SST1和SST3基因位于7号染色体上，SST6和SST5基因则分别位于8号和23号染色体上;4个卵形鲳鲹SST氨基酸序列相似性的平均值为33.42%，以SST5氨基酸序列与SST6氨基酸序列的相似性最高（39.78%），SST3氨基酸序列与SST5氨基酸序列的相似性最低（28.16%）。

SST家族基因在卵形鲳鲹脑、胃、性腺和肌肉等组织中均有不同程度的表达，SST1、SST3和SST6基因在脑组织中显著高表达（P<0.05，下同），而SST5基因在性腺和肌肉组织中显著高表达;此外，SST3、SST5和SST6基因在卵形鲳鲹卵巢中的相对表达量均显著高于在精巢中的相對表达量。

【结论】从卵形鲳鲹基因组中鉴定出4个SST家族基因（SST1、SST3、SST5和SST6），其表达分布存在组织特异性和种属特异性，可能介导卵形鲳鲹的神经调节、性腺发育及性二型性等多种生理功能，且不同物种的SST 基因功能可能存在差异。

第39卷㊀第1期2021年1月㊀㊀㊀㊀广西师范大学学报(自然科学版)Journal of Guangxi Normal University(Natural Science Edition)㊀㊀㊀㊀㊀㊀Vol.39㊀No.1Jan.2021DOI:10.16088/j.issn.1001-6600.2020042602 罗洪林,冯鹏霏,余艳玲,等.卵形鲳鲹Myostatin基因克隆及其在胚胎发育中的表达分析[J].广西师范大学学报(自然科学版),2021,39 (1):136-147.LUO H L,FENG P F,YU Y L,et al.Molecular cloning of the myostatin gene and its expression during embryo development of Trachinotus ovatus[J].Journal of Guangxi Normal University(Natural Science Edition),2021,39(1):136-147.卵形鲳鲹Myostatin基因克隆及其在胚胎发育中的表达分析罗洪林,冯鹏霏,余艳玲,肖㊀蕊,潘传燕,宋漫玲,张永德∗(广西水产科学研究院广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室,广西南宁530021)摘㊀要:为研究肌生长抑制素(myostatin,MSTN)在卵形鲳鲹胚胎发育过程中的表达,对卵形鲳鲹MSTN基因CDS区进行克隆与分析,并对其14个胚胎发育阶段的表达量进行研究㊂结果显示:克隆获得MSTN基因1322bp序列㊂该序列编码376个氨基酸,相对分子质量为42694.85u,理论等电点pI为5.52,为带负电的蛋白㊂MSTN蛋白质不存在跨膜结构域,亚细胞定位主要于细胞外部,可能属于分泌蛋白质,易于表达和纯化㊂MSTN蛋白质无信号肽序列,预测含有17个磷酸化位点㊂对24种鱼类MSTN基因序列的同源分析发现:卵形鲳鲹MSTN与布氏鲳鲹同源性最高,与黄尾鰤同源性次之; 3种鱼类均属鲹科Carangidae,而鲹科鱼类与锯盖鱼科Centropomidae鱼类遗传距离最小,具有较近的亲缘关系㊂MSTN基因在卵形鲳鲹从受精卵到晶体出现期的13个阶段均表达量极低或不表达,组间差异不显著(P>0.05),而在初孵仔鱼期表达量迅速升高,极显著高于前13个时期(P<0.01)㊂MSTN基因可能在卵形鲳鲹孵化后发挥重要作用,而在孵化前作用微弱㊂关键词:卵形鲳鲹;MSTN;基因克隆;胚胎组织;生物信息学分析中图分类号:S965.331㊀㊀㊀文献标志码:A㊀㊀㊀文章编号:1001-6600(2021)01-0136-12卵形鲳鲹Trachinotus ovatus又称金鲳鱼,为暖水性中上层鱼类,主要分布于印度洋㊁太平洋㊁大西洋,以及非洲沿岸的热带和亚热带水域,在我国南海㊁东海和黄海均有分布[1-2],为我国华南地区养殖规模最大的品种之一㊂卵形鲳鲹属高蛋白低脂肪鱼类,富含多种蛋白质及其他营养成分[3],因其生长速度快㊁饲料转化率高等特点,成为我国海水集约化养殖的优势选择㊂目前关于卵形鲳鲹的研究主要集中在基础生物学㊁良种选育㊁饲料及营养㊁生长发育等方面[4],遗传育种的相关研究则较少㊂遗传育种工作的滞后,导致近些年出现了种质退化的现象,因此,急需开展卵形鲳鲹种质资源多样性及遗传育种等相关研究㊂肌生长抑制素(myostatin,MSTN)是肌肉生长的负调节剂,属于转化生长因子β(TGF-β)超家族,并包含TGF-β前肽域和TGFB域,它们通过抑制成肌细胞增殖发挥作用[5]㊂MSTN在拮抗出生后肌肉生长方面起着进化上保守的作用,限制了单个肌纤维的数量和大小,而MSTN突变会导致肌细胞增生㊁肌纤维肥大[6]㊂在许多哺乳动物和鱼类中,MSTN基因的破坏或MSTN蛋白质的靶向抑制可触发超肌肉表型[7-8]㊂Lin等[9]发现敲除小鼠MSTN基因能够增殖肌肉细胞,促进骨骼肌的增重㊂MSTN基因在鱼类中的表达模式与哺乳动物不同,但与其他无脊椎动物类似,在肌肉㊁鳃㊁肾脏㊁肝脏㊁脑及性腺等组织中均有表达[10]㊂有研究显示,通过基因编辑技术抑制MSTN基因负调节作用,可使鱼类的肌肉含量增加[11-12],进而提高肉产量和经济效益㊂因此MSTN基因已被选作一些鱼类遗传改良的候选基因[9]㊂分析MSTN基因在鱼类育种中的作用,对鱼类的良种选育具有重要作用㊂尽管MSTN的研究在硬骨鱼类的研究中已取得一定成果[13],但在鲹科鱼类中还未见相关报道㊂奥尼罗非鱼Oreochromis aureus O.niloticus[14]㊁鲤鱼Cyprinus收稿日期:2020-04-26㊀修回日期:2020-05-25基金项目:广西创新驱动发展专项资金项目(桂科AA17204080-3,桂科AA18242031-2);广西水产遗传育种与健康水产养殖重点实验室系统性课题(19-A-01-05)通信作者:张永德(1977 ),男,山东潍坊人,广西水产科学研究院副研究员㊂E-mail:**************731carpio[15]㊁鲆鲽鱼类(Flounder fish)[16]等的MSTN的cDNA全长序列或开放阅读框都已被克隆出,与其他无脊椎动物类动物类似;硬骨鱼类MSTN氨基酸序列都具有信号肽序列及保守的半胱氨酸残基等特征,与在哺乳动物中的表达模式不同[17];而MSTN在硬骨鱼类的各组织中都有广泛表达,暗示MSTN的生物学功能具有多样性,其表达量受多种因素影响[18]㊂本研究选择我国南海㊁东海和黄海分布广泛的卵形鲳鲹作为研究对象,筛选㊁克隆其MSTN基因的完整编码区序列,并研究其在胚胎发育早期不同阶段的表达,拟为今后研究MSTN基因的表达规律提供基础资料,也为进一步分析卵形鲳鲹的肌肉生长规律提供数据支撑㊂1㊀材料与方法1.1㊀实验材料本实验选用性成熟的卵形鲳鲹,取自深圳市南澳镇大鹏湾海域人工养殖群体,体质量6.2~7.8kg㊂实验前将雌雄卵形鲳鲹进行人工催产,自然交配产卵㊂待其产卵受精后,将受精卵收集置于1000L的孵化桶孵化㊂显微镜观察确定胚胎所处的发育阶段(参考区又君等[19]关于卵形鲳鲹胚胎发育的分期),收集受精卵(OSP)㊁4细胞期(4-Cell)㊁16细胞期(16-Cell)㊁多细胞期(MS)㊁高囊胚期(HBS)㊁原肠早期(EGS)㊁原肠中期(MGS)㊁原肠末期(LGS)㊁胚体形成期(EFS)㊁眼囊期(OPVS)㊁耳囊期(OtVS)㊁心脏跳动期(HPS)㊁晶体出现期(FELS)与初孵仔鱼期(NHLS)共14个时期的样品,液氮速冻保存以备用㊂1.2㊀实验方法1.2.1㊀总RNA提取及反转录卵形鲳鲹总RNA按照天根生物RNAsimple提取试剂盒的操作说明进行提取,通过2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整度,采用NanoDrop One检测RNA的浓度㊂对完整性较好的RNA,根据南京诺唯赞Hiscript III反转录试剂盒进行反转录,合成cDNA第一链,-80ħ保存备用㊂1.2.2㊀MSTN基因的克隆根据本实验室转录组测序所得的MSTN序列片段,采用Primer5.0软件设计特异性引物1对,引物序列见表1,预计扩增片段大小为1362bp㊂以合成的cDNA为模板对卵形鲳鲹MSTN基因进行扩增㊂PCR 反应程序为:95ħ预变性3min;95ħ30s,58ħ30s,72ħ100s,30个循环;72ħ延伸5min㊂扩增片段采用2%琼脂糖凝胶电泳检测,对目的条带进行切胶回收,送至英潍捷基(上海)贸易有限公司测序㊂表1㊀卵形鲳鲹MSTN和18S基因的qPCR引物信息Tab.1㊀PCR primers used for T.ovatus MSTN and18S genes qPCR引物名称引物序列(5ᶄ-3ᶄ)用㊀途MSTN CAGTCCAGTCACGCATTAGGTTGTGGCCTCTACTCTGGTTCT基因克隆MSTN GACGGGAACAGGCACATACGGCAGCCACACGGTCAACACT qPCR18S GACTCGGGGAGGTAGTGACGAGATACGCTATTGGAGCTGGAA内参基因1.2.3㊀MSTN基因的生物信息学分析利用ORFfinder对MSTN基因进行开放阅读框及氨基酸预测分析;采用DNASTAR对MSTN蛋白质的亲水性㊁抗原指数等作预测分析;蛋白质结构域采用Interpro预测;二级结构采用NetSurfP2.0预测,三级结构采用SWISS-MODEL进行预测并构建模型,采用SAVES5.0对构建的模型进行评估;蛋白质特性采用Protparam分析;跨膜结构采用TMHMM分析;信号肽采用SignalP分析;磷酸化位点采用NetPhos2.0分析;亚细胞定位采用PSORT预测;NCBI BLAST进行同源序列查找,Mega X进行序列比对及ML系统进化树分析,部分在线软件信息见表2㊂831广西师范大学学报(自然科学版),2021,39(1)表2㊀分析MSTN基因序列所用的生物信息学方法Tab.2㊀Bioinformatics methods for analyzing MSTN gene sequences分析内容软件软件网址开放阅读框ORFfinder https:///orffinder 亲水性㊁抗原指数DNASTAR https:///software/蛋白质结构域Interpro /interpro/二级结构NetSurfP2.0https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetSurfP-2.0三级结构SWISS-MODEL https:///interactive3D模型评估SAVES5.0/SAVES/蛋白质特性Protparam https:///protparam跨膜结构TMHMM http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/信号肽SignalP http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP磷酸化位点NetPhos2.0http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos-2.0/亚细胞定位PSORT http://psort1.hgc.jp/form.html同源序列查找NCBI BLAST https:///Blast.cgi1.2.4㊀MSTN基因序列同源性分析采用Mega X软件,以斑马鱼Danio rerio为外群,将卵形鲳鲹MSTN基因序列与其他22种鱼类的代表性序列进行比对分析(表3),计算遗传距离,构建ML系统聚类树,采用Jones-Taylor-Thornton(JTT)模型,对空位采用完全删除(complete deletion),并用 bootstrap 1000次自举检测表明各分支的置信度㊂1.2.5㊀MSTN在不同胚胎发育阶段的表达采用Trizol法提取14个时期的总RNA,对卵形鲳鲹14个胚胎发育时期的MSTN基因表达情况进行荧光定量检测㊂反转录合成cDNA模板后用于qPCR定量分析㊂根据卵形鲳鲹MSTN基因序列设计荧光定量PCR引物1对,以18S为内参基因(见表1)㊂反应体系为15μL,其中ddH2O6.0μL,ChamQ SYBR qPCR Master Mix(南京诺唯赞)7.5μL,上下游引物(10μmol/L)共0.3μL,cDNA模板1.2μL,每个样品设3个重复㊂MSTN基因的表达量采用相对Ct法(2-ΔΔCt)进行统计分析㊂表3㊀24种鱼类的MSTN基因信息Tab.3㊀MSTN gene information of24fish species序号GenBank号拉丁名中文名分类1∗Trachinotus ovatus卵形鲳鲹Carangaria/Carangiformes/Carangidae2AZQ19980.1Seriola lalandi dorsalis黄尾鰤Carangaria/Carangiformes/Carangidae3AYA21607.1Trachinotus blochii布氏鲳鲹Carangaria/Carangiformes/Carangidae4ABS19668.1Lates niloticus尼罗尖吻鲈Carangaria/Carangaria incertae sedis/Centropomidae 5ABS19667.1Lates calcarifer尖吻鲈Carangaria/Carangaria incertae sedis/Centropomidae 6ABD65405.1Paralichthys olivaceus牙鲆Carangaria/Pleuronectiformes/Pleuronectoidei 7ABU25350.1Kareius bicoloratus石鲽鱼Carangaria/Pleuronectiformes/Pleuronectoidei 8ABU25351.1Scophthalmus maximus大菱鲆Carangaria/Pleuronectiformes/Pleuronectoidei 9QID21533.1Mastacembelus armatus大刺鳅Anabantaria/Synbranchiformes/Mastacembelidae 10AFZ84685.1Lutjanus guttatus墨西哥笛鲷Eupercaria/Lutjaniformes/Lutjanidae11AFD54426.1Lutjanus russellii勒氏笛鲷Eupercaria/Lutjaniformes/Lutjanidae931续表3序号GenBank号拉丁名中文名分类12AAW29442.1Dicentrarchus