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实验五 PCR引物设计及评价【实验目的】1、掌握引物设计的基本要求，并熟悉使用Primer premier5.0软件进行引物搜索。
2、掌握使用软件oligo6.0对设计的引物进行评价分析。
【实验原理】一、引物设计原则聚合梅链式反应（polymerase chain reaction）即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA 序列的方法，故又称基因的体外扩增法。
PCR技术已成为分子生物学研究中使用最多，最广泛的手段之一，而引物设计是PCR技术中至关重要的一环，使用不合适的PCR引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。
现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行，可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。
引物设计原则如下：1、引物应在序列的保守区域设计并具有特异性。
引物序列应位于基因组DNA的高度保守区，且与非扩增区无同源序列。
这样可以减少引物与基因组的非特异结合，提高反应的特异性；2、引物的长度一般为15-30 bp。
常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应；3、引物不应形成二级结构。
引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4.5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行；4、引物序列的GC含量一般为40-60%。
过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大；5、引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。
Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)；6、引物5'端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
可根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。
7、引物3’端不可修饰。
引物3'端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。
Premier5携手oligo，共同设计PCR引物作者：解螺旋.子非鱼如需转载请注明来源：解螺旋·医生科研助手导语一直以来，Premier5和Oligo软件可以说是设计PCR引物的经典存在，那么有着强大引物自动搜索功能的Premier5遇到评价分析能力强悍的oligo，势必会碰撞出巨大的火花，则今天小鱼就把PCR 引物设计的经典套路介绍给大家。
当然，任性到连软件都不想下载的小伙伴们可回复primer，即可查看在线设计PCR引物的三种方法。
用Primer Premier 5搜索引物1.以小鼠的IL-17为例，进入NCBI界面,选择Nucleotide后，输入IL-17，点击search.然后选择第三个选项——人类IL-17的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，选定目的序列。
2.打开Primer Premier5软件，点击菜单栏File|New|DNA Sequence，在出现的对话框里黏贴目的序列，并在paste对话框里选择As Is，点击OK。
3.点击Primer，弹出菜单后点击search按钮。
在弹出的Search Criteria中，选择PCR primers，Pairs 参数，并选择所需PCR产物长度，点击OK。
在弹出的search progress菜单中，点击OK。
4.在搜索出的结果列表里选择Rating值高，bug较少的引物#1，在Primer Premier中选择S（正义链）/A（反义链），点击edit primer，将所得引物改成为Rating值为100，无bug的引物，即无发夹（Hairpin）、无二聚体（Dimer）、无错配（False Priming）和交叉配对（Cross Dimer）的引物。
5.点击菜单栏中Edit∣Copy∣Sense Primer/Anti-sense Primer，即可得到设计的引物。
Sense Primer:5' TCAGACTACCTCAGCCGTTCC 3'Anti –sense Primer: 5' GGTGGTCCATCTTTCCCT 3' 用Oligo验证评估引物（回复“Oligo”，可查看用oligo软件设计引物的文章）1.打开Oligo界面如下：单击菜单栏里File∣New Sequence可打开以下窗口。
一、实验目的1. 掌握引物设计的原理和方法。
2. 学习利用生物信息学工具进行引物设计。
3. 了解引物在PCR实验中的应用。
二、实验原理引物是一段单链DNA或RNA，作为PCR反应的起始模板，与模板DNA链互补结合，从而在PCR反应中引导DNA的复制。
引物设计是PCR实验成功的关键因素之一。
三、实验材料1. 生物信息学工具：Primer Premier 5.0、Primer BLAST、OligoCalc等。
2. 实验样品：待扩增的DNA模板。
3. 其他：PCR试剂、DNA序列、引物合成等。
四、实验步骤1. 选择目标基因序列根据实验目的，选择合适的基因序列。
在本实验中，以某基因的cDNA序列为模板。
2. 利用生物信息学工具进行引物设计（1）打开Primer Premier 5.0软件，输入基因序列。
（2）设置引物设计参数，如：引物长度、Tm值、GC含量、引物间距离等。
（3）进行引物设计，得到多个引物序列。
（4）利用Primer BLAST和OligoCalc等工具对设计出的引物进行筛选，排除同源序列和二级结构。
3. 引物合成将筛选出的引物序列提交给引物合成公司，合成引物。
4. PCR实验（1）配制PCR反应体系，包括：引物、模板DNA、dNTPs、DNA聚合酶等。
（2）设置PCR反应程序，如：预变性、变性、退火、延伸等。
