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茉莉酸甲酯对丹参毛状根中丹参酮类成分积累和释放的影响王学勇1,崔光红1,黄璐琦1*,邱德有2(1.中国中医科学院中药研究所,北京100700;2.中国林业科学研究院林业研究所,北京100091)[摘要] 目的:研究茉莉酸甲酯(m ethy jas monat ,M J)对丹参酮类成分的积累和向培养基中的释放的影响。
方法:6 7V 悬浮振荡培养ATCC15834农杆菌诱导的丹参毛状根培养18d 后,液体培养基中加入化学诱导子 茉莉酸甲酯,采用H PLC 的方法,测定M J 处理后不同时间段(2,6,9d)丹参毛状根中隐丹参酮、丹参酮II A 的含量以及其在培养基中的含量。
结果:毛状根经M J 处理后2,6,9d 隐丹参酮的含量分别达0 039,0 204,0 572m g g -1,分别是同时期未经M J 处理的2 2,8 5,23 8倍;丹参酮II A 的含量达0 251,0 601,1 563m g g -1,分别是同时间期未经M J 处理丹参毛状根的1 9,4 1,6 2倍。
结论:M J 能显著促进丹参毛状根中丹参酮类成分的积累并向培养基中释放。
[关键词] 茉莉酸甲酯;丹参;毛状根;H PLC[中图分类号]S 567 [文献标识码]A [文章编号]1001 5302(2007)04 0300 03[收稿日期] 2006 07 12[基金项目] 国家重点基础研究发展计划(2006CB504700);国家高技术研究发展计划(2003AA2Z2040)[通讯作者] *黄璐琦,Te:l (010)64014411 2956,E m ai:l hu angl uq @i 植物经常遭受不良因素如微生物入侵与伤害等胁迫,为了抵御不良环境,植物细胞往往产生次生代谢物质。
诱导子的应用即基于这个原理,采用诱导子诱导药用植物细胞合成目的产物,从而为研究植物次生代谢调控提供了新思路与手段。
近10余年来,这方面的研究一直是国内外研究的热点[1]。
活性氧在密旋链霉菌Act12诱导丹参毛状根中丹参酮积累中的作用作者前期研究成果显示密旋链霉菌Act12可以上调丹参酮生物合成途径上的关键酶基因的表达大幅提高丹参毛状根中丹参酮含量。
该实验则进一步研究了活性氧在Act12诱导丹参毛状根中丹参酮积累的作用。
在继代培养21 d的丹参毛状根中添加Act12不同的诱导子及诱导子组合，分别测定不同收获期毛状根的生物量，毛状根中活性氧积累量，丹参酮类成分的积累量和关键酶基因表达量。
Act12诱导后丹参毛状根中活性氧含量上升，HMGR和DXR基因表达上调，最高分别达到对照的32.4，4.8倍，毛状根中丹参酮积累增加，最高达到对照的10.2倍；加入活性氧抑制剂CAT和SOD后，丹参毛状根中的活性氧含量较Act12处理显著下降，HMGR和DXR基因表达也明显下降，毛状根中丹参酮含量较Act12处理下降了74.6%。
活性氧介导了Act12诱导丹参酮积累，Act12很可能是通过ROS信号通路激活了MV A和MEP途径，从而提高了丹参酮在毛状根中的含量。
标签：丹参毛状根；活性氧；密旋链霉菌Act12；次生代谢；3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶；1-脱氧-D-木酮糖-5磷酸还原异构酶[基金項目] 国家自然科学基金项目（81373908）；陕西省重大产业集群荐项目（2012KTCL02-07）2条代谢途径被认为参与了丹参酮的合成，1条是存在于胞质的甲羟戊酸途径（MV A），1条是存在于质体的2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）途径。
3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR）是MV A途径上的关键酶，其催化从3-羟基-3-甲基戊二酰到甲羟戊酸的过程；1-脱氧-D-木酮糖-5磷酸还原异构酶（DXR）是DXP途径的上的关键酶，其使1-脱氧-木酮糖-5-磷酸原子重排和还原生成MEP[10-11]。
活性氧（reactive oxygen species，ROS）包括超氧阴离子（O2-），过氧化氢（H2O2），羟基自由基（HO·）等。
收稿日期:2004-03-03 修改稿收到日期:2004-10-20基金项目:陕西省科技攻关项目(2001K01-G15-03);陕西天士力植物药业有限公司基金(TSL01001)资助。
作者简介:韩建萍(1977 ),女,新疆石河子市人,博士研究生,主要从事中药资源学研究。