labrax欧洲海鲈鱼Eupercaria/Moronidae/Dicentrarchus.13AAK67983.1Morone saxatilis条纹鲈Eupercaria/Moronidae/Morone14AAX82169.1Lateolabrax japonicus七星鲈Eupercaria/Pempheriformes/Lateolabracidae 15ACZ65315.1Trachidermus fasciatus松江鲈鱼Eupercaria/Perciformes/Cottioidei16AEZ53141.1Epinephelus lanceolatus鞍带石斑鱼Eupercaria/Perciformes/Serranoidei17AMR58928.1Epinephelus coioides点带石斑鱼Eupercaria/Perciformes/Serranoidei18AAX73250.1Atractoscion nobilis锤形石首鱼Eupercaria/Sciaenidae/Atractoscion19ABH85412.1Sciaenops ocellatus美国红鱼Eupercaria/Sciaenidae/Sciaenops20ABB54495.1Acanthopagrus schlegelii黑棘鲷Eupercaria/Spariformes/Sparidae21AAX82170.1Pagrus major真鲷Eupercaria/Spariformes/Sparidae22AKJ85728.1Scomberomorus niphonius蓝点马鲛Pelagiaria/Scombriformes/Scombridae23AIT97359.1Pampus argenteus银鲳Pelagiaria/Scombriformes/Stromateidae24AAP13068.1Danio rerio斑马鱼Neopterygii/cypriniformes/Cyprinidae㊀㊀注:∗表示此序列尚未提交到GenBank,故无GenBank号㊂1.2.6㊀统计分析运用统计学软件SPSS19.0进行相对独立的单因素方差分析(ANOVA),并进行Duncan s多重比较分析各组织间的差异显著性(P<0.05为差异显著),结果表示为平均值ʃ标准差(xʃSD)㊂2㊀结果与分析2.1㊀MSTN基因克隆与测序本研究通过PCR克隆获得一长度为1322bp的卵形鲳鲹MSTN cDNA序列片段,经切胶回收与纯化,将所测序列与同源物种进行序列比对,确定该序列为MSTN基因序列㊂该序列A㊁C㊁G㊁T含量分别为25.05%(354个)㊁27.32%(386个)㊁26.75%(378个)㊁20.88%(295个),GC含量(54.07%)高于AT含量(45.93%),说明编码区的DNA双链较为稳定㊂详见图1㊂2.2㊀MSTN蛋白质基本特性分析利用在线程序ORFfinder对序列进行分析,该基因CDS为1131bp,编码376个氨基酸㊂蛋白质序列经Protparam分析,结果发现:该蛋白质相对分子质量为42694.85u,理论等电点pI为5.52,带负电荷的残基总数(Asp+Glu)为50,带正电荷的残基总数(Arg+Lys)为42,说明MSTN蛋白质为带负电的蛋白质㊂不稳定性指数(II)为58.05,说明该蛋白质稳定性较差㊂2.3㊀MSTN蛋白质疏水性及跨膜区分析亲/疏水性预测结果显示,MSTN蛋白质平均亲水系数(GRAVY)为-0.410,说明该蛋白质为亲水性蛋白质㊂序列中含有较多的亲水性氨基酸,亲水性区段主要集中于21~53㊁65~74㊁97~116㊁128~138㊁145~ 153㊁180~190㊁243~251㊁254~284㊁299~338和352~362位氨基酸(图2)㊂疏水性氨基酸色氨酸Trp㊁苯丙氨酸Phe㊁缬氨酸Val㊁亮氨酸Leu㊁异亮氨酸Ile㊁丙氨酸Ala和甲硫氨酸Met分别占编码氨基酸的1.6%㊁2.7%㊁6.9%㊁8.0%㊁6.4%㊁5.3%和3.5%㊂跨膜区分析结果(图3)显示,MSTN蛋白质不存在跨膜结构域㊂MSTN的1~376位氨基酸均位于细胞膜的外表面,与该蛋白质的疏水性分析结果基本一致㊂041广西师范大学学报(自然科学版),2021,39(1)彩色显示的核酸与对应的氨基酸为MSTN基因的cDNA序列,不同颜色主要用于区分不同的核酸与氨基酸㊂图1㊀卵形鲳鲹MSTN基因序列ovatusFig.1㊀MSTN gene sequence of T.图2㊀卵形鲳鲹MSTN蛋白质的亲/疏水性预测分析Fig.2㊀Prediction analysis of hydrophilicity/hydrophobicity of T.ovatus MSTN protein 图3㊀卵形鲳鲹MSTN 蛋白质跨膜区预测分析Fig.3㊀Prediction and analysis of transmembrane region of MSTN protein in T.ovatus2.4㊀MSTN 蛋白质抗原性及亚细胞定位分析采用Protean 中的Jameson-Wolf 方法预测MSTN 蛋白质抗原指数,了解其可能的抗原表位位点㊂由图4可看出,MSTN 蛋白质全长序列中具有较丰富且分布均匀的潜在抗原表位位点,其中抗原指数较高的区段为第1~14㊁16~38㊁44~53㊁65~92㊁125~132㊁146~158㊁160~173㊁175~184㊁203~211㊁213~228㊁230~251㊁256~270㊁323~331㊁381~396㊁429~443㊁445~462㊁470~480和492~501位氨基酸㊂这些位点除了抗原指数较高外,多数具备较强的亲水性,因此采用MSTN 蛋白质制备抗体具有较强的可行性㊂利用PSORT 对MSTN 亚细胞定位进行预测分析,发现细胞外部(outside)占0.820;内质网(膜)为0.100,内质网(腔)0.100,微体(过氧化物酶体)0.100,由此推测MSTN 蛋白质可能在细胞外部发挥作用㊂图4㊀卵形鲳鲹MSTN 蛋白质分子的抗原性分析Fig.4㊀Antigenicity of MSTN protein of T.ovatus2.5㊀MSTN 信号肽及磷酸化位点结果分析通过NetPhos 在线预测MSTN 的潜在磷酸化位点如图5所示,卵形鲳鲹MSTN 蛋白质有11处潜在丝氨酸磷酸化位点,位于第22㊁31㊁34㊁192㊁203㊁233㊁242㊁259㊁277㊁280㊁347位氨基酸;4处潜在苏氨酸磷酸化位点,位于第38㊁241㊁269㊁336位氨基酸;2处潜在酪氨酸磷酸化位点,位于第316㊁362位氨基酸㊂结果显示,预测第22位㊁第23位氨基酸之间可能为信号肽的剪切位点(图6)㊂图5㊀卵形鲳鲹MSTN 蛋白质的磷酸化位点Fig.5㊀Phosphorylation site of MSTN protein in T.ovatus141241广西师范大学学报(自然科学版),2021,39(1)图6㊀卵形鲳鲹MSTN蛋白质的信号肽结果分析Fig.6㊀Signal peptide analysis of MSTN protein of T.ovatus2.6㊀MSTN蛋白质结构域预测利用NetSurfP2.0对卵形鲳鲹MSTN蛋白质进行二级结构预测,发现序列由α螺旋㊁延伸链以及无规则卷曲构成,其中:α螺旋有97个氨基酸,占25.80%;延伸链有78个氨基酸,占20.74%;无规则卷曲有201个氨基酸,占53.46%(见图7)㊂利用SWISS-MODEL进行三级结构预测,构建MSTN模型(见图8), MSTN蛋白质三级结构显示,其外观盘曲形似V形,采用SAVES在线程序对构建的MSTN蛋白质模型进行评估,结果显示,70.71%的残基评分较高,在建模中得分为93.3566㊂a图7㊀MSTN蛋白质二级结构分布Fig.7㊀MSTN protein secondary structure distribution2.7　同源基因分析以斑马鱼作为外群,利用卵形鲳鲹MSTN基因与GenBank中其他22种鱼类的MSTN基因进行比对分析,构建ML系统进化树(图9)㊂结果显示,所分析的鱼类聚成3支,其中:第1支又包括3个分支,分支1和分支2分别为鲭形目Scombriformes与鲽形目Pleuronectiformes鱼类;分支3中,卵形鲳鲹㊁黄尾鰤与布氏鲳鲹聚为一个小分支,属鲹科Carangidae鱼类,尼罗尖吻鲈与尖吻鲈聚为一个小分支,为锯盖鱼科Centropomidae鱼类㊂第2支为鲈形目Perciformes的3种鱼类㊂第3支鱼类比较多,包括笛鲷目Lutjaniformes的墨西哥笛鲷与勒氏笛鲷㊁拟金眼鲷目Pempheriformes的七星鲈㊁狼鲈科Moronidae的条纹鲈与欧洲海鲈鱼㊁鲷形目Spariformes的真鲷与黑棘鲷㊁石首鱼科Sciaenidae的美国红鱼与锤形石首鱼,以及合鳃鱼目Synbranchiformes的大刺鳅㊂合鳃鱼目鱼类与其他鱼类基因的同源性最低,遗传距离最远㊂图8㊀MSTN蛋白质三级结构预测Fig.8㊀Prediction of tertiary structure of MSTN protein图9㊀MSTN序列ML系统进化树Fig.9㊀ML phylogenetic tree of MSTN amino acid sequence341441广西师范大学学报(自然科学版),2021,39(1)2.8㊀MSTN基因在胚胎发育各期的表达分析对卵形鲳鲹14个胚胎发育阶段的样品进行MSTN表达量检测,结果见图10㊂MSTN基因在卵形鲳鲹受精卵到晶体出现期的13个时期整体表达呈现较低的水平,其中在原肠早期与中期呈现少量的表达,而在原肠末期又降低,从胚体形成期后其表达量呈逐渐升高的趋势,到初孵仔鱼期表达量迅速升高,其表达量极显著高于前13个时期(P<0.15)㊂图10㊀MSTN在胚胎发育各期的相对表达量Fig.10㊀Relative expression of GMSTN in various stages of embryo development3㊀讨论大多数生肌决定因子能够精准调控动物肌肉的生长发育,其中MSTN基因作为重要生肌决定因子之一,在动物遗传育种领域的研究十分广泛㊂1997年首次报道了小鼠肌肉抑制素的缺失可诱导特征性高肌肉表型,同时可导致肌肉双重表型的肌生长抑制素基因突变[20]㊂以肌生长抑制素基因为靶点的基因编辑动物模型拥有更多的肌肉细胞和更高的生长速度,鸡㊁猪㊁大黄鱼及罗非鱼等动物的MSTN基因相继被克隆,并进行了相关基因功能的研究[21]㊂遗传修饰有助于改良物种的抗病性能㊁肉质品质及相关生长性状等,通过人工突变MSTN基因,可以培育MSTN基因修饰新品种鱼[22]㊂硬骨鱼类特有的全基因组复制是进化的必然选择,因此硬骨鱼类拥有MSTN基因的2个或多个副记录,在新生物功能进化中也起着关键作用[23]㊂Zhang等[24]从河鲶Ictalurus punctatus中分离鉴定出一个新的原代MSTN,并分析了MSTNa和MSTNb基因在胚胎发育时期的基因和蛋白质结构㊁进化关系和表达模式㊂兰州鲇Silurus lanzhouensis MSTN基因的CDS区全序列长度为1182bp,编码393个氨基酸,构建MSTN基因CDS序列构建系统发育树,比较编码区同源性与传统结果[25]一致;易恒洁等[26]研究发现,三穗鸭中MSTN蛋白质有1个跨膜结构㊂本文研究对MSTN蛋白质结构预测结果显示,该蛋白质外观盘曲形似V形,序列由α螺旋㊁延伸链以及无规则卷曲构成,其中α螺旋占25.80%(编码97个氨基酸),延伸链占20.74%(编码78个氨基酸),无规则卷曲占53.46%㊂李婷[27]采用同源克隆的方法,获得了黑鲷Sparus macrocephalus MSTN基因的DNA序列;孙冉冉[28]扩增获得黄条鰤Seriola aureovittata MSTN cDNA 全长序列,并预测了黄条鰤中MSTN包含有TGF-β前肽区域㊁TGF-β两段保守区域㊂本文研究克隆获得卵形鲳鲹MSTN基因的CDS为1131bp,编码376个氨基酸㊂同时利用多种在线工具对卵形鲳鲹的MSTN 蛋白质的氨基酸序列作进一步分析,发现该基因MSTN蛋白质不存在跨膜结构域,因此降低了跨膜区疏水性氨基酸对蛋白质折叠的影响,易于表达和纯化㊂预测第22位㊁第23位氨基酸之间可能为信号肽的剪切位点㊂卵形鲳鲹MSTN蛋白质的氨基酸序列分析结果显示含有N端信号肽㊁不存在跨膜区域,与TGF-β家族蛋白特征保持一致,并符合其他物种的MSTN特征,这提示MSTN蛋白质在卵形鲳鲹中具有功能保守性㊂同时显示MSTN基因在鲈形目鲹科不同属的鱼类中,编码的蛋白质可能具有不同特征㊂541MSTN蛋白质同源分析发现,卵形鲳鲹㊁布氏鲳鲹与黄尾鰤同属于鲹科Carangidae鱼类,其遗传距离较近,其中卵形鲳鲹MSTN与布氏鲳鲹的同源性最高,亲缘关系最近㊂鲹科鱼类㊁锯盖鱼科Centropomidae 鱼类与鲽形目Pleuronectiformes鱼类同属于鲹形系Carangaria,其中锯盖鱼科鱼类在鲹形系中的分类地位未定,但序列同源性分析结果发现,鲹科鱼类与锯盖鱼科鱼类序列同源性最高,遗传距离最近,而与鲽形目鱼类遗传距离则稍远㊂鲹形系是进化上较为复杂的一个系,包含许多目一级未分类物种[29],其MSTN基因的同源性与其物种的分类存在高度的相关性,可为这些物种的分类提供参考,但各物种的进化分类关系有待采用更准确的方法进一步研究㊂有研究结果表明,黄条鰤的胚胎发育早期,MSTN表达量呈现持续增加趋势,但表达量较低,自胚体发育的2/3期至孵化期MSTN的表达量显著升高,至孵化期表达量达到峰值(P<0.05)[28]㊂而斑马鱼的胚胎发育早期,MSTN的表达水平在体节发生后期(受精后15.5~19h)升高,在受精后21.5~24h时降低,而在孵化期后其表达量再次升高[30-31]㊂本文研究中:MSTN基因在卵形鲳鲹受精卵到晶体出现期共13个时期内呈极低水平的表达,且各期内的表达无显著差异(P>0.05)㊂在孵化期MSTN表达量迅速升高,其表达量极显著高于前13个胚胎发育期(P<0.01),由于卵形鲳鲹在这一阶段器官分化已经完成,故推测该基因在胚胎发育过程中作用较小,而在孵化后的大量表达可能与生肌因子的激活表达相关,并通过与生肌因子的共同作用来控制肌肉的生长发育㊂有研究发现[32]MSTN在胚胎发育早期过表达会使斑马鱼发育阶段脊索扭曲㊁体节发育受限㊂因此,我们推测MSTN在胚胎发育过程中不是必须的,过早或过量表达会引起机体某些器官的发育受阻,甚至造成畸形㊂4㊀结论本研究克隆分析了卵形鲳鲹MSTN基因的结构特征及其在14个胚胎发育阶段中的表达模式,发现其在孵化前期表达量较低,而在初孵仔鱼期表达量迅速升高,推测该基因主要在卵形鲳鲹孵化后发挥重要作用,而在孵化前作用较弱㊂本研究为进一步探索MSTN基因的功能及在卵形鲳鲹生长发育中的调控机制等方面奠定了基础㊂参㊀考㊀文㊀献[1]㊀熊向英,王贤丰,彭银辉,等.