rtpcr实验报告

RNA制备及其鉴定实验目的初步掌握组织总RNA制备的原理及其基本方法，掌握RNA纯度鉴定的基本方法。

实验原理细胞内的RNA通常与蛋白质结合，以核蛋白（RNP）的形式存在。

分离制备RNA时，首先必须破碎细胞，使RNP释放到溶液中并与蛋白质分离，然后将RNA同其他的细胞成分分离开并保证RNA的完整性。

本次实验我们选用了Trizol法分离提取小鼠肝组织的总RNA，Trizol法分离提取的RNA产率高、纯度好且不易降解。

评价RNA质量的标准是RNA的均一性和完整性。

均一的RNA取决于有效的去除RNA提取物中的DNA、蛋白质和其他杂质；完整的RNA取决于最大限度地避免纯化过程中内源性及外源性RNA酶对RNA的降解。

通常采用紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度，纯RNA的A260/A280=2.0，但由于所用的标本不同，此比值有一定的变化，一般在1.8~2.0之间，低于改值表明有蛋白污染，需进一步用酚/氯仿抽提。

RNA的完整性可通过琼脂糖电泳法进行鉴定。

完整的RNA电泳时，28S和18SrRNA经EB染色后，两条电泳条带的显色强度近似为2比1。

本实验中几个重要试剂的作用：Trizol试剂：Trizol的主要成分是苯酚、异硫氰酸胍、十二烷基肌氨酸钠、β-巯基乙醇、醋酸钠、柠檬酸钠。

它的主要作用是1、裂解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚得到释放。

2、使蛋白质变性，有利于DNA和RNA与蛋白质的分离。

3、抑制内源和外源RNase。

氯仿：氯仿的作用有多个方面，一、作为有机溶剂变性蛋白，使其沉淀并通过离心除去。

二、通过变性作用抑制RNase活性；三、通过氯仿把水相里参与的苯酚抽提掉；四、作为溶剂抽提样品中的一些脂溶性杂质（比如油脂、脂溶性色素等），起到一定除杂作用。

异丙醇：异丙醇是沉淀核酸用的，作用和乙醇一样。

只不过用量要比乙醇少。

异丙醇是等体积，而乙醇一般需要2.5倍体积。

在水相很多，离心管容积有限，加不下太多乙醇的时候一般会用异丙醇沉淀。

pcr技术实验报告结果分析PCR 技术实验报告结果分析PCR 技术，即聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），是一种在分子生物学领域广泛应用的强大工具。

通过这一技术，我们能够在短时间内大量扩增特定的 DNA 片段，从而为各种研究和应用提供了极大的便利。

在本次实验中，我们运用 PCR 技术对特定的基因片段进行了扩增，并对实验结果进行了详细的分析。

一、实验目的本次PCR 实验的主要目的是检测样本中是否存在特定的基因序列，并对其进行定量分析。

二、实验材料与方法（一）实验材料1、样本 DNA：从_____中提取的基因组 DNA。

2、引物：根据目标基因序列设计的特异性引物。

3、 PCR 试剂：包括 DNA 聚合酶、dNTPs、缓冲液等。

（二）实验方法1、 PCR 反应体系的配制：按照试剂说明书，将样本 DNA、引物、PCR 试剂等加入到反应管中，配制成总体积为_____μL 的反应体系。

2、 PCR 反应条件的设置：经过多次预实验优化，确定了以下反应条件：95°C 预变性_____分钟；95°C 变性_____秒，＿____°C 退火_____秒，72°C 延伸_____秒，共进行_____个循环；72°C 终延伸_____分钟。

三、实验结果（一）琼脂糖凝胶电泳结果将 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察到了明显的条带。