*通讯作者微量元素对丹参生长发育及有效成分的影响韩建萍1,2,梁宗锁2*,张文生1(1北京师范大学资源学院资源药物与中药资源研究所,北京100875;2中国科学院、水利部水土保持研究所,陕西杨凌712100)Effect of microelement on growth and active ingredient ofSalvia miltiorrhiza Bge.HAN Jian -ping 1,2,LIANG Zong -suo 2*,ZHANG Wen -sheng 1(1Inst.o f N a tura l Me dicine and Chinese Medicine Resour.,College o f Resou r.Sci.and Techn.,B N U,Beijin g 100875,Ch ina;2Inst.o f Soil and Water Conservation C AS ,Yan gling Shaan xi 712100,China)中图分类号:S567 506文献标识码:A文章编号:1008-505X(2005)04-0560-04微量元素与中药活性分子在人体内起着相互协同、互相渗透,互相制约的作用,并参与体内各种生化反应,促进机体自身调节;中药有效成分可能是其中的某种或某几种有机成分或微量元素,更可能是它们之间形成的配合物[1],如中药补血药材中的铁、锰、锌、铜的含量较高[2]。
中药的生长环境对中药生长及所含微量元素含量有着直接的影响。
微量元素可作为植物体内某些有机合成反应的催化剂或参与植物有效成分的结构功能而影响植物化学成分的形成和积累,从而最终影响药材的药理活性[3]。
・药材与资源・丹参不定根组织培养的研究(Ⅱ)碳源、氮源和磷源对丹参不定根培养的影响郭肖红,高文远*,李克峰(天津大学药物科学与技术学院,天津 300072)摘 要:目的 研究碳源、氮源和磷源对丹参S alvia miltior r hiz a不定根生长及其有效成分丹参酮ⅡA和原儿茶醛量的影响。
方法 利用组织培养技术结合HP LC分析手段,通过改变培养基碳源种类和浓度、氮源和磷源浓度,研究其对丹参不定根生长和丹参酮ⅡA、原儿茶醛量的影响。
结果 碳源、氮源、磷源对于不定根培养是必需的。
以蔗糖为碳源,添加30g/L蔗糖,培养20d,不定根增殖倍数最高,60g/L蔗糖最适合丹参酮ⅡA合成,低质量浓度蔗糖更利于原儿茶醛合成。
间歇添加蔗糖至培养25d,不定根增殖率是对照的2.3倍,丹参酮ⅡA量是对照的2.4倍。
培养基N H4+和N O3-总浓度保持60mmo l/L,N H4+/N O3-为1∶4、1∶4、1∶1时分别得到最大的不定根增殖倍数、丹参酮ⅡA和原儿茶醛的量。
改变培养基K H2P O4浓度时,丹参不定根生长均比对照组旺盛,但高浓度K H2PO4抑制了丹参酮ⅡA合成。
结论 本实验确定了丹参不定根悬浮培养的最佳碳源种类和浓度、氮源比例和磷源浓度,表明不同碳源、氮源和磷源对丹参不定根生长和次生代谢物合成有显著影响。
关键词:丹参;丹参酮ⅡA;原儿茶醛;碳源;氮源;磷源中图分类号:R282.13 文献标识码:A 文章编号:02532670(2007)06090705Tissue culture of Salvia miltiorrhiza adventitious roots(Ⅱ)Effects of carbon,nitrogen,and phosphate sources on cultureof Salvia miltiorrhiza adventitious rootsGUO Xiao-ho ng,GAO Wen-yuan,LI Ke-feng(Co llege o f Phar maceuticals and Biotechnolog y,T ianjin U niver sity,T ianjin300072,China) Abstract:Objective T o study the effects of car bon,nitrog en,and phosphate sources on the gr ow th of Salvia miltior rhiz a adventitious roo ts and the contents of tanshino neⅡA and pr otocatechuic aldehy de. Methods T he adv entitious r oots w ere obtained through tissue cultur e by m anipulation of carbon, nitro gen,and phosphate sources and the contents o f tanshinoneⅡA and pro to catechuic aldehy de were deter mined by HPLC.Results Car bon,nitr ogen,and phosphate so urces w er e necessar y fo r the cultur e of tior rhiz a adventitious r oots.T he highest times of r oot m ultiplicatio n w er e achiev ed at sucrose level of30g/L after20d culture,60g/L sucro se and low level sucrose w er e fav orable for biosyntheses of