健康和患病卵形鲳鲹肠道菌群结构的差异[J].水产学报,2019,43(5):1317-1325.DOI:10.11964/jfc.20180411227.[2]㊀胡海滨,钱雪桥,解绶启,等.中成鱼阶段卵形鲳鲹对饲料蛋白质和脂肪的适宜需求量[J].上海海洋大学学报,2019,28(4):566-576.DOI:10.12024/jsou.20181202459.[3]㊀易新文,陈瑞爱,徐家华.鸡肉粉替代鱼粉对卵形鲳鲹生长㊁饲料利用和抗氧化力的影响[J].中国海洋大学学报(自然科学版),2019,49(12):17-24.DOI:10.16441/ki.hdxb.20180203.[4]㊀TAN X H,SUN Z Z,ZHOU C P,et al.Effects of dietary dandelion extract on intestinal morphology,antioxidant status,immune function and physical barrier function of juvenile golden pompano Trachinotus ovatus[J].Fish and Shellfish Immunology,2018,73:197-206.DOI:10.1016/j.fsi.2017.12.020.[5]㊀THOMAS M,LANGLEY B,BERRY C,et al.Myostatin,a negative regulator of muscle growth,functions by inhibitingmyoblast proliferation[J].Journal of Biological Chemistry,2000,275(51):40235-40243.DOI:10.1074/jbc.M004356200.[6]㊀McPHERRON A C,LAWLER A M,LEE S J.Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-beta superfamilymember[J].Nature,1997,387(6628):83-90.DOI:10.1038/387083a0.[7]㊀MOSHER D S,QUIGNON P,BUSTAMANTE C D,et al.A mutation in the myostatin gene increases muscle mass andenhances racing performance in heterozygote dogs[J].PLoS Genetics,2007,3(5):e79.DOI:10.1371/journal.pgen.0030079.641广西师范大学学报(自然科学版),2021,39(1)[8]㊀MEDEIROS E F,PHELPS M P,FUENTES F D,et al.Overexpression of follistatin in trout stimulates increased muscling[J].American Journal of Physiology:Regulatory,Integrative and Comparative Physiology,2009,297(1):R235-R242.[9]㊀LIN J,ARNOLD H B,DELLA-FERA M A,et al.Myostatin knockout in mice increases myogenesis and decreasesadipogenesis[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2002,291(3):701-706.[10]LI Q,LI Y G,HUANG X D,et al.Molecular cloning and single nucleotide polymorphisms identification of myostatincDNA in the pearl oyster,Pinctada fucata[J].Journal of the World Aquaculture Society,2014,45(6):638-651. [11]CHIANG Y A,KINOSHITA M,MAEKAWA S,et al.TALENs:mediated gene disruption of myostatin produces a largerphenotype of medaka with an apparently compromised immune system[J].Fish and Shellfish Immunology,2016,48: 212-220.[12]GAO F,SUN B X,XING S Y,et al.The effect of leader peptide mutations on the biological function of bovine myostatingene[J].Gene,2014,540(2):171-177.[13]HILL E W,GU J J,EIVERS S S,et al.A sequence polymorphism in MSTN predicts sprinting ability and racing staminain thoroughbred horses[J].PLoS ONE,2010,5(1):e8645.[14]李景芬,采克俊,曹访,等.反向㊁巢式㊁降落PCR技术克隆奥尼罗非鱼MSTN基因3ᶄ侧翼序列[J].江苏农业科学,2014,42(2):28-30.[15]李兴美,范巍,张彬,等.鲤鱼肌肉生长抑制素基因(MSTN)的克隆及其组织表达特征[J].水生生物学报,2007,31(5):643-648.[16]钟其旺.几种鲆鲽鱼类Myostatin基因的克隆及结构和表达分析[D].青岛:中国海洋大学,2007.[17]李盈,额尔敦木图,刘图雅,等.肌肉生长抑制素基因在不同动物中的研究进展[J].中国畜牧兽医,2013,40(8):141-145.[18]彭扣,赵浩斌,彭英,等.普通鲤与建鲤MSTN基因比较分析[J].南昌大学学报(理科版),2013,37(2):191-197.[19]区又君,李加儿.卵形鲳鲹的早期胚胎发育[J].中国水产科学,2005,12(6):786-788.[20]张猛,陈勇,沈玉帮,等.草鱼MSTN-1基因多态性及与早期生长性状和肌肉成分关联分析[J].水产学报,2016,40(4):618-625.[21]张冬杰,刘娣,张旭,等.利用CRISPR-Cas9系统定点突变猪MSTN基因的研究[J].畜牧兽医学报,2016,47(1):207-212.[22]王发新.兰州鲇GH和MSTN基因多态性及生长相关性研究[D].兰州:甘肃农业大学,2016.[23]KONDRASHOV F A,ROGOZIN I B,WOLF Y I,et al.Selection in the evolution of gene duplications[J].GenomeBiology,2002,3(2):research0008.1.[24]ZHANG S Y,LI Y,SHAO J J,et al.Functional identification and characterization of IpMSTNa,a novel orthologousmyostatin(MSTN)gene in channel catfish Ictalurus punctatus[J].International Journal of Biological Macromolecules, 2020,152:1-10.[25]俞兆曦.兰州鲇生长性状相关基因的分离㊁序列特征及组织特异性表达分析[D].兰州:甘肃农业大学,2016.[26]易恒洁,李辉,杨胜林,等.三穗鸭MyoG基因多态性与屠宰性状的相关性研究[J].中国畜牧杂志,2016,52(9):5-10.[27]李婷.黑鲷MSTNⅡ基因分子特征[D].宁波:宁波大学,2009.[28]孙冉冉.黄条鰤肌肉生长因子的克隆及其表达规律的研究[D].大连:大连海洋大学,2019.[29]BETANCUR-R R,WILEY E O,ARRATIA G,et al.Phylogenetic classification of bony fishes[J].BMC EvolutionaryBiology,2017,17:162.[30]HELTERLINE D L I,GARIKIPATI D,STENKAMP D L,et al.Embryonic and tissue-specific regulation of myostatin-1and-2gene expression in zebrafish[J].General and Comparative Endocrinology,2007,151(1):90-97. [31]VIANELLO S,BRAZZODURO L,DALLA VALLE L,et al.Myostatin expression during development and chronic stress inzebrafish(Danio rerio)[J].Journal of Endocrinology,2003,176(1):47-59.[32]XU C,WU G,ZOHAR Y,et al.Analysis of myostatin gene structure,expression and function in zebrafish[J].Journalof Experimental Biology,2003,206(22):4067-4079.741Molecular Cloning of the Myostatin Gene and Its Expression During EmbryoDevelopment of Trachinotus ovatusLUO Honglin,FENG Pengfei,YU Yanling,XIAO Rui,PAN Chuanyan,SONG Manling,ZHANG Yongde∗(Guangxi Key Laboratory of Aquatic Genetic Breeding and Healthy Aquaculture,Guangxi Academy ofFishery Sciences,Nanning Guangxi530021,China)Abstract:Myostatin(MSTN)is a negative regulator of skeletal muscle growth,and much interest has been given to its role in animal development in recent years.In this study,MSTN gene in Trachinotus ovatus was cloned and characterized,and the expression patterns of14embryonic development stages of T.ovatus were studied.The results showed that1322bp of MSTN gene was cloned,encoding a376amino acid polypeptide.The relative molecular weight was42694.85u,and the theoretical isoelectric point pI was5.52,which was a negatively charged protein.MSTN protein had no transmembrane domain and subcellular localization was mainly outside the cell,which may be secretory protein and easy to express and purify.MSTN protein had no signal peptide sequence,and17phosphorylation sites were predicted.A phylogenetic analysis of24species of fish revealed that the MSTN of T.ovatus had the highest homology with T.blochii,followed by that of landi dorsalis,all of which belonged to Carangidae,while that of Carangidae and centropomidae had the lowest genetic distance and close relationship.MSTN gene was very low or not expressed in all13stages of T.ovatus from Fertilized egg to Formation of eye lens stage,with no significant difference between the groups(P>0.05).However,the expression level of MSTN gene increased rapidly in the hatching stage,which was significantly higher than that in the previous13stages(P<0.01).The MSTN gene may play an important role after the T.ovatus hatched,but it is weak before hatching.Keywords:Trachinotus ovatus;myostatin;gene cloning;embryonic development;gene expression(责任编辑㊀黄㊀勇)。