其中，阳性对照样本显示出了预期大小的条带，而阴性对照样本则没有条带出现。

实验样本中，部分样本出现了与阳性对照相同大小的条带，表明这些样本中存在目标基因序列；而另一些样本则未出现条带，说明其不含目标基因或含量极低。

（二）定量 PCR 结果对于进行定量 PCR 的样本，通过仪器分析得到了每个样本中目标基因的拷贝数。

结果显示，不同样本中目标基因的含量存在显著差异，这可能与样本的来源、处理方式等因素有关。

四、结果分析（一）琼脂糖凝胶电泳结果分析1、阳性对照出现预期条带，说明 PCR 反应体系和反应条件设置正确，实验操作有效。

聚合酶链式反应实验报告篇一：PCR实验报告普通生物学实验报告实验名称：用PCR扩增的方法鉴别不同物种来源的肌肉一、特异性目的片段DNA的扩增（一）实验原理聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，其基本原理为DNA的半保留复制。

PCR技术由①高温变性模板；②引物与模板退火；③引物沿模板延伸这3步反应组成一个循环，通过多次循环反应，目的DNA 得以迅速扩增。

其主要步骤是：将模板DNA置于高温下（通常为93℃-94℃），使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因的两条单链互补结合；热稳定DNA聚合酶（Taq酶)在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板按5’→ 3’的方向延伸，合成互补链。

本实验采用物种特异性引物扩增的方法来鉴定3种不同物种来源的肌肉。

以不同物种来源的动物DNA为模板，用物种特异性的引物进行PCR扩增，只有在模板和引物的物种相对应的情况下才会有特异性条带的出现。

应用此方法，可以特异性地检测样品中痕量的特定DNA成分。

（二）实验步骤按下表将各成分分别加入一做好标记的无菌PCR管中，配制50μl的PCR反应体系，注意酶要最后加，加完后将PCR管放置在冰上。

2.将上述混合液稍加离心，约10s左右。

取下后立即置于PCR仪中，盖紧热盖，定好PCR仪的反应程序，执行扩增程序。

反应程序为：预变性94℃ 5min变性94℃ 5s退火50℃ 5s延伸72℃ 20s后延伸72℃ 5min3.反应结束后，终止程序，将PCR管取出，放置于4℃，待电泳检测。

循环30次二、水平式琼脂糖凝胶电泳法鉴定PCR产物（一）实验原理核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液（pH 8.0-8.3)中，其碱基不解离，而磷酸集团全部解离，核酸分子因而带负电荷，电泳时向正极迁移。

琼脂糖主要是从海洋植物琼脂中提取而来并经糖基化修饰，为一种聚合链线性分子。

RT-PCR原理与实验技术一、知识背景：1、基因表达：DNA RNA Protein单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因104个丝心蛋白mRNA（每个mRNA存活4d，可以合成105个丝心蛋白）共合成109个丝心蛋白。

因此单拷贝基因的mRNA表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。

2、PCR技术(Polymerase chain reaction)：即聚合酶链式反应。

在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。

反应分三步：A、变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA；B、退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。

C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退火引物沿5‘ 3’方向延伸。

以上三步为一个循环，如此反复。

3、逆转录酶和RT-PCR逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链；2、Rnase水解活性：水解RNA:DNA杂合体中的RNA；3、依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.二、RT-PCR的准备：1、引物的设计及其原则：1）引物的特异性决定PCR反应特异性。

因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。

在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA对引物的特异性的影响。

尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。

2）引物设计原则的把握：引物设计原则包括a、引物长度:一般为15～30bp ，引物太短会影响PCR的特异性，引物太长PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最适温度，也影响反应的特异性。

逆转录pcrrt-pcr 为反转录rcr（reverse transcription pcr ）和实时pcr（real time pcr）共同的缩写。

逆转录pcr，或者称反转录pcr(reversetranscription-pcr, rt-pcr)，是聚合酶链式反应(pcr)的一种广泛应用的变形。

在rt-pcr中，一条rna链被逆转录成为互补dna，再以此为模板通过pcr进行dna扩增。

由一条rna单链转录为互补dna(cdna)称作“逆转录”，由依赖rna的dna聚合酶（逆转录酶）来完成。

随后，dna的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖rna的dna聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的pcr。

原先的rna模板被rna酶 h降解，留下互补dna。

rt-pcr的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的rna。

rt-pcr广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种rna的含量。

（检测基因表达的方法，参见northern blot法。

）rt-pcr有时候也会指代实时pcr(real-time pcr)。

为了与逆转录pcr相区别，通常被写作“定量pcr”(quantitative pcr)或者rtq-pcr(real-time quantitative pcr)。