（3）进行PCR反应，观察扩增结果。
五、实验结果与分析1. 引物设计结果根据实验目的，设计出以下引物：上游引物：5'-ATCGTACGCTAGGCTG-3'下游引物：5'-CGTCTGACGACGTCAGT-3'2. PCR扩增结果通过PCR实验，成功扩增出目标基因片段。
六、实验结论1. 通过生物信息学工具进行引物设计，可提高引物设计的准确性和效率。
2. 合适的引物是PCR实验成功的关键，设计引物时需考虑多种因素。
3. 本实验成功设计并合成引物，为后续的PCR实验奠定了基础。
1基金项目2辽宁省科技厅博士启动基金(20021072)=作者简介>任亮(1978-),男,辽宁省葫芦岛市人,在读硕士研究生,主要研究方向为分子生物学。
利用软件Primer Premier 510进行PCR 引物设计的研究任 亮,朱宝芹,张轶博,王海燕,李尘远,苏玉虹,巴彩凤(锦州医学院辽宁省高校分子细胞生物学与新药开发重点实验室,辽宁 锦州 121001)=摘要>目的 运用Pr imer Premier 510软件设计PCR 引物,并且检验所设计引物的P CR 扩增效率和特异性。
方法 运用Primer Pr emier 510软件设计16对猪和犬的PCR 扩增引物,通过PCR 扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测实验结果。
结果 在所设计的16对引物中有8对P CR 扩增特异性好且效率高,成功率50%。
但是,其中早期设计引物12对只有4对成功,后期设计引物4对全部成功。
结论 从引物设计的过程中可以看到一种趋势-后期引物设计的成功率远远高于早期。
这表明我们在引物设计方面正在逐步成熟,特别是运用比较基因组学定位的原理在分离新基因的引物设计方面积累了较多的经验。
=关键词>PCR 引物设计;软件P rimer Premier 510;P CR =中图分类号> Q 524=文献标识码> A=文章编号> 1000-5161(2004)06-0043-04T he Research of Applying Primer Premier 510to Design PCR PrimerREN Liang,ZHU Bao-qin,ZHANG Yi-bo,WANG Hai-yan,LI Chen-yuan,SU Yu-hong,BA Cai-feng(Key Laboratory of Molecular Cell Biolog y and New Drug of Liaoning Province,Jinzhou Medical College,Jinzhou 121001China)=Abstract >Objective With the help of Primer Premier 510to design PCR primer and verifying the efficiency and speciality of PCR about these primers 1Methods Sixteen pairs of primers that w ould be amplified in Genomics of pig and dog w ere designed by Primer Premier 5101The results of PCR w ould be investig ated through agarose g el electrophoresis 1Results Eight pairs of primers in all designed suc -ceeded in the efficiency and speciality of PCR,the ratio of success w as 50percent 1T he tw elve pairs of primers w hat were designed in the forepart of the ex periment were only four to amplify better 1How -ever,the four pairs of primers desig ned in the anaphase all succeeded 1Conclusions There is a trend that can be recognized in the process of designing primer 1Namely,the forepart is far more than the anaphase in the ratio of success to desig n primer 1It is indicated that our technolog y to design primer is further professional 1Moreover,the most important is that the technique route of using the com para -tive g enom ics to isolate new gene is farther comprehended and perfected and placing a direction at next experiment 1=Key words >desig n primer;Primer Prem ier 510;PCR 自从1985年美国PE-Cetus 公司的人类遗传研究室Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应(polym erase chain reaction;PCR)以来,PCR 已经成为了分子生物学领域最基本也是最重要的技43锦州医学院学报J Jinzhou M ed College 2004Dec1,25(6)术手段之一。
利用软件PrimerPremier5.0进行PCR引物设计的研究利用软件PrimerPremier5.0进行PCR引物设计的研究引言：PCR (Polymerase Chain Reaction) 是一种广泛应用于分子生物学和基因工程领域的技术，通过引物（primers）的选择和设计，能够扩增特定的DNA片段。
PCR引物设计的质量和合理性对PCR扩增的成功与否起着至关重要的作用。