广西卵形鲳鲹海豚链球菌基因分型、耐药谱型以及毒力基因检测熊向英;黄国强;王志成;文雪【摘要】为了解近年来广西卵形鲳鲹海豚链球菌流行菌株的基因型信息以及菌株间的差异,对2015—2016年从广西地区7个养殖场的患病卵形鲳鲹体内分离得到的17株海豚链球菌菌株分别进行了基因型分析、耐药谱测定以及毒力基因检测.采用随机扩增多态性DNA标记技术(RAPD)和基因组重复序列PCR(rep-PCR)分析其基因型.结果显示, RAPD和rep-PCR指纹图谱结果一致,17株海豚链球菌可分为2种基因型.对海豚链球菌7种主要的毒力相关基因特异PCR检测,所有菌株均为simA+scpI+pdi+sagA+cpsD+pgmA+cfi+毒力基因型,表明这2种基因型的海豚链球菌似乎均为毒力较强的菌株.采用K-B法进行了20种抗生素敏感实验分析其耐药谱,结果表明归于基因1型的菌株耐药谱为AZT,基因2型菌株则出现3种相似的耐药谱,分别为SIZ/T/S/PEN/AZT/SPE/CAZ/PB、SIZ/T/S/PEN/AZT/SPE/CAZ/CRO和SIZ/T/S/PEN/AZT/SPE/CAZ/PB/RIF,证实基因型相同的菌株耐药谱型也相似,2种基因型的菌株耐药谱型差异显著,因此基因型和耐药谱型存在相关性.此结果为卵形鲳鲹海豚链球菌病流行病学研究、疫苗研制以及疫病监测提供理论依据.%To acquire the data of genotype and diversity upon the clinical dominant strains Streptococcus iniae of golden pompano(Tranchinotus ovatus)in Guangxi,a total of 17 bacterial isolates were analyzed by molecular typ-ing, antibiogram type and virulence-related gene which were collected from diseased golden pompano in 7 farms located in Guangxi Province during 2015—2016. By using the random amplified polymorphic DNA (RAPD) and repetitive primerpolymerase chain reaction (rep-PCR) method, we successfully differentiated all 17 isolates into two distinct genotypes. Seven virulence-related genes were detected by PCR using specific primer, and the results revealed that the virulence-related genotype of these strains wassimA+scpI+pdi+sagA+cpsD+pgmA+cfi+.All isolates seemed to show a high virulence. In addition, the antibiotic resistance profiles of 17 strains were tested with 20 common antibiotics using Kirby-Bauer disc diffusion methodology. The antibiogram of the isolates belonging to genetype 1 in rep-PCR analysis was AZT, while the antibiograms of genetype 2 were SIZ/T/S/PEN/AZT/SPE/CAZ/PB, SIZ/T/S/PEN/AZT/SPE/CAZ/CR andSIZ/T/S/PEN/AZT/SPE/CAZ/PB/RIF, respectively. Our re-search revealed that the two genotypes display significant differences of two antibiogram types and the same gene-type isolates have similar antibiogram types. Therefore, a correlation between the genotype and the antibiogram types of S.iniae isolates has been identified.This study provides theoretical foundation and technical support for epidemiological study,vaccine development and disease control of S.iniae in golden pompano.【期刊名称】《水产学报》【年(卷),期】2018(042)004【总页数】10页(P586-595)【关键词】卵形鲳鲹;海豚链球菌;基因分型;毒力基因;耐药谱;广西【作者】熊向英;黄国强;王志成;文雪【作者单位】广西海洋研究所,广西海洋生物技术重点实验室,广西北海 536000;广西海洋研究所,广西海洋生物技术重点实验室,广西北海 536000;广西海洋研究所,广西海洋生物技术重点实验室,广西北海 536000;广西海洋研究所,广西海洋生物技术重点实验室,广西北海 536000【正文语种】中文【中图分类】S941.42海豚链球菌(Streptococcus iniae)能引起多种野生和养殖经济鱼类患链球菌病[1-2]，给世界水产养殖业造成巨大的经济损失[3]，而且海豚链球菌已经威胁到人类的健康与安全, 目前已有多例人因接触病鱼而感染的报道[4-5]。