实时pcr 实时pcr(real-time pcr)，属于定量pcr（q-pcr）的一种，以一定时间内dna的增幅量为基础进行dna的定量分析。

real time pcr 的定量使用萤光色素，目前有二种方法。

一种是在ds dna中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅dna序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针（probe）。

real time pcr 与 reverse transcription pcr 相结合，能用微量的rna来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。

这两种rt pcr的组合又被称之为“定量rt-pcr（quantitative rt-pcr）”rt-pcr技术相关试剂oligo: 多聚体，相当于mrna引物amv（m-mlv）：逆转录酶dntp：脱氧核苷酸rnase：rna酶抑制剂pcr buffer：rt-pcr缓冲液mgcl2：2价镁离子pcr各步骤的目的（一）预变性：破坏dna中可能存在的较难破坏的二级结构。

生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：第二实验室生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称总RNA的提取与RT-PCR实验日期2019-11-22 实验地点第二实验室合作者指导老师评分XX 教师签名李某某批改日期2013-06-03 一、实验目的1. 掌握从细胞中提取总RNA的方法2. 熟悉离心机的基本操作3. 掌握RT-PCR基因扩增的原理和过程4. 熟悉电泳法鉴定所得RNA二、实验原理1. 细胞总RNA的提取及定量1)每个细胞内大概有10-5mg RNA（主要有rRNA，tRNA，mRNA三种）2)mRNA 3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)结构，可用oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA 3)对RNA进行分离有异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。

4)目前常用的是Trizol法，能快速地从细胞组织中分离出RNA，适用于小量样品也使用于大量样品5)在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在上层水相中。

6)取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA ，用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质2. 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。

再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达三、材料与方法：以流程图示意材料总RNA的提取RT-PCR1. 微量加样枪，灭菌超薄PCR反应管， 1.基因扩增仪、微量加样枪、灭菌超2. Trizol试剂，氯仿，异丙醇，75%乙醇，无RNase的水或0.5%SDS（溶液均用DEPC 处理过的水配置）薄PCR反应管2.提取的总RNA3.第一链cDNA合成试剂盒（含有逆转录酶、RNA酶抑制剂、缓冲液）4.dNTP mix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2 mmol/L四、结果与讨论：①结果：实验数据、现象、图谱；②讨论：以结果为基础的逻辑推论，并得出结论。

rtpcr实验报告标题：rtpcr实验报告摘要：本实验使用了rtpcr技术对特定基因进行检测，通过分析实验结果，得出了基因表达水平的定量数据。

实验结果表明，该基因在不同条件下的表达水平存在显著差异，为进一步研究该基因在生物学过程中的作用提供了重要参考。

引言：rtpcr（reverse transcription polymerase chain reaction）是一种常用的分子生物学技术，可以用于检测特定基因的表达水平。