PrimerPremier5.0 是一款被广泛使用的引物设计软件，具有许多功能，可以辅助研究人员选择高质量的引物。
本文旨在研究和探讨利用PrimerPremier5.0软件进行PCR引物设计的方法和优势。
方法：1. 引物设计目标：在PCR实验中，为了获得准确和高效的扩增结果，引物设计时需要考虑以下几个因素：- 引物长度：通常情况下，引物的长度应在18到30个碱基对之间。
- GC含量：GC含量应尽量控制在40%到60%之间，过高或过低都会影响引物的特异性和扩增效率。
- 引物间的互补性：引物之间应避免互补性或三联体结构的形成，以避免非特异性扩增。
- 引物的熔解温度(Tm)：引物的Tm值应接近，以确保特异性扩增。
2. PrimerPremier5.0软件的使用：- 安装并启动PrimerPremier5.0软件。
- 导入所需扩增区域的目标序列。
- 在软件中设置引物的参数，如长度、GC含量和Tm值等。
- 执行引物设计程序，软件会根据设置的参数，自动在目标序列中搜索合适的引物。
结果与讨论：通过PrimerPremier5.0软件的使用，可以高效地选择到符合设计要求的引物。
软件会根据设定的参数，自动搜索并筛选出多个候选引物。
1. 引物长度：为了确保引物能够与模板DNA进行特异性结合，通常将引物长度设定在18到30个碱基对之间。
经过软件筛选后，可得到一组长度适当的引物。
2. GC含量：合适的GC含量可以提高引物的稳定性和特异性。
软件会自动根据设定的GC含量范围，筛选出具有适当GC含量的引物。
primer5和Oligo的引物设计、使用方法吴乃虎的《基因工程原理》一、引物设计step by step1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。
2、用Primer Premier5搜索引物①打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。
点击Primer，进入引物窗口。
②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。
在Search Parameters里面，可以设定相应参数。
一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～500bp.③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。
④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。
此窗口中需要着重查看的包括：T m应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的T m值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。
该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。
若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。
最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。
PCR引物设计及软件使用技巧张新宇，高燕宁*（中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤研究所，北京100021）摘要：本文旨在介绍使用软件设计PCR引物的技巧。
在PCR引物设计原则的基础上，详细介绍了两种常用引物设计软件的基本使用方法，并对其各自的优缺点进行了比较。
一般性引物自动搜索可采用“Premier Primer 5”软件，而引物的评价分析则可采用“Oligo 6”软件。
关键词：PCR；引物设计中图分类号：Q524To design PCR primers with Oligo 6 and Primer Premier 5Zhang Xinyu, Zhu Youkang, Gao Yanning(Cancer Institute, Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing,100021,China) Abstract: The skill of PCR primer design with software is introduced in this paper. Based on the principal of PCR-primer design, the usage of two kinds of popular primer-design software was reviewed detailedly, including their merit, demerit and usage skills. It is recommended that to use Premier Primer 5 does the usual automatic primers search, but Oligo 6 primers analysis.Key Words: PCR primer; design; usage skill;自从1985年Karny Mullis发明了聚合酶链式反应以来，PCR技术已成为分子生物学研究中使用最多、最广泛的手段之一[1]，而引物设计是PCR技术中至关重要的一环。
1.安装软件Primer premier5.0。
程序下载：Primer Premier 5.0 /Soft/2005/114.htm 2.程序中双击打开3.点FILE---NEW—DNA SEQUENCE如图所示。
4.输入目的基因片段，可以复制后用ctrl+V键拷贝到栏内，后应加数个N以备后续设计时加酶切位点及保护碱基，如图所示。
5.选中enzyme图标，将所选质粒上的多克隆酶切位点加入左栏6.选中OK键，分析目的基因中所含的酶切位点，选插入位点时就应排除这些酶7.选中primer图标，点S图标，edit primer,开始设计正义链。
8.软件默认引物为25个碱基9.可将鼠标点在设计框的3端从右向左删除7－9个碱基，保留16－18个配对即可10．在引物的5端加入选好的酶切位点并在其左侧加3个保护碱基，入该图加入HIND III酶切位点及TTA保护碱基，完成后点analyze，认为可以后点OK。