卵形鲳鲹论文：卵形鲳鲹选育群体微卫星标记、生长比较、形态性状与体重相关性分析和生态养殖研究【中文摘要】为开发卵形鲳鲹优良品种,促进其养殖业健康、稳定、可持续性发展,本文对卵形鲳鲹基础选育群体进行了分子标记、生长比较以及主要形态性状与体重的相关性研究,并对其健康养殖模式进行了探讨。

主要结果如下:1卵形鲳鲹养殖群体的微卫星多态性分析运用6对微卫星引物分别对海南、深圳、福建3个地区卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）养殖群体的遗传差异进行了分析。

数据采用Popgen32软件分析,并用MEGA4.0作图,结果得出3个群体平均等位基因数（Na）为3.673.83,平均有效等位基因数（Ne）2.433.03,平均观测杂合度（Ho）为0.480.66,平均期望杂合度（He）为0.560.64,平均多态信息含量（PIC）为0.490.55,可见3个养殖群体的遗传多样性较高。

Hardy-weinberg平衡遗传偏离指数（d）显示海南和深圳群体杂合子过剩（0.10和0.12）,而福建群体则出现杂合子缺失（-0.08）,统计检验发现三个群体中各位点的遗传偏离并不显著（p>0.05）。

根据3个群体的遗传相似度及遗传距离信息进行聚类分析表明,福建与深圳群体的亲缘关系较近,两者与海南群体的亲缘关系较远,三群体的确切来源还有待进一步研究,为卵形鲳鲹群体选育提供了指导。

2卵形鲳鲹选育群体形态性状与体重的相关性分析跟踪测量了卵形鲳鲹（T. ovatus）选育群体1月龄,4月龄,7月龄,10月龄和13月龄个体的全长（x1）,体长（x2）,体高（x3）和体重（y）。

运用相关分析,多元回归分析和通径分析的方法,计算了以体重为依变量,其他形态性状为自变量的相关系数,通径系数和决定系数,并剖分各性状对体重的影响,并建立最优多元回归方程。

结果表明:在不同的生长阶段,所测4个性状间的相关系数在0.017—0.960之间,除4月龄个体体高与其他性状间相关性不显著外(（P>0.05）,其他月龄群体各性状两两之间的相关性均达到了极显著水平（P0.05）,而其他水质指标则存在差别;进、排水沟水质也无明显差异;氨氮和活性磷的去除率分别为53.38%和58.02%;体系中各养殖品种的产量显著高于对照组（p<0.05）,其中卵形鲳鲹实验组产量为4236.2 kg/ha,而对照组仅为3943.4kg/ha。

《卵形鲳鲹两种抗菌肽基因功能及转录调控研究》摘要：本文研究了卵形鲳鲹中两种抗菌肽基因的功能及其转录调控机制。

通过生物信息学分析、基因克隆、原核表达、细胞实验及分子生物学技术，我们深入探讨了这两种抗菌肽在卵形鲳鲹免疫系统中的作用，以及其转录调控的关键因子和路径。

一、引言卵形鲳鲹作为一种重要的水产经济动物，其免疫系统在抵抗病原菌入侵时发挥着重要作用。

抗菌肽作为免疫系统的重要组成成分，在抵御细菌感染中具有关键作用。

因此，研究卵形鲳鲹抗菌肽基因的功能及其转录调控机制，对于理解其免疫机制、提高养殖业的病害防控能力具有重要意义。

二、材料与方法1. 材料：选用健康的卵形鲳鲹作为实验材料，提取其相关组织进行基因克隆和表达分析。

2. 方法：（1）生物信息学分析：利用生物信息学软件对卵形鲳鲹抗菌肽基因进行序列分析，预测其结构和功能。

（2）基因克隆：通过PCR技术扩增抗菌肽基因，构建表达载体。

（3）原核表达：将表达载体转入大肠杆菌，进行抗菌肽的原核表达。

（4）细胞实验：利用细胞培养技术，研究抗菌肽对细胞的保护作用。

（5）分子生物学技术：通过荧光定量PCR、Western blot等技术，研究抗菌肽的转录调控机制。

三、结果与分析1. 基因功能分析：通过生物信息学分析和实验验证，我们发现两种抗菌肽基因在卵形鲳鲹中具有不同的表达模式和功能。

其中，抗菌肽基因A主要参与抵御革兰氏阳性菌的感染，而抗菌肽基因B则对革兰氏阴性菌具有更强的抑制作用。

2. 转录调控研究：我们发现两种抗菌肽基因的转录水平受到多种因素的影响，包括病原菌的感染、环境因素和机体内分泌水平等。

通过荧光定量PCR和Western blot等技术，我们确定了转录调控的关键因子和路径，并进一步探讨了这些因子如何影响抗菌肽的合成和分泌。

3. 原核表达与细胞实验：原核表达实验成功实现了两种抗菌肽的异源表达，并纯化了活性蛋白。

细胞实验表明，这两种抗菌肽对细胞具有保护作用，能够显著提高细胞的存活率，并抑制病原菌的增殖。

卵形鲳鲹MHC Ⅱα及MHC Ⅱβ组织特异性表达分析张小其;孙云;周永灿;曹贞洁【期刊名称】《海南大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2018(036)002【摘要】为了从蛋白水平和mRNA水平上比较和分析MHC Ⅱα和MHC Ⅱβ基因在卵形鲳鲹不同组织中的表达情况,本研究构建了重组载体pET32a(+)/M-Ⅱα和pET32a(+)/M-Ⅱβ来诱导其表达,并制备了多克隆抗体,而且通过qRT-PCR技术分析了MHC Ⅱ类基因在卵形鲳鲹正常组织中的表达.结果显示,本研究成功表达了卵形鲳够MHC Ⅱα和MHC Ⅱβ基因的融合蛋白,并制备出了效价高和特异性强的多克隆抗体;在利用Western Blot技术分析MHC Ⅱα或MHC Ⅱβ基因在卵形鲳够不同组织中对蛋白的表达情况时,均检测到一条大小约70kDa的疑似MHC Ⅱαβ二聚体的单一条带,且该MHC Ⅱαβ二聚体在脾脏、头肾、肠道、鳃中的表达量较高,而在胃、心、脑、肝中的表达量稍低.qRT-PCR的分析结果一致表明,MHC Ⅱ类基因广泛分布在不同组织中,尤其在与免疫相关的组织(脾脏、头肾、肠道、鳃)中,其具有较高表达量.【总页数】9页(P101-109)【作者】张小其;孙云;周永灿;曹贞洁【作者单位】南海海洋资源利用国家重点实验室,海南大学海洋学院,海南海口570228;南海海洋资源利用国家重点实验室,海南大学海洋学院,海南海口570228;南海海洋资源利用国家重点实验室,海南大学海洋学院,海南海口570228;南海海洋资源利用国家重点实验室,海南大学海洋学院,海南海口570228【正文语种】中文【中图分类】Q78;S917.4【相关文献】1.玻璃红鲤MHC Ⅱ类基因多态性与组织表达分析 [J], 张天睿;刘至治;刘俊;赵雪锦;王成辉2.卵形鲳鲹MHCⅡβ基因的克隆与表达分析 [J], 于文博;朱克诚;郭华阳;张楠;孙潇潇;吴娜;张殿昌3.卵形鲳鲹MHCⅡβ基因的克隆与表达分析 [J], 于文博;朱克诚;郭华阳;张楠;孙潇潇;吴娜;张殿昌;;;;;;;;;;4.金钱鱼MHC Ⅱ β基因结构、多态性与组织表达分析 [J], 王晓冰;刘至治;李强;张璐菲;张俊彬5.中华鳖MHCⅡα基因cDNA的克隆及组织表达分析 [J], 童正飞;葛玲瑞;胡亚洲;杨涛;涂开发;王佩;周先文;王晓清;熊钢因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

卵形鲳鲹卵巢不同发育时期的转录组测序分析作者：李蔚何苹萍韦嫔媛朱鹏蒋伟明胡珅华韦友传韦明利彭金霞来源：《南方农业学报》2022年第03期摘要：【目的】鉴定筛选出与卵形鲳鲹卵巢发育相关的候选基因及信号通路，为揭示其卵巢性成熟过程的分子机制打下基础。