通过rtpcr实验，我们可以定量分析基因在不同组织、不同条件下的表达情况，从而深入研究基因在生物学过程中的作用。

材料与方法：1. 样本准备：收集不同组织或细胞系的样本，提取总RNA。

2. 反转录：使用反转录酶将RNA转录成cDNA。

3. pcr扩增：设计引物，进行实时荧光定量pcr扩增。

4. 数据分析：利用实时pcr仪器收集数据，进行定量分析。

结果：通过rtpcr实验，我们得到了不同组织或细胞系中特定基因的表达水平数据。

实验结果显示，在不同条件下，该基因的表达水平存在显著差异。

例如，在刺激条件下，基因的表达水平明显上调；而在抑制条件下，基因的表达水平则显著下调。

这些数据为我们进一步探究该基因在生物学过程中的作用提供了重要参考。

讨论：rtpcr实验结果表明，特定基因在不同条件下的表达水平存在显著差异。

这表明该基因可能在特定生物学过程中发挥重要作用，或者受到外部环境的调控。

进一步的研究可以探究该基因在细胞信号传导、代谢调控等方面的作用机制，为相关疾病的治疗提供理论依据。

结论：通过rtpcr实验，我们成功地分析了特定基因在不同条件下的表达水平。

实验结果表明，该基因在生物学过程中可能发挥重要作用，为进一步研究该基因的功能和调控机制提供了重要参考。

这项研究为深入探究基因在生物学过程中的作用提供了重要的实验基础。

PCR实验报告修订-可编辑PCR实验是一种常见的方法，用于扩增DNA序列并快速产生大量复制。

本次实验旨在使用PCR方法扩增一段目标基因，并进行其分离与纯化。

实验过程样本制备：我们通过口腔拭子获取了一份人口腔黏膜样本，并用生理盐水进行了悬浮。

将样本分装于离心管中，每个离心管内分装0.5ml的样本。

DNA提取：我们使用了商用DNA提取试剂盒，根据生产商的说明书中的步骤进行提取。

通过宏观观察，我们能够确认DNA已成功地提取并洗涤。

PCR反应：我们使用了PCR工作站进行PCR反应，扩增了一段目标基因。

PCR反应条件如下：1个循环，92℃5min，94℃30s，54℃30s，72℃30s，共30次扩增，72℃15min，4℃保存。

反应所需试剂已事先配好，并进行拉链式PCR扩增。

凝胶电泳：PCR反应后，我们进行了凝胶电泳，以检测PCR反应的产物是否与目标基因相关。

我们在1%的琼脂糖凝胶中进行了DNA样品的分离，并在蒸馏水缓冲液中运行凝胶电泳，并评估了PCR反应的产物。

纯化PCR反应产物：我们使用PCR纯化试剂盒，根据生产商的说明书，对PCR反应得到的产物进行了纯化。

最终，我们得到了一份PCR产物的纯化样本。

实验结果PCR反应产品的凝胶电泳分离结果表明，在目标基因区域检测到了一个大小约为300bp 的DNA片段。

电泳图上的PCR反应产品呈现为强烈的单个条带，表明PCR反应产生了目标地位的DNA产物，并且没有杂散的DNA产物。

讨论本实验成功地扩增了一段目标基因，并通过凝胶电泳检测了PCR反应产物的产生。

此外，我们采取了PCR纯化试剂盒，成功纯化了PCR产物，并使其达到了足够的DNA浓度水平。

因此，本实验说明PCR是一种能够成功扩增目标DNA序列的技术，并具有可靠性和重复性。

结论本实验说明PCR技术能够成功地扩增特定的DNA序列，并得到能够纯化和高效工作的PCR产物。

这种技术为研究和应用基因工程提供了有力的工具。

RT-PCR实验方法总结RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。

要求：1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。

2. RT按要求做，一般不会出太大问题。

3. PCR，按常规。

但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。

1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异的下游引物。

如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。

如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？问题：在做RT-PCR遇到一怪现象，即对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来）从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这有关呢？请高手指教！解答：1.RT-PCR有两种做法：条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。

但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PC R的进行，当然也可能是我买的kit不太好。

（promega）。

2.RT-PCR应具备的条件高质量的RNA（保留后可做5‘，3’RACE）；引物的（最好产物短点）；若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度（如果由内标分子更好，但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样）；体系的均一性等。

3.RACE我做过RACE（3’RACE是宝生物的Kit；5‘RACE是Gibico），但现在再进行另一个同源基因的3‘RACE时却怎么也P不出来，这两个基因是由同一对引物扩增出来的，其中一个已经获得了全序列（RACE的方法），而另一个基因的3’UTR却增么也扩不出来，我推测是不是该基因的3‘UTR 太长的缘故，我都快绿了，有无RT-PCR的常用内标b－actin 和GAPDH的使用有选择性吗？比如不同的细胞，不同的刺激。

RTPCR的原理实验步骤及应用概述逆转录聚合酶链式反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，简称RT-PCR），是一种常用的分子生物学实验技术，用于检测和定量分析RNA分子在细胞中的表达水平。

本文将介绍RT-PCR的原理、实验步骤及应用。

原理RTPCR利用逆转录酶（Reverse Transcriptase，简称RT）将RNA模板逆转录为cDNA（complementary DNA），然后通过聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）对cDNA进行扩增，最终得到大量的目标DNA片段。