tanshinoneⅡA and pr otocatechuic aldehyde,respectively.The highest r oot y ield and tanshinoneⅡA co ntent o n day25w ere obtained by inter mittent sugar adding during cultivation,and the pr oduction of adventitious roo ts and tanshino neⅡA w ere2.3-and2.4-fold co mpared w ith those o f contro l,respectiv ely. The m aximum root grow th rate,contents of tanshinoneⅡA and protocatechuic aldehy de w ere achieved w hile NH4+-NO3-w as1∶4,1∶4,and1∶1,r espectively w hen concentration of total nitrog en sour ce w as kept at60mm ol/L.T o compare w ith the co ntrol g roup,chang ing of KH2PO4concentr ation co uld fav or for the adventilious r oot grow th,but high KH2PO4concentr ation inhibited tanshinoneⅡA biosynthesis. Conclusion T he results show that various carbon,nitrog en,and pho sphate sources have the significant effects on adv entitious r oot culture o f tior rhiz a.T he best carbo n source and its concentration, nitro gen and phosphate sources fo r the grow th of tior rhiz a adventitio us roo t and the synthesis of收稿日期:2006-10-10基金项目:国家863项目(2003AA2Z2040);国家中医药管理局中医药科学技术研究专项(04-05ZP10)*通讯作者 高文远 Tel:(022)87401895 E-mail:pharmgao@seco ndary metabolite are confirmed.Key words:S alvia miltior rhiz a Bunge;tanshinoneⅡA;protocatechuic aldehyde;carbon sources; nitro gen sources;phosphate sources 丹参Salvia miltior rhiz a Bunge以根和根茎入药,主要含脂溶性二萜类化合物和水溶性酚酸类化合物,是治疗心血管疾病的重要中药。
专利名称：一种提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法专利类型：发明专利
发明人：开国银,李磊磊,郝小龙
申请号：CN201510334881.5
申请日：20150616
公开号：CN104894143A
公开日：
20150909
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供了一种提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法，该方法用丹参SmWRKY70转录因子构建重组的植物表达载体，遗传转化丹参叶片获得转SmWRKY70基因的丹参毛状根。
本发明从丹参中分离克隆出789bp的SmWRKY70转录因子的编码框序列，并克隆了918bp的SmWRKY70转录因子的启动子序列；构建了SmWRKY70转录因子的亚细胞定位载体；构建了SmWRKY70基因的过表达载体，遗传转化丹参叶片获得SmWRKY70基因的过表达丹参毛状根。
采用本发明的方法获得的转基因丹参毛状根中丹参酮含量显著提高，为生产具重要临床需求的丹参酮提供了一种新型优质药源，对缓解丹参酮药源的紧缺性起到积极的促进作用，具有重要的理论意义和潜在的应用价值。
申请人：上海师范大学
地址：200234 上海市徐汇区桂林路100号
国籍：CN
代理机构：上海科盛知识产权代理有限公司
代理人：杨元焱
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专利名称：一种提高丹参毛状根中丹参酮类活性成分产量的方法
专利类型：发明专利
发明人：周铜水,杨翼信
申请号：CN201210149156.7
申请日：20120515
公开号：CN102696481A
公开日：
20121003
