第五章基因工程载体

蛋白合成
结构,阻止Tet通过细胞膜
12
氨苄青霉素 抗性基因
复制起点
13
常用的质粒载体
1. pBR322
2. ｐＢＶ220载体是我国预防医学科学院 病毒研究所自行构建的大肠杆菌温控表达 载体。
3. pUC系列:如pUC118、pUC119，两者 之间的差别在于多克隆位点不同。
14
15
16
17
• 属松弛型质粒，拷贝数较多。
40
41
农杆菌Ti质粒
• 根癌农杆菌含有一种内源质粒，当农杆菌 与植物接触时，这种质粒会引发植物产生 肿瘤，故名Ti质粒（tumor inducing plasmid）。
• Ti质粒为双链环状DNA分子，200～250Kb 之间。
• Ti质粒进入植物细胞的只是一小部分，约 25kb，称为T-DNA（transfer DNA）。
38
科斯质粒载体 （cosmid）
又称粘粒载体，简称粘粒。 环形双链DNA分子，一般为4～6Kb。 该载体含有λDNA的cos序列（不少于280个 bp）和pBR322质粒的序列。该载体转化效率高。 可容纳高达45kb的外源DNA。以感染方式进入宿 主细胞,在宿主体内象质粒那样复制.
39
• 粘粒载体可像质粒一样在细菌中繁殖，有 的（pWE15/16）可以在哺乳动物中繁殖。 又能像λDNA一样体外包装，并高效导入受 体细胞。
42
• T-DNA两端各有一个25bp的正向重复序列， 在不同的Ti质粒中是高度保守的，该序列对 于T-DNA的转移和整合是不可缺少的。
• 利用大肠杆菌质粒与T-DNA的部分序列重 组，构建Ti质粒克隆载体，可用于植物细胞 的基因转移。
43
第三节 酵母细胞基因工程载体
酵母是最简单的单细胞真核生物。 酵母可对表达的多肽链进行加工和 修饰，如二硫键的正确形成、糖基化、 除去N－端的甲硫氨酸等。
抗性基因
56
病毒-质粒载体
• 病毒的早期区段和复制起点+大肠杆菌的质 粒分子重组而成。
例如：pC10＝早期区段和复制起点（多瘤 病毒）＋质粒pBR322的部分区段 这种载体既可在大肠杆菌中复制，也可在 哺乳动物细胞中复制，称之为穿梭载体。
57
改造后的病毒优缺点
优点：
1.不需病毒颗粒的包装过程，故可插入较大长 度的DNA片段。
• 形态
– 个体小，需用电子显微 镜观察
– 蝌蚪形、微球形和丝形
The black bars are size bars representing 100 nm.
25
26
27
用作克隆载体的噬菌体有两类：一类是λ 噬菌体，另一类是M13噬菌体。
野生型λ噬菌体经过改造，已衍生出100多 种克隆载体。 λ噬菌体载体分为插入型和替换 型(置换型)两类。
35
M13噬菌体
• 单链DNA,基因组含6407个碱基.经过基因改 造后，形成M13mp系列。
• 可容纳远大于自身基因组的外源DNA,(7倍). • M13噬菌体感染细胞后,不裂解宿主细胞,但
妨碍宿主细胞的生长,因此可见培养平板上 的混浊噬菌斑.
36
噬斑
37
• 单链的M13噬菌体（＋）进入受体菌后，以 自身为模板，复制出互补链（－），成为 双链的结构，称为复制型DNA。复制型 DNA在细胞内可达200个拷贝。此时， （＋）链被特异的蛋白质阻断，不再生成 新的（－）链。只能生成新的（＋）链。 （＋）链DNA被壳蛋白包装组成病毒颗粒， 挤出宿主细胞。
19
例如加装一段编码 Ile-Glu-Gly-Arg寡肽序 列的人工接头片断，该片断可被具有蛋白 酶活性的凝血因子Ⅹa切割，从Arg后切开。 目的蛋白中出现此种序列的可能性极小， 因此该方法用途广泛。
20
QIAexpress 6His表达系统
• 重组蛋白质的末端带有6个组氨酸残基，对 带有Ni离子的层析介质有高度的亲和力，易 于纯化。
抑菌剂,与50S结合,干扰 编码乙酰转移酶,使氯霉素
蛋白质合成
乙酰化失活
卡那霉素（Kan） 杀菌剂,与70S结合,mRNA 编码氨基糖苷磷酸转移酶,
发生错读
修饰Kan失活
链霉素（Sm）
杀菌剂,与30S结合,mRNA 编码特异修饰酶 发生错读
四环素（Tet）
抑菌剂,与30S结合，阻止 编码特异蛋白,修饰细菌膜
目前应用较广的是EMBL系列、λgt系列和 Charon系列等。
28
λ噬菌体 （lambda phage)
λ噬菌体是可以感染细菌的病毒，是大肠 杆菌的温和型噬菌体。由外壳蛋白与一个 48.5kb的双链线状DNA分子组成。经过改造形 成的λ噬菌体载体有较高的转化效率。
29
在λ噬菌体DNA分子双链的5’端，各有 一段由12个核苷酸组成的互补的单链凸出序 列，即通常所说的黏性末端。在寄主细胞内， 会通过黏性末端的互补作用，形成环型双链 DNA分子。这种由黏性末端结合形成的双链 区段称为cos位点。（cos : cohensive end site)