RT-PCR的基本原理如下：1.逆转录：反转录酶RT利用RNA模板合成与之互补的cDNA。

在逆转录过程中，需要引入一条逆转录引物（反向互补RNA链）作为反转录的起始点。

2.PCR扩增：将逆转录合成的cDNA作为模板，引入一对特异性引物，通过PCR反应进行DNA扩增。

PCR反应分为三个步骤：变性、退火和扩增。

3.变性：将反应温度升高至95°C，使DNA双链变性为两条单链。

4.退火：将反应温度降低至特异性引物的退火温度，使引物与模板序列互相结合。

5.扩增：将反应温度升高至适合DNA聚合酶的活性温度，使DNA聚合酶逆反应合成DNA。

通过多轮的PCR反应，可以扩增出大量的目标DNA片段，其数量呈指数级增长。

实验步骤1. 样品处理首先需要从待检测的样品中提取总RNA，常用的提取方法有酚氯仿法和柱式纯化法。

提取得到的总RNA需要通过比色法或者用分光光度计进行测量，确保样品的质量和浓度。

2. 逆转录反应逆转录反应是将RNA模板转录为cDNA的过程。

需要准备逆转录试剂盒，主要包括逆转录酶、随机引物、dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）和逆转录缓冲液。

按照试剂盒说明书的配方，将总RNA与逆转录试剂混合，进行逆转录反应。

反应结束后，需要进行热灭活，以停止反应。

rt pcr实验报告RT-PCR实验报告引言：RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，用于检测和定量RNA的表达水平。

本实验旨在通过RT-PCR方法分析目标基因在不同组织和条件下的表达情况，从而深入了解其功能和调控机制。

材料与方法：1. 细胞或组织样本：选择不同类型的细胞或组织样本，如肝脏、肺、肌肉等。

2. RNA提取试剂盒：使用RNA提取试剂盒提取样本中的总RNA。

3. 逆转录试剂盒：使用逆转录试剂盒将RNA转录为cDNA。

4. PCR试剂盒：使用PCR试剂盒进行聚合酶链式反应。

5. 热循环仪：使用热循环仪进行PCR反应。

实验步骤：1. 样本处理：将细胞或组织样本收集并保存在合适的条件下，以保持RNA的完整性。

2. RNA提取：按照RNA提取试剂盒的说明书进行操作，提取样本中的总RNA。

3. RNA浓度和纯度检测：使用紫外-可见光分光光度计检测RNA的浓度和纯度，确保提取到高质量的RNA。

4. 逆转录反应：按照逆转录试剂盒的说明书进行操作，将RNA转录为cDNA。

5. PCR反应：按照PCR试剂盒的说明书进行操作，设置合适的引物和反应条件，进行PCR反应。

6. 凝胶电泳：将PCR产物与DNA分子量标准品一同加载到琼脂糖凝胶上，进行电泳分离。

7. 凝胶图像分析：使用凝胶图像分析软件测量PCR产物的带的强度，并进行定量分析。

结果与讨论：通过RT-PCR实验，我们成功地分析了目标基因在不同组织和条件下的表达情况。

以下是实验结果的一些典型示例：1. 基因在不同组织中的表达差异：我们选择了肝脏、肺和肌肉作为研究对象，分别提取了这些组织中的总RNA，并进行了RT-PCR分析。

结果显示，目标基因在肝脏中的表达水平最高，肺次之，肌肉最低。

这表明目标基因在不同组织中的表达存在差异，可能与其功能和组织特异性有关。

2. 基因在不同条件下的表达调控：我们进一步研究了目标基因在不同条件下的表达调控。

RT-PCR实验步骤RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）是一种常用的实验技术，可以在体外合成DNA的互补链。