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明属于植物组织培养技术领域，具体为一种提高丹参毛状根中丹参酮类活性成分产量的方法。
本发明采用脱落酸处理悬浮培养的丹参毛状根提高丹参酮类成分产量，具体步骤为：将在6,7-V固体培养基上培养获得的丹参毛状根种株接种到GamborgB5液体培养基中，黑暗培养箱中用振荡培养若干天，然后转移到含有脱落酸的GamborgB5液体培养基中培养1-9天。
本发明处理后得到的丹参毛状根中包括丹参酮IIA、二氢丹参酮I、丹参酮I、隐丹参酮等丹参酮类化合物的含量提高了2～6倍。
本发明为利用丹参毛状根快速高效生产丹参酮类活性成分提供了有效途径。
申请人：复旦大学
地址：200433 上海市杨浦区邯郸路220号
国籍：CN
代理机构：上海正旦专利代理有限公司
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专利名称：能够促进藏丹参毛状根中丹参酮类成分积累的培养基
专利类型：发明专利
发明人：杜旭红,梁宗锁,杨东风,任加惠,金雯芳,刘岩,何燕峰
申请号：CN201410673370.1
申请日：20141121
公开号：CN104396752A
公开日：
20150311
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种能够促进藏丹参毛状根中丹参酮类成分积累的培养基，其由以下浓度(mg/L)的成分组成：硝酸钾496～516、磷酸二氢钾126～146、硫酸镁237～257、硝酸钙462～482、硼酸2.8～3.2、硫酸锰9～11、钼酸钠0.025、硫酸铜0.025、乙二胺四乙酸二钠37～38、硫酸亚铁27～28、肌醇90～110、甘氨酸1.8～2.2、盐酸硫胺素0.8～1.2、盐酸吡哆醇0.5、烟酸0.5、水解乳蛋白490～510、硫酸腺嘌呤9～11、蔗糖29000～31000mg/L。
采用该培养基能促进藏丹参毛状根中二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA这四种活性的成分含量。
申请人：浙江理工大学
地址：310018 浙江省杭州市下沙高教园区2号大街5号
国籍：CN
代理机构：杭州中成专利事务所有限公司
代理人：金祺
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第39卷 第3期2011年3月西北农林科技大学学报(自然科学版)Jo ur nal of N o rthwest A&F U niver sity(N at.Sci.Ed.)Vo l.39N o.3M ar.2011培养基中不同营养元素对丹参毛状根生长及丹参酮类积累的影响沈 双,张顺仓,杨东风,梁宗锁(西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100)[摘 要] 目的 研究6,7 V和M S培养基中不同营养元素对丹参毛状根生长及丹参酮类成分积累的影响,探求更有效提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法。
方法 以6,7 V培养基为基本培养基,分别将M S培养基的大量、微量和有机元素替换6,7 V培养基的相应成分,取培养21d的毛状根测定其鲜质量,用高效液相色谱(H PL C)法测定培养基和毛状根中二氢丹参酮 、丹参酮 、丹参酮 A的含量;以6,7 V培养基为基本培养基,以其大量元素为基础,分别用M S培养基中的大量元素K N O3、NH4N O3、M gSO4 7H2O、K2H PO4替换6,7 V培养基的相应大量元素组分,取培养21d的毛状根测定其鲜质量,利用H PL C法测定培养基和毛状根中的二氢丹参酮 、丹参酮 、丹参酮 A含量,分析各种培养基对丹参毛状根生长及丹参酮类成分积累的影响。
结果 M S培养基的大量元素可显著促进丹参酮类成分的积累,但不利于丹参毛状根的生长,微量元素和有机元素对毛状根的生长和丹参酮类成分的积累无显著影响。
以M S培养基的大量元素K2H PO4替换6,7 V培养基的大量元素N aH2PO4 H2O和N a2H PO4时,培养基中丹参酮 A含量最低;以M S培养基的大量元素M gSO4 7H2O替换6,7 V培养基的大量元素M gSO4 7H2O时,丹参毛状根生长速度最快,且培养基中的丹参酮 A含量高于其他相应处理;以M S培养基的大量元素N H4N O3替换6,7 V培养基的大量元素(N H4)2SO4时,培养基中的二氢丹参酮 、丹参酮 含量均为最低,同时毛状根中丹参酮 A的含量低于其他相应处理。
结论 丹参毛状根培养基中的大量元素显著影响毛状根的生长和有效成分的积累;减少M S培养基的大量元素M g SO4 7H2O的含量,可以促进毛状根的生长和丹参酮 A的释放;而大量元素中含量过多的NH4N O3不利于丹参毛状根的生长,同时也不利于丹参酮类成分的积累和释放。