【方法】挑选卵巢发育处于І期和Ш期的雌性卵形鲳鲹，分别构建卵形鲳鲹卵巢І期和Ш期的cDNA文库，采用Illumina HiSeqTM 2500进行转录组测序，经过滤、质量控制及拼接组装后获得的Unigenes在七大数据库（Nr、Nt、Pfam、KOG/COG、Swiss-Prot、KEGG和GO）中进行比对;通过FPKM及DEGseq筛选出差异表达基因，以GOseq和KOBAS对差异表达基因分别进行功能注释及信号通路富集分析，并采用MISA和GATK3进行SSR鉴定及SNP分析。

【结果】卵形鲳鲹卵巢组织转录组测序获得的325156432条Raw reads，经过滤筛选得到317206752条Clean reads，拼接组装后得到59554条Unigenes;69.65%的Unigenes在Nr、Nt、Pfam、KOG/COG、Swiss-Prot、KEGG和GO等七大数据库中注释成功，其中有24599条Unigenes被注释到GO数据库，15997条Unigenes被注释到KEGG数据库。

在卵形鲳鲹卵巢组织的2个发育时期共鉴定获得56115个基因，经差异表达分析后获得17737个差异基因，其中8169个基因在卵巢Ш期上调表达、9568个基因在卵巢Ш期下调表达。

GO功能注释分析发现，卵形鲳鲹卵巢差异表达基因主要注释在细胞过程、氮化合物代谢过程、初级代谢过程、核、核部分、离子结合及水解酶活性等条目上;而KEGG信号通路富集分析结果显示，17737个差异表达基因显著富集在318条代谢途径上，其中前20条KEGG信号通路包括2-氧代羧酸代谢、PI3K-Akt信号通路、甲状腺激素信号通路、磷脂酶D 信号通路、Fc εRI信号通路和细胞周期等。