它广泛应用于分子生物学研究、病毒检测以及基因表达分析等领域。

下面将介绍RT-PCR实验的步骤。

材料准备在进行RT-PCR实验之前，需要准备以下实验材料：1.逆转录试剂盒：包括逆转录酶、引物、缓冲液等。

2.样品：需要包含RNA的样品，如细胞总RNA或组织RNA。

3.质控物：用于验证实验的阴性和阳性对照物。

4.相关试剂：如脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）、MgCl2、RNase抑制剂等。

逆转录反应前处理1.将RNA样品加入无RNase试剂管中，以免被RNase降解。

2.加入逆转录酶、逆转录缓冲液、dNTP、MgCl2和RNase抑制剂，轻轻混合。

反应条件1.设置逆转录反应的温度和时间：通常在50-60摄氏度下反应10-60分钟，以逆转录酶的要求为准。

2.根据逆转录酶的要求进行热变性处理，以停止反应。

PCR扩增准备PCR反应液1.在无RNase的条件下，制备PCR反应液。

组分包括引物、dNTP、PCR缓冲液和PCR酶。

2.在无样品的条件下，混合PCR反应液。

反应条件1.设置PCR反应的循环条件：包括变性、退火和延伸温度，循环次数根据需求而定。

2.在PCR反应过程中收集产物供进一步分析和检测。

结果分析通过PCR扩增获得的产物可以进行各种分析和检测。

1.凝胶电泳：将PCR产物与DNA分子量标准一同在琼脂糖凝胶上进行电泳，通过电泳图观察目标DNA的条带。

2.定量PCR：通过测定PCR反应体系中初始DNA的数量，可以计算出初始样品中的目标DNA的初始数量。

3.实时荧光定量PCR：结合荧光染料和合适的探针，可以实时监测PCR反应体系中目标DNA的扩增过程。

结论RT-PCR实验是一种重要的分子生物学技术，能够在体外合成DNA的互补链。

通过逆转录反应和PCR扩增，可以获得目标DNA的大量复制产物，并通过结果分析方法进行进一步研究。

RTPCR实验方法总结大全.docRT-PCR实验方法总结大全引言逆转录聚合酶链反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR）是一种分子生物学技术，它结合了逆转录酶（Reverse Transcriptase, RT）和聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）两种方法，用于从RNA模板中合成cDNA并进行扩增。

RT-PCR广泛应用于基因表达分析、病原体检测、克隆和基因功能研究等领域。

实验原理逆转录: 逆转录酶将RNA模板转录成cDNA。

PCR扩增: 利用特定的引物对cDNA进行特异性扩增。

实验流程1. 样本准备收集样本，如细胞、组织或血液。

提取RNA，确保纯度和完整性。

2. 逆转录设计并合成特异性的逆转录引物。

将RNA与逆转录引物混合，加入逆转录酶。

在特定温度下进行逆转录反应。

3. PCR扩增设计并合成特异性的PCR引物。

将cDNA与PCR引物、聚合酶、dNTPs等反应体系混合。

进行PCR循环，包括变性、退火和延伸。

4. 结果分析通过凝胶电泳或实时定量PCR（qPCR）分析PCR产物。

根据条带大小或荧光信号判断扩增效果。

实验关键点引物设计引物应具有特异性，避免非特异性扩增。

引物长度通常为18-25个核苷酸。

避免引物二聚体和发夹结构。

逆转录酶的选择选择高保真度和高效率的逆转录酶。

考虑逆转录酶的热稳定性。

反应条件优化优化逆转录和PCR反应的温度、时间和循环次数。

调整反应体系中的Mg2+浓度。

避免污染使用无菌技术操作。

使用负对照和正对照验证实验结果。

数据分析使用适当的软件分析qPCR数据。

通过凝胶电泳分析PCR产物的特异性。

常见问题与解决方案1. 非特异性扩增优化引物设计。

调整Mg2+浓度。

减少循环次数。

2. 低效率逆转录检查RNA质量和完整性。

更换逆转录酶。

3. PCR产物不清晰优化PCR条件。

医学实验pcr检验实验报告标题：PCR检验实验报告引言：PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学实验技术，用于扩增DNA片段，并能够在非常小的样本中检测RNA或DNA的存在。