11.选中左上角A图标，用鼠标拉动滑块将待选引物放至目的基因末端。
如图，选中EDIT PRIMERS图标，开始设计反义链。
12.从3端删除7－9个碱基同正义链。
13.将酶切位点加在5端，应将产品目录所示的酶切位点序列从右至左加入（注意不要加反）如图加入BamH I酶切位点及CGC3个保护碱基。
完成后点analyze，认为可以后点OK。
14.最后分析结果如图，反义链的FALSE PRIMING可以不考虑，RATING表示引物评分也可以不考虑，主要看Tm值正义链和反义链相差不应超过3度。
GC含量不应超过60％15.该软件有个缺点，不能保存分析结果，只能选择打印16.如果设计RT-PCR检测的引物就如下所示。
同上输入目的基因片段，选SEARCH 图标，选择参数，一般选PCR primers---both—100至250个碱基，引物长短20＋/-2，search parametere中的参数可以不选，为默认设置。
点OK。
使用Oligo 6和Primer Premier 5.0等软件设计PCR引物张新宇（中国医科院肿瘤研究所，北京100021）电子邮件: ********************在当今分子生物学研究中，PCR技术已成为使用最多，最广泛的技术之一。
而引物设计是PCR技术中至关重要的一环。
在PCR扩增以前，一般模板序列已被全部或部分确定。
要想扩增出理想的目的片断，一般都得通过正确设计PCR引物。
也有的人不经过设计直接取模板序列的两个片段作为引物，这样很可能导致实验失败，如扩增出多条带（引发错配所致），不出目的带或出目的带很弱（引物引发效率低下），引物二聚体带（引物与引物之间形成稳定二聚体）等等。
现在PCR引物设计都通过计算机软件进行。
生物信息学发展至今日，具有引物设计功能的软件有很多，其中大部分是免费软件，可直接从网上下载，安装并运行。
这类软件大都简单易用，但其引物设计功能一般不很强，通过它们设计的引物常常不尽如人意，而专门进行引物设计的商业版软件功能强大，但使用起来不太容易。
本文就这一问题进行探讨。
引物设计的原则引物设计有几条基本原则：首先引物要跟模板紧密结合，其次引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在，再次引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应(即错配)。
围绕这几条基本原则，设计引物需要考虑诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度（product length），序列Tm值(melting temperature)，ΔG值(internal stability)，引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin），错误引发位点（false priming site），引物及产物GC含量（composition），有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。
以使用Oligo软件分析设计引物为例，笔者总结出以下的要点：1.引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq酶的最适温度。
2.引物3’端的序列要比5’端重要。
引物3’端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高。
另外引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。
5’端序列对PCR影响不大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
3.引物的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大。
4.引物所对应模板序列的Tm值最好在72℃左右。
5.ΔG值(自由能)反映了引物与模板结合的强弱程度。
一般情况下，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且不要超过9（ΔG 值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。
6.可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高，错误引发的引发率一般不要高过100，如此可保证不出非目的产物的假带。
7.引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致PCR正常反应不能进行，与二聚体相关的一个参数是碱基的分布，3’端的连续GGG或CCC会导致错误引发。
8.对引物的修饰一般是增加酶切位点，应参考载体的限制酶识别序列确定，常常对上下游引物修饰的序列选用不同限制酶的识别序列，以有利于以后的工作。
值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。
有的模板本身条件较差，比如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；有时PCR产物要作为克隆对象插入到载体中表达，因此PCR引物设计的可选择度很低。
遇到这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件，这时，使用自动搜索引物及正确地评价引物可使研究人员对实验心中有数。
引物的自动搜索和评价分析带有引物设计功能的软件有很多，大都是For Windows版本的。
在此特别推荐两个专门性的引物设计软件（商业版）：Primer Premier 5（以下简称Premier）和Oligo 5.0/6.22 软件的引物设计功能主要体现在两个方面，首先是引物分析评价功能，该功能只有少数商业版软件能够做到，其中以Oligo 软件最优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果也不尽相同。
据笔者的经验，自动搜索功能以Premier 为最强且方便易用，Oligo软件其次，其他软件如Vector NTI Suit, Dnasis, Omiga, Dnastar都带有引物自动搜索功能，但搜索结果不是十分理想。