优点：1.感染率高；2.拷贝数高；3.转录产物 高；
缺点：1.宿主范围窄；2.最终导致感染细胞死 亡； 3.制备耗时，成本较高。
55
SV40病毒载体的改建 病毒的部分序列＋质粒的部分序列
如PSV2 包括 病毒的复制起始区、早期启动子、
增强子序列、部分t抗原基因 pBR322的复制起始区、氨苄青霉素
GAL、GAL10（半乳糖激酶）
PHO5（碱性磷酸酶）
ADH （醇脱氢酶）
TP1 （丙糖磷酸异构酶）
PGK （磷酸甘油酸激酶）
GAP （磷酸甘油醛脱氢酶）
SUC （蔗糖酶）
49
注释：细胞内某些蛋白质丰度较高，如 PGK （磷酸甘油酸激酶）、GAP （磷酸 甘油醛脱氢酶），各占细胞总蛋白的5%， 属于高含量的蛋白质，它们的启动子为强 启动子。
3
第一 节. 质粒
Plasmid 质粒是存在于细菌细胞染色体外、 能自主复制的小分子环状双链DNA分子。 又称为cccDNA（Covalently Closed
Circular DNA）。
4
野生型质粒的大小一般在2-200Kb 基因工程常用者在2-4Kb之间
• 质粒并不是细菌生长所必须的，但可为宿 主执行一定的遗传功能，如抗生素的抗性、 重金属离子的抗性、细菌毒素的分泌等。
第五章基因工程载体
载体类型
基因工程所用的载体都经过人工重新构建
• 细菌质粒载体 • 噬菌体衍生载体 • Cosmid载体（粘粒） • 噬菌体M13衍生载体 • Phagemid载体 • 酵母质粒载体 • 真核病毒载体
2
克隆载体与表达载体 克隆载体：携带外源DNA进入受体细胞并 使外源DNA大量扩增。 表达载体：表达外源基因编码的蛋白质， 载体克隆位点的上游应含有启动子，下游 含有转录终止序列。
λ噬菌体上有56种限制性内切酶的识别 位点，约300余切点。比如BamHI分别在第 5505、22346、27972、34499和41732处 有识别位点。
32
λ噬菌体的生长途径
λ噬菌体有溶原和溶菌两种生长途径。
溶原生长途径是指λ噬菌体的DNA整合 在宿主染色体上，随宿主染色体的复制 而复制。以原噬菌体的形式潜伏起来。 一旦宿主细胞处于某种条件下时， λ噬 菌体的DNA脱离染色体，重新进入溶菌 生长途径。
5
质粒 (plasmid)
6
1 .质粒类型: 严紧型质粒(stringent plasmid)
1-5个拷贝/细胞
松弛型质粒(relaxed plasmid): 数十个/细胞 质粒在细胞中的拷贝数有时与
寄主的种类有关。
7
2. 质粒载体必须具备的条件
（1）分子量相对较小，能在细菌内稳定存 在，有较高的拷贝数。
当使用大肠杆菌做为宿主细胞时，多使用 抗生素抗性作为筛选标志。由于酵母菌对许 多抗生素不敏感，故需要其他的筛选标志。 野生型基因：URA3（尿嘧啶）、LEU2、HIS3、 TRP1 （色氨酸） 这些基因可补偿酵母菌细胞中某一种特定的 代谢缺陷（营养缺陷）
48
2 .启动子
含有可被RNA聚合酶II识别的酵母启动子
33
• 溶菌生长是指λ噬菌体在宿主细胞中黏性末 端连接，成为环形DNA分子，借用宿主细 胞的体系，合成病毒包装所需的外壳蛋白， 新复制的λDNA与外壳蛋白包装成新的病毒 颗粒。宿主细胞膜在R蛋白和S蛋白的作用 下破裂，释放出大量子代λ噬菌体颗粒，感 染新的细胞。
34
λ噬菌体的生活史
溶菌生长途径 (lysis pathway) 溶源菌生长途径 (lysogenic pathway)
30
3‘ GGGCGGCGACCT
CCCGCCGCTGGA 3’
在黏性末端的12个碱基中，有10个是 GC。通过碱基配对线性分子环化起来， 由此形成的双链区，叫做cos位点。
31
λ噬菌体基因组含50余个基因，功能相 近的基因聚集成簇。有些基因对λ噬菌体的 生长不是必须的，可以被外源DNA片段取 代。
似复制子结构及特征的两种不同质粒，不 能稳定的存在于同一受体细胞内，这种现 象称作质粒的不相容性。
10
3. 质粒载体的选择性标记
• 抗菌素抗性 • 新陈代谢特性
11
抗菌素名称
抗菌素作用方式
宿主菌抗性机理
氨苄青霉素（Amp） 干扰细菌细胞壁合成 Amp
编码-内酰胺酶,切割 -内酰胺环
氯霉素（Cml）
（2）具有一个以上的遗传标志，便于对宿 主细胞进行选择，如抗生素的抗性基因， β-半乳糖苷酶基因（Lac Z）等。
8
（3）具有多个限制性内切酶的单一切点，便 于外源基因的插入。如果在这些位点有外 源基因的插入，会导致某种标志基因的失 活，而便于筛选。