青杄PsbO基因cDNA序列克隆及⽣物信息学分析OEE1(oxygen -evolving enhancer protein 1,MSP,33kD 蛋⽩)是由核基因锰簇稳定外周蛋⽩PsbO 基因编码的定位于叶绿体的33kD 蛋⽩,结合在类囊体膜内的光系统Ⅱ的外缘,是与放氧关系最为密切的外周蛋⽩,在维持光系统Ⅱ复合体的稳定⽅⾯发挥重要作⽤[1].⾃从Yamamoto 等第⼀次从光系统Ⅱ膜上纯化出OEE1蛋⽩之后[2],对该蛋⽩以及编码该蛋⽩的PsbO 基因的研究⼀直都未停⽌过.光合系统是对外界逆境响应最为敏感的部分,极易引发产⽣活性氧,造成光合系统破坏,出现光抑制情况.Mn 簇是否稳定对光系统Ⅱ光抑收稿⽇期：2012-02-24；修回⽇期：2012-03-29基⾦项⽬：国家转基因⽣物新品种培育科技重⼤专项资助项⽬（2009ZX08009-062B ）作者简介：刘亚静(1987-),⼥,河北衡⽔⼈,硕⼠研究⽣,主要从事植物抗逆基因的克隆和功能研究,E -mail ：liuyajing1987@/doc/8a553b4e83c4bb4cf6ecd17c.html ；*通讯作者：张凌云（1973-）,⼥,北京林业⼤学森林培育学科副教授,主要从事植物发育与⽣殖⽣物学研究,E -mail ：lyzhang73@/doc/8a553b4e83c4bb4cf6ecd17c.html .青杄PsbO 基因cDNA 序列克隆及⽣物信息学分析刘亚静,李长江,孙帆,张凌云*(北京林业⼤学森林培育与保护教育部重点实验室,中国北京100083)摘要：利⽤RACE 技术从已有的青杄均⼀化cDNA ⽂库中克隆得到青杄（Picea wilsonii ）PsbO 基因cDNA 的全长,并⽤⽣物信息学的⽅法对该cDNA 的核苷酸序列、氨基酸序列的相似性,及编码蛋⽩PwPsbO 的理化性质、亲⽔性/疏⽔性、⼆级和三级结构,PwPsbO 基因进化树等进⾏了预测和分析.采⽤实时荧光定量PCR （RT -qPCR ）技术,测定了青杄不同组织中的PsbO 基因的相对表达⽔平.结果发现：青杄PsbO 基因编码346个氨基酸,预测相对分⼦质量为36.6kD,理论pI 值为5.29,属于可溶性蛋⽩.⼆级和三级结构预测表明其含有较多的α螺旋、β折叠和随机卷曲结构.RT -qPCR 发现该基因在青杄针叶和茎中表达量最⾼.这些结果为青杄中PsbO 基因的初步功能研究奠定了基础.关键词：青杄；PsbO 基因；RACE ；⽣物信息学中图分类号：Q781⽂献标识码：A⽂章编号:1007-7847(2012)03-0201-06cDNA Cloning and Bioinformatic Analysis of PsbO Genefrom Picea wilsoniiLIU Ya -jing,LI Chang -jiang,SUN Fan,ZHANG Ling -yun *（Key laboratory of Forest Silviculture and Conservation of the Ministry of Education,Beijing Forestry University,Beijing100083,China ）Abstract ：Full -length cDNA sequence of PsbO gene was acquired from normalized cDNA library of Piceawilsonii by RACE methods.Prediction on physical and chemical properties,hydrophobicity,phylogenetic tree ,secondary and tertiary structure of amino acid were analyzed by bioinformatics.The relative expression level of PwPsbO in different tissues using quantitative real time PCR (RT -qPCR)was measured.The results showed that PwPsbO gene encodes 346aminoacids.Its molecular weight is 36.6kD and the theoretical pI is 5.29.It is a hydrophilic protein.The secondary and tertiary structure of PwPsbO is mainly composed of alpha helix,random coil and extended strand.The higher expression level of PwPsbO was observed in needles and stems.The aim of this study is to lay a foundation for the function of PsbO in Picea wilsonii .Key words ：Picea wilsonii ；PsbO ；RACE ；bioinformatics（Life Science Research ，2012，16（3）：201～206）第16卷第3期⽣命科学研究Vol．16No．32012年6⽉Life Science ResearchJun.2012⽣命科学研究2012年制产⽣活性氧的过程会产⽣重要影响.PsbO可能直接影响Cl-在光系统Ⅱ放氧反应中与活性位点的结合或者作⽤的发挥[3].将PsbO蛋⽩从膜上去除会导致在低Cl-浓度下Mn簇4个Mn原⼦中的2个从膜上脱落[4].另有许多证据表明PsbO 蛋⽩与CP47之间存在结合,保护CP47免受限制性蛋⽩酶的降解,去除PsbO蛋⽩以后,CP43、Cytb559的α亚基易被胰蛋⽩酶剪切[4,5].拟南芥的PsbO2涉及在⾼光条件下调节D1蛋⽩的运转,具有维持光系统Ⅱ的功能[6].因此,OEE1蛋⽩很有可能参与光合放氧⽣物在光照胁迫时的保护机制[5,7].杨传平等应⽤SSH技术研究盐胁迫下柽柳相关基因的表达情况,获得了36个盐胁迫响应基因,其中就包括PsbO蛋⽩基因[8].Sugihara K等发现⽊榄在500mmol/L NaCl胁迫下OEE1蛋⽩表达的表达增强[9].这些研究表明PsbO蛋⽩很可能参与逆境条件下的胁迫响应过程.最近,有关⼈员预测PsbO蛋⽩可能也发挥包括酶活性调节、反应中⼼蛋⽩翻转的调控、类囊体膜结构的调整等功能[10,11],这可能预⽰着PsbO在其它更多⽅⾯的新功能的发现.本⽂以青杄为研究对象,成功克隆得到青杄中PsbO基因的全长cDNA,利⽤⽣物信息学的⽅法对该cDNA核苷酸序列、氨基酸序列的相似性、理化性质、亲⽔性/疏⽔性、⼆级和三级结构、进化树等进⾏了预测和分析,并⽤RT-qPCR⽅法分析了PsbO基因在青杄不同组织中的相对表达⽔平,旨在为进⼀步进⾏PsbO基因的功能研究奠定科学基础.1材料与⽅法1.1实验材料多年⽣青杄（Picea wilsonii）的花粉和针叶,由中科院植物所北京植物园提供.供试花粉于室温下⾃然风⼲,贮藏于-20℃冰箱.供试针叶⽤液氮速冻,贮藏于-80℃超低温冰箱.⽤Gateway技术构建青杄cDNA⽂库,由英俊⽣物公司构建.两年⽣青杄的根、茎、叶⽤于进⾏RT-qPCR实验.Taq DNA聚合酶、DL2000购买于中国TAN-GENG公司,pDONR222载体购买于美国Invitro-gen公司,反转录试剂盒购买于加拿⼤Fermentas 公司,荧光定量PCR试剂盒购买于美国KAPA公司,pEASY-T1购买于中国全式⾦公司,其它试剂均购于美国Promega公司.1.2实验⽅法1.2.1利⽤RACE PCR获取PwPsbO基因的末端序列以多年⽣青杄cDNA⽂库（本实验室已构建）为模板,利⽤PsbO的EST序列中特异引物与PDONR222两端的载体引物进⾏5′-RACE与3′-RACE实验.5′-RACE实验利⽤上游引物5PR-L 与下游引物5PR-R(见表1),3′-RACE实验利⽤上游引物3PR-L与下游引物3PR-R(见表1)进⾏扩增.通过EST⽚端与5′端、3′端序列的拼接,得到PsbO基因的全长cDNA序列.1.2.2PwPsbO基因的⽣物信息学分析利⽤DNAMAN软件进⾏PwPsbO的cDNA 序列编码框预测及蛋⽩翻译.通过NCBI(http：///doc/8a553b4e83c4bb4cf6ecd17c.html /)与TRIR(http：///doc/8a553b4e83c4bb4cf6ecd17c.html /)⽹站中的BLASTn与BLASTp⼯具进⾏核酸序列与蛋⽩序列的同源性分析,⽤CLUSTALX软件进⾏多序列⽐对,⽤MEGA5进⾏系统树的构建；利⽤ExPASy(http：///doc/8a553b4e83c4bb4cf6ecd17c.html /tools/)中的Compute pI/Mw⼯具(http：// /doc/8a553b4e83c4bb4cf6ecd17c.html /compute_pi/)预测其等电点和相对分⼦质量,利⽤ProtScale⼯具(http：///doc/8a553b4e83c4bb4cf6ecd17c.html /protscale/)计算蛋⽩的疏⽔性图谱；利⽤TMHMM⼯具(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMH-MM-2.0/)预测蛋⽩是否跨膜；利⽤SWISS-MODEL ⼯具来预测蛋⽩的⼆级和三级结构.1.2.3利⽤RT-qPCR进⾏PwPsbO基因的组织表达分析利⽤Aidlab公司RNA提取试剂盒提取两年⽣青杄的根、茎、叶与多年⽣青杄的种⼦和花粉的RNA.利⽤Fermentas公司的RevertAid TM First Strand cDNA Synthesis Kit合成双链cDNA.根据PwPsbO的CDS设计特异引物QRT-L、QRT-R(见表1).选⽤青杄EF-1α基因为内参基因,并设计引物EF-1α-L和EF-1α-R(见表1).利⽤KAPA公司的SYBR FAST qPCR Kit（ABI prismTM）在ABI StepOnePlus实时荧光定量PCR仪进⾏RT-qPCR 实验,分析PwPsbO在青杄5种不同组织中的相对表达情况.2结果2.1通过RACE实验获取PwPsbO的cDNA全长对5′RACE和3′RACE实验获取的⽚段进⾏202第3期刘亚静等：青杄PsbO 基因cDNA 序列克隆及⽣物信息学分析图1PwPsbO 的核苷酸序列和氨基酸序列氨基酸序列⽤单个字母表⽰,下划线标记为转录起始密码⼦ATG 和转录终⽌密码⼦TGA ；氨基酸碳末端⽤星号表⽰,PolyA 信号⽤⿊体表⽰.Fig.1Nucleotide sequences and deduced sequence of a -mino acid residues of PwPsbOThe amino acid residues are indicated by a single letter code.A potential translation initiation codon (ATG)and a termination codon are underlined ；the C terminal of se -quence of amino acid residues is marked with asterisk ；the potential polyadenylation signal sites are marked inbold.测序,并且将测序结果与EST ⽚段拼接获取cDNA 全长(图1).设计引物PsbO -L 与PsbO -R,⽤PCR 扩增PwPsbO 的编码区,将⽚段连接pEASY -T1载体上酶切和测序进⾏鉴定.2.2PwPsbO 的氨基酸组成与理化性质分析应⽤DNAMAN 对PwPsbO 的全长cDNA 序列进⾏分析发现：PwPsbO 的全长cDNA 共1260bp,在54bp 出现起始密码⼦ATG,在1092bp 处发现终⽌密码⼦TGA,在1248bp 处出现PolyA 尾巴,编码区由1041bp 核酸组成,编码346个氨基酸（核苷酸和氨基酸序列见图1）.应⽤Compute pI/Mw ⼯具预测相对分⼦质量为36.6kD,理论pI 值为5.29.2.3PwPbsO 推导的氨基酸序列的的疏⽔/亲⽔性分析氨基酸的疏⽔性和亲⽔性是氨基酸的固有特性,蛋⽩结构的稳定性在很⼤程度上依赖于氨基酸的疏⽔特性.我们利⽤ProtScale ⼯具(http ：///doc/8a553b4e83c4bb4cf6ecd17c.html /protscale/)计算蛋⽩的疏⽔性图谱,对PwPbsO 蛋⽩的疏⽔性和亲⽔性进⾏了分析.发现第159位的赖氨酸（Lys ）、160位天冬酰胺酸（Asn ）、163位的脯氨酸（Pro ）疏⽔性最差是-2.467,79位的丙氨酸（Ala ）疏⽔性最强是2.256.⼤部分的氨基酸属于亲⽔性氨基酸,因此预测PwPbsO 为可溶性蛋⽩（见图2）.2.4PwPsbO 基因与多种植物的序列⽐对及系统进化树分析我们将PwPsbO 蛋⽩的氨基酸序列与拟南芥、⽟⽶、杨树、⽊榄、⽑⽵、葡萄等物种（表2）的序列进⾏了多序列⽐对,发现PwPsbO 蛋⽩和其他PsbO 蛋⽩类似,含有较多的α螺旋以及β折叠结构[12]（图3）.并⽤MEGA5进⾏了系统树的构建（图4）.结果发现,青杄PsbO 基因和⽑⽵、⽟⽶的亲缘关系最近.2.5PwPsbO 的⼆、三级结构分析我们利⽤GOR4在线⼯具做了PwPsbO 蛋⽩的⼆级结构预测,发现该氨基酸序列含有23.99%的α螺旋结构（Alpha helix）,21.97%的β折叠（Extended strand ）,54.05%的随机卷曲（Random coil ）,这个结果（见图5）和以往的研究成果基本类似,但具体的结构尚需实验印证.应⽤SWISS -MODEL ⼯具来预测PwPsbO 蛋⽩的三维结构也得到了类似的结果（图6）.表1cDNA 克隆和RT -qPCR 所⽤引物序列Table 1The primers used in the cDNA cloning andRT -qPCRPrimers 5PR -L 5PR -R 3PR -L 3PR -R QRT -L QRT -R EF -1α-L EF -1α-R PsbO -L PsbO -RSequencesCAGTCTTAAGCTCGGGCCCCA CAGCGCGGATCCTGTTGCGAGG CCTCGCAACAGGATCCGCGCTG CTGCCAGGAAACAGCTATGAC ATGGCCGCGTCCCTCGCAACAG AAGGCCCTTGAGAGGTTCGAGG AACTGGAGAAGGAACCCAAG AACGACCCAATGGAGGATAC ATGGCCGCGTCCCTCGCAACAG TCAATTTGTGCATACCATGGG203⽣命科学研究2012年图3不同植物的PsbO 蛋⽩多序列⽐对结果Fig.3The multiple protein sequences alignment result表2PwPsbO 的同源基因Table 2Homological genes of PwPsbO图2PwPsbO 蛋⽩的疏⽔性分析图谱Fig.2Hydrophobic analysis of PwPsbOProtScale output for user sequenoe2.52.01.51.00.5-0.50-1.0-1.5-2.0-2.5S c o r ePosition50100150200250300Hphob./Kyte &DoolittleSpeciesArabidopsis thanliana Populus trichocarpa Bruguiera gymnorhiza Zea maysPhyllostachys edulis Vitis viniferaNicotiana benthamianaAccession AT5G66570AT3G50820XP_002310188AB043960ACG31595ABV57472XP_002274796AAX53163 Gene AtPsbO 1AtPsbO 2PtPsbO BgPsbO ZmPsbO PePsbO VvPsbO NbPsbO 1E value e -126e -125003e -1802e -9700204第3期图8PwPsbO 基因在两年⽣青杄的相对表达情况Fig.8Transcript accumulation of PwPsbO in 2-year -old trees图7青杄各组织RNA 提取结果Fig.7The result of RNA of five tissues in Picea wilsonii图6由SWISS -MODEL ⼯具预测的PwPsbO 蛋⽩的三级结构Fig.6The tertiary structure of protein PwPsbO present -ed by SWISS -MODEL图4不同植物间PbsO 基因系统树Fig.4Polygenetic tree of PbsO about 8kinds of differ -ent plantsBgOEP1NbPSBO1VvPSBO1AtPSBO1AtPSBO2PwPSBO1ZmOEP1PePSBO0.0250100150200250图5PwPsbO 蛋⽩的⼆级结构预测图紫⾊代表随机卷曲,红⾊代表α螺旋结构,蓝⾊代表β折叠.Fig.5The secondary structure of protein PwPsbO presented by GOR4The part of purple/red/blue represent the random coil/alpha helix/extended strand. 28S 18Srootstemneedlespollenseedrootstemneedles pollenseed0.51.01.52.02.53.03.5R e l a t i v e e x p r e s s i o n2.6PwPsbO 基因在不同组织中的表达情况分别提取青杄根、茎、叶、花粉、种⼦5种组织的总RNA.经过1.2％琼脂糖凝胶电泳(110V,15min),18S 和28S 条带明显(图7).接下来我们对所提取的RNA 进⾏OD 260/280检测分析,OD 值⼤⼩介于1.8～2.0之间,说明提取的总RNA 纯度⽐较好,可以⽤于后续实验．将上⼀步提取的各组织RNA 通过加拿⼤Fermentas 公司的RevertAid TM First Strand cDNA Synthesis Kit 合成双链cDNA 试剂盒反转录为cDNA.利⽤KAPA 公司的SYBR FAST qPCR Kit （ABI prism TM ）在ABI StepOnePlus 实时荧光定量PCR 仪进⾏RT -qPCR 实验.设置阴性对照和空⽩对照,每次试验设置3个重复,得到PsbO 基因在不同组织中表达情况的RT -qPCR 的结果（图8）.结果显⽰,PsbO 基因在青杄的茎和叶中的表达量最⾼.3结论与讨论以青杄cDNA ⽂库为模板的RACE 实验是基于EST 保守序列和pDONR222载体上特异的引物进⾏的,因此cDNA 全长是由PsbO 的末端序列和EST 序列进⾏拼接⽽来的,进⽽完成基因的克隆.本研究成功获得了青杄PsbO 基因的cDNA 序列并推导出了它的氨基酸序列.青杄PsbO 基因的全长cDNA 共1260bp,包括1041bp 的完整的53bp 的5′⾮翻译区(5′site untranslated re -gion,5′-UTR),368bp 的3′⾮翻译区(3′-UTR)以及刘亚静等：青杄PsbO 基因cDNA 序列克隆及⽣物信息学分析205⽣命科学研究2012年poly(A)尾巴.青杄PsbO基因编码346个氨基酸,预测相对分⼦质量为36.6kD,理论pI值为5.29.青杄PsbO蛋⽩的⼆级结构预测表明此蛋⽩含有23.99%的α螺旋结构（alpha helix）,21.97%的β折叠结构（extended strand）,54.05%的随机卷曲结构（random coil）,三级结构以⽆规则卷曲为主,α螺旋和β折叠主要分布在PsbO蛋⽩的外围.三级结构中形成了⼀个圆桶形的结构域,可以推测锰离⼦在该区域螯合.这个结果和以往的研究成果基本类似,但具体的结构尚需实验印证.⽬前已有研究使⽤⼩⾓度的X射线观测了低分辨率下野⽣型菠菜PsbO蛋⽩.该蛋⽩在溶解状态时以单分⼦状态存在[13].这也和本研究预测的Pw-PsbO蛋⽩为可溶性蛋⽩⼀致.最新的研究表明psbo突变植物的光合系统Ⅱ放氧复合体的稳定性存在多样缺陷.真核⽣物中的PsbO蛋⽩可能通过与锰离⼦、钙离⼦以及氯离⼦的联系影响光系统Ⅱ放氧过程的氧化还原反应[14].⽬前已经在拟南芥、⽔稻、⼩麦、菠菜、烟草、番茄等许多植物中发现PsbO基因具有多个拷贝的现象,这说明PsbO在响应⾼光胁迫过程中,可能存在⼀种通过调控D1蛋⽩周转达到提⾼植物抗性的机制,⽽且有关研究也发现某些逆境条件上调PsbO基因的表达,表明PsbO基因可能在提⾼植物抗逆性⽅⾯具有⼀定的作⽤.我国特有树种青杄（Picea wilsonii）是⼀种品质⾮常优良的树种,性强健、适应⼒强、耐阴性强、耐寒性强,PsbO基因是否在逆境响应中发挥作⽤,还需要进⼀步研究.本研究⾸次从中国特有树种青杄中克隆得到了PwPsbO基因的cDNA全长,并应⽤⽣物信息学的⽅法初步预测了该基因的⼀些性质和结构⽅⾯的特征,这对继续研究PwPsbO如何保持光系统Ⅱ的稳定性以及在逆境胁迫响应中的功能等⽅⾯具有⼀定的意义.参考⽂献(References)：[1]于勇,翁俊,徐春和.植物光系统Ⅱ放氧复合体外周蛋⽩结构和功能的研究[J].植物⽣理学报（YU Yong,WENG Jun,XU Chun-he.The progress in the investigation on the structure and function of the extrinsic proteins of photosystem II[J].Acta Phytophysiologica Sinica）,2001,27(6)：441-450.[2]YAMAMOTO Y,NAKAYAMA S,COHN C L,et al.Highly ef-ficient purificaiton of the33-,24-,and18-kDa proteins inspinach photosystemⅡby butanol/water phase partitioningand high performance liquid chromatography[J].Archives of Bio-chemistry and Biophysics,1987,255（1）：156-161.[3]POPELKOVA H,YOCUM C F.PsbO,the manganese-stabiliz-ing protein：analysis of the structure-function relations thatprovide insights into its role in photosystemⅡ[J].Journal of P-hotochemistry and Photobiology B,2011,104(1-2)：179-190.[4]BRICKER T M.Oxygen evolution in the absence of the33kDa manganese-stabilizing protein[J].Biochemistry,1992,31（19）：4623-4628.[5]MIYAO M,MURATA M,LAVOREL I,et al.Effects of the33kDa protein on the state transitions in photosynthetic oxygenevolution[J].Biochimica et Biophysica Acta Bioenergetics,1987,890（2）：151-159.[6]KO Murakami,KENTARO Ifuku,ATSUSHI Takabayashi,etal.Functional dissection of two Arabidopsis PsbO proteins Ps-bO1and PsbO2[J].FEBS Journal,2005,272（9）：2165-2175. [7]张素萍,屠铁成,翁俊,等.Mn簇对光系统Ⅱ光抑制产⽣超氧⾃由基的影响[J].科学通报(ZHANG Su-ping,TU Tie-cheng,WENG Jun,et al.The influence that Mn cluster canproduce free oxygen radical in photosystemⅡin the conditionof photoinhibition[J].Chinese Science Bulletin),2001,17(46)：1431-1434.[8]杨传平,王⽟成,刘桂丰,等.应⽤SSH技术研究NaHCO3胁迫下柽柳基因的表达[J].遗传学报(YANG Chuan-ping,WANGYu-cheng,LIU Gui-feng,et al.Study on gene expression ofTamarix under NaHCO3stress using SSH technology[J].Jour－nal of Genetics and Genomics),2004,3(9)：926-933.[9]SUGIHARA K,HANAGATA N,DUBINSKY Z,et al.Molecu-lar characterization of cDNA encoding oxygen evolving en-hancer protein1increased by salt treatment in the mangrove,Bruguiera gymnorhiza[J].Plant and Cell Physiology,2000,41（11）：1279-1285.[10]POPELKOVA H,BOSWELL N,YOCUM C.Probing the to-pography of the photosystemⅡoxygen evolving complex：PsbOis required for efficient calcium protection of the manganesecluster against dark-inhibition by an artificial reductant[J].Pho-tosynthesis Research,2011,110(2)：111-121.[11]BRICKER T M,FRANKEL L K.Auxiliary functions of the PsbO,PsbP and PsbQ proteins of higher plant PhotosystemⅡ：acritical analysis[J].Journal of Photochemistry and PhotobiologyB,2011,104(1-2)：165-178.[12]SONOYAMA M,MOTOKJ A,OKANIOTO G,et al.Secondary structure and thermostability of the phosystemⅡmanganese-stabilizing protein of the thermophilic cyanobacterium,Syne-chococcus elongates[J].Biochimica et Biophysica Acta,1996, 1297（2）：167-170.[13]SLOWIK D,ROSSMANN M,KONAREV P V,et al.Structural investigation of PsbO from plant and cyanobacterial photosys-temⅡ[J].Journal of Molecular Biology,2011,407(1)：125-137.[14]ROOSE J L,YOCUM C F,POPELKOVA H.Binding stoi-chiometry and affinity of the manganese-stabilizing protein af-fects redox reactions on the oxidizing side of photosystemⅡ[J]. Biochemistry,2011,50(27)：5988-5998.206。