本报告旨在介绍PCR 检验实验的原理、步骤和结果分析。

一、实验原理：PCR是通过不断重复三个步骤来扩增DNA片段的方法。

这三个步骤是变性、退火和延伸。

首先将待扩增的DNA样本变性，使其双链DNA分离为两个单链DNA。

然后，通过引物（primer）与DNA单链的互补序列结合，使引物与DNA序列配对。

最后，使用DNA聚合酶在引物的指导下合成新的DNA链。

通过不断重复这三个步骤，可以在很短的时间内扩增出大量的特定DNA片段。

二、实验步骤：1. DNA提取：从待检测的样本中提取DNA，常用的DNA提取方法包括酚/氯仿法、热沉淀法等。

2. 反应体系配置：根据实验需求，在试管中配置PCR反应体系，包括DNA模板、引物、酶、缓冲液等。

3. PCR反应：使用热循环仪进行PCR反应，设置好反应的温度和时间，常见的PCR程序一般包括初始变性、循环变性、退火和延伸等步骤。

4. 凝胶电泳：将PCR反应体系中的产物进行凝胶电泳分析，以确定扩增的DNA 片段大小和纯度。

三、实验结果分析：1. 扩增曲线分析：观察PCR反应的扩增曲线，根据曲线形状和峰值大小判断PCR反应的效果。

2. 凝胶电泳结果分析：通过凝胶电泳分析PCR产物，可以确定扩增的DNA片段的大小和数量。

3. 阳性对照和阴性对照：设置阳性对照和阴性对照可以判断PCR反应体系的可靠性和准确性。

结论：PCR是一种常用的分子生物学技术，可以迅速高效地扩增DNA片段。

通过实验原理的介绍和实验步骤的详细说明，我们可以掌握PCR实验的基本操作方法。

实验结果的分析和结论部分，可以根据实际实验情况进行详细的阐述，包括扩增曲线、凝胶电泳结果等。

实验报告的撰写应该科学准确、简明扼要，以便他人能够理解和重复实验。

RT-PCR实验步骤RNA 抽提一，准备工作1，实验器具与材料：（1）移液枪：1ml、200ul、10ul（2）吸头：1ml、200ul、20ul（3）吸头台：放置1ml 吸头的一个，放置200ul 和20ul 的吸头一个（4）EP 管 1.5ml、100ul（5）玻璃研磨器（6）容量瓶：1000ml（7）盐水瓶：100ml（8）15ml 塑料管一个（配75％乙醇用）2，实验器具的处理与准备（1）塑料制品：（包括吸头、EP 管等）将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC 水中（必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水）37℃过夜，然后送至高压 3 次，后在 80℃烘烤箱中烘干（或置于 37℃中 8小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。

（2）玻璃制品：（主要是玻璃研磨器）先泡酸过夜，冲洗干净后，在1‰DEPC 水中泡8 小时左右，37℃烘干，用蒙锡纸包裹送至干烤3 次。

（3）金属制品：（镊子等）先洗干净，再送干烤3 次。

（不需要泡DEPC 水）3，试剂配制和准备：（1）DEPC 水：泡实验器具的DEPC 水的配制：1000ml 双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml 容量瓶中静置4 小时后备用。

配75％乙醇的DEPC 水的配制：100ml盐水瓶内装40ml 双蒸水，加40ulDEPC，37℃过夜，送至高压。

（2）75％乙醇（要在抽提时现配）：用无水乙醇和DEPC 水配制（DEPC 水:无水乙醇＝1:3），然后放于-20℃备用。

（3）异丙醇：放入棕色瓶（4）氯仿：放入棕色瓶（5） Trizol：100ml/瓶存放于 4℃二，抽提时注意事项：全程佩戴一次性手套和口罩，手套要勤换，避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。

三，抽提步骤1．匀浆化作用取约100mg 鼠脑组织放于玻璃研磨器内，先加0.2ml 的Trizol 溶液，研磨组织后，倒入1.5mlEP 管中，再在研磨器内加入0.8ml 的Trizol 溶液洗，后全部再倒入EP 管中。

提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。

再以cDNA为模板进行PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。

RT-PCR使测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。

该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

(一) 反转录酶的选择1. Moloney鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。

最适作用温度为37℃。

2. 禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。

最适作用温度为42℃。

3. Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2 存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。

4. MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。

此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的m模板合成较长cDNA。

(二) 合成cDNA引物的选择1. 随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。

用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。

通常用此引物合成的cDNA中96%来源于 rRNA。

2. Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。

因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A )尾，此引物与其配对，仅mRNA被转录。

由于Poly(A )RNA仅占总RNA 的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。

3. 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。