当然要想保证得到效果理想的引物，在自动搜索的基础上，还要对引物辅以人工分析，以得到最佳设计的引物。
因此，笔者认为引物设计软件的最佳搭配是Oligo 和Premier 软件一起，以Premier进行自动搜索，Oligo进行分析评价，如此可设计出成功率很高的引物。
笔者曾以此搭配给多人设计引物，速度又快效果又好。
Primer Premier 5.0的使用技巧1.功能简介Premier的主要功能分四大块，其中有三种功能较常用，即引物设计()，限制酶切点分析()，基元查找()。
另个功能是同源性分析（），并非Premier的特长，在此略过。
该软件还有别的一些功能，如序列”朗读”，DNA与蛋白序列的互换（），发声提示键盘输入（）等，但其中最优秀的却是能设计简并引物。
简并引物的出现是出于遗传密码的简并性。
有时需要根据一段氨基酸的保守序列反推到DNA水平设计引物。
众所周知，大多数氨基酸（二十种常见结构氨基酸中的十八种）的遗传密码不只一种，因此，由氨基酸序列反推DNA序列时，就遇到部分碱基的不确定性。
这种不确定性因物种或细胞亚结构的不同而异，比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的，甚至植物线粒体与无脊椎动物线粒体以及无脊椎动物线粒体的遗传密码都不尽相同。
Premier可以针对各种不同的遗传密码规律设定不同的DNA和氨基酸的相互转换，这取决于被分析序列的出处。
这样设计出来的引物实际上是多种序列的混和物，在某些位点有所变化，但大部分还是相同的，称之为简并引物。
Primier软件给出八种生物亚结构的不同遗传密码规则供用户选择，有纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear），无脊椎动物线粒体（InvertebrateMitochondrion），支原体（Mycoplasma），植物线粒体（Plant Mitochondrion），原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion），一般标准（Standard），脊椎动物线粒体（Vertebrate Mitochondrion），和酵母线粒体（Yeast Mitochondrion）。
2. 使用步骤及技巧Premier软件的起动并打开一段序列后，界面如下：其主要功能在主界面上一目了然（按钮功能如上述）。
限制酶切点分析及基元查找功能比较简单，点击该功能按钮后，选择相应的限制酶或基元（如-10序列，-35序列等），按确定即可。
常见的限制酶和基元一般都可以找到。
你还可以编辑或者添加新限制酶或基元。
进行引物设计时，点击按钮，界面如下：进一步点击按钮，出现search criteria窗口，有多种参数以调整。
搜索目的（Seach For）有三种选项，PCR引物（PCR Primers），测序引物（Sequencing Primers），杂交探针（Hybridization Probes）。
搜索类型(Search Type)可选择上、下游引物（Sense/Anti-sense Primer）都分别查找(Both)，或者成对查找（Pairs），或者分别以适合上、下游引物为主（Compatible With Sense/Anti-sense Primer）。
另外还可改变选择区域（Search Ranges），引物长度（Primer Length），选择方式（Search Mode），参数选择（Search Parameters）等等。
研究人员可根据自己的需要设定各项参数。
如果没有特殊要求，建议使用默认设置。
然后按，随之出现的Search Progress窗口中显示Search Completed时，再按，这时搜索结果以表格的形式出现，有三种显示方式，上游引物（Sense），下游引物(Anti-sense)，成对显示(Pairs)。
默认显示为成对方式，并按优劣次序（Rating）排列，满分为100，即各指标都能达标（如下图）。
点击其中一对引物，如第1#引物，并把上述窗口挪开或退出，显示Peimer Premier主窗口，如图所示：该图分三部分，最上面是图示PCR模板及产物位置，中间是所选的上下游引物的一些性质，最下面是四种重要指标的分析，包括发夹结构（Hairpin），二聚体（Dimer），错误引发情况（False Priming），及上下游引物之间二聚体形成情况（Cross Dimer）。
当所分析的引物有这四种结构的形成可能时，按钮由变成，点击该按钮，在左下角的窗口中就会出现该结构的形成情况。
一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有，只有。
值得注意的是中间一栏的末尾给出该引物的最佳退火温度，可参考应用。
有时需要对引物进行修饰编辑，如在5’端加入限制酶切点，可点击，然后修改引物序列。
若要回到搜索结果中，则点击按钮。
若要设计简并引物，只需根据源氨基酸序列的物种来源选择前述的八种遗传密码规则，反推至DNA序列即可。
当然，对简并引物的分析不能象一般引物那样严格。
总之，Premier有优秀的引物自动搜索功能，同时可进行部分指标的分析，使用也容易上手，是一个相当不错的软件。
Oligo 6.22使用技巧1.功能简介在专门的引物设计软件中，Oligo是最大名鼎鼎的。
Oligo的使用并不十分复杂，但初学者容易被其复杂的图表吓倒。
Oligo 5.0的初始界面是两个图：Tm图和ΔG图；Oligo 6.22的界面更复杂，出现三个图，加了个Frq图，不知底细的人当然一看就蒙了。
其实Oligo的主要功能集中在Analyze菜单里，只要把它弄懂了，其他的就很简单了。
Oligo的功能比Premier还要单一，就是引物设计。
但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。
Oligo 6.22比Oligo 5.0的改进有，多序列共用引物设计，排除出现频率高的序列片断，搜索功能更加强大细致，改观了界面等等。
使用Oligo自动搜索引物也未尝不可，尤其是6.22版本，引物搜索功能得到大幅提高，但在方便易用上稍不如Premier。
2.使用（以Oligo 6.22为例）Oligo 5.0的安装有个需要注意的地方，安装程序完毕后需要安装一种字体，不然碱基显示不清楚。