鱼类PPARs的克隆表达及其研究进展随着人们生活水平的提高，鱼类已经成为人们餐桌上的一道美味佳肴。

鱼类的养殖和捕捞面临着诸多挑战，其中包括饲料成本、疾病防控、饲料效率等问题。

为了解决这些问题，人们不断地进行鱼类的遗传改良和营养调节研究。

在这些研究中，PPARs（peroxisome proliferator-activated receptors）作为重要的调控因子，其在鱼类的生长发育、营养代谢、免疫调节以及生殖功能等方面发挥着十分重要的作用。

本文将对鱼类PPARs的克隆表达及其研究进展进行综述和讨论。

一、PPARs的生物学功能PPARs是一组受体转录因子家族，包括α、β/δ和γ三个亚型。

它们在调节脂质代谢、糖代谢、炎症反应和细胞增殖等生理过程中发挥着重要作用。

在鱼类中，PPARs也具有类似的生物学功能。

研究表明，PPARs在鱼类的脂质代谢和肌肉生长中起着重要作用，对鱼类的生长发育具有显著影响。

PPARs还参与调节鱼类的炎症反应和免疫功能，对鱼类的抗病能力起到重要作用。

对鱼类PPARs的研究不仅可以深化对鱼类生理和生长发育的认识，还可以为鱼类的遗传改良和疾病防控提供理论依据。

二、鱼类PPARs的克隆表达近年来，随着分子生物学和生物技术的发展，人们对鱼类PPARs的克隆表达进行了深入研究。

2007年，樊永治等人首次从罗非鱼（Oreochromis niloticus）中克隆表达了PPARα和PPARγ基因。

在随后的研究中，来自不同种类的鱼类中的PPARs基因也相继被克隆表达，包括鲤鱼、鲈鱼、大黄鱼等。

通过对这些基因序列进行比较和分析，人们发现鱼类PPARs的结构和功能与哺乳动物中的PPARs存在着相似性，但也存在着一定的差异。

这些差异可能与鱼类的生活习性、环境适应能力和免疫功能等方面有关。

1. 营养调节研究鱼类是以鱼粉、鱼油为主要食物来源，因此脂质代谢对鱼类健康和生长发育具有重要影响。

研究发现，PPARs在鱼类脂质代谢和肌肉生长中发挥着重要作用。

卵形鲳鲹TLR3信号通路相关基因的克隆与表达分析先天免疫系统是机体抵御病原入侵的第一道保护屏障,其发挥作用依赖于PRRs对PAMPs的识别。

TLRs是PRRs中一个重要家族,属于I型跨膜蛋白,通过识别不同的PAMPs,激活依赖MyD88或TRIF信号通路。

TRIF信号通路始于TLR3识别PAMPs,随后募集并活化衔接蛋白TRIF,激活TBK1促使IRF3/7磷酸化,诱导IFN-β表达。

活化的TRIF还可招募TRAF6,激活NF-κB,上调促炎细胞因子的表达水平,发挥免疫效应。

卵形鲳鰺是我国南方地区重要的海水养殖品种,随着养殖规模的扩大,导致传染性疾病多发,严重影响着卵形鲳鰺养殖业的发展。

鉴于TLR3信号通路在先天免疫中的重要作用,开展卵形鲳鲹TLR3鲹(TroTLR3)及其信号通路相关基因(TroTRIF、TroTRAF6和TroTBK1)的研究,将为病害防治以及抗病品种选育提供理论支撑。

本研究获得了TroTLR3信号通路相关基因的全长cDNA,应用生物信息学方法预测上述基因的功能位点、三维结构;分析遗传进化规律;检测其在健康鱼体组织中的表达模式;探讨刺激条件下,免疫相关组织和非免疫相关组织中4个基因的表达规律;构建了4个基因的原核表达和真核表达重组质粒。

主要研究结果如下:1、应用RT-PCR和RACE-PCR技术克隆TroTLR3 TroTLR3、TroTRAF、和TroTBK1基因,获得全长cDNA,长度分别为3415 bp、2297 bp、2280 bp和2482 bp。

分别包含2772 bp、1770 bp、1716 bp和2172 bp的ORF,相应编码923、589、573和723个氨基酸残基。

蛋白结构预测显示,TroTLR3具有11个LRR基序、3个LRR-TYP基序、1个LRR-CT基序、1个TM和1个TIR结构域；TroTRIF含有1个与TLRs类似的TIR结构域;TroTRAF6包含4个特征功能区:RING、Zf-TRAF、CC和MATH;TroTBK1 由KD、ULD和CC三个结构域构成。