[关键词] 丹参;毛状根;丹参酮;大量元素;有机元素[中图分类号] S567.5+30.48[文献标识码] A[文章编号] 1671 9387(2011)03 0130 07Effects of m ediums on the growth ofS a lvia miltiorrhiza hairy roots and accumulationof tanshinones in tiorrhizaSHEN Shuang,ZH ANG Shun cang,YANG Dong feng,LIANG Zong suo(Colle ge of L if e S cience s,N or th w est A&F Univ ersity,Yang ling,S haanx i712100,China)Abstract: Objective The research w as to study the effect of different nutrient elem ents in6,7 V liq uid medium and MS liquid medium on the gro w th and accum ulation of tanshinones in hairy ro ot o f Salv ia miltiorr hiz a,and to enhance the tanshino nes content in S.m iltiorr hiz a hair y ro ot effectively. Metho d With6,7 V m edium as the basic culture medium,taking M S medium s macro element,micro element and or g anic elem ent to replace the corresponding ingr edient of6,7 V medium,the g row th and co ntents of di hy drotanshinone ,tanshinone ,and tanshinone A w ere determined by high perfor mance liquid chro ma*[收稿日期] 2010 09 01[基金项目] 国家 十一五 科技支撑计划项目(2007BAD79B06,2008BAD98B08)[作者简介] 沈 双(1985-),女,安徽淮南人,在读硕士,主要从事药用植物次生代谢研究。
E m ail:shenshu angh r@[通信作者] 梁宗锁(1965-),男,陕西扶风人,教授,博士生导师,主要从事中草药规范化栽培理论与技术研究。
E mail:liangzs@m s.isw to graphy(H PLC)method after cultivating21d;T aking6,7 V medium as the basic cultur e m edium,and its macro element as the foundation,and M S medium m acroelement s KNO3,NH4NO3,Mg SO4 7H2O, K2H PO4to replace the cor respo nding ingredient of the6,7 V m edium,the effects of different medium s on the g row th and accum ulation of tanshino nes in hairy roo t o f S.m iltiorr hiz a w ere analy zed. Result M S liquid medium s macroelem ent may obviously pr omote accumulation o f tanshinones,but ho ld back the grow th of hairy root.M icro element and org anic element can not affect the g row th and accum ulation of tan shinones significantly.W hen M S medium macro element s K2H PO4replaces6,7 V medium NaH2PO4 H2O and N a2H PO4,tanshinone A content is the low est in medium;When M S medium m acroelement s Mg SO4 7H2O replaces6,7 V medium M gSO4 7H2O,the hairy r oot g row s most quickly,and tanshinone A content is the highest in m edium;When M S medium macr oelem ent s NH4NO3replaces the6,7 V cul ture m edium(NH4)2SO4,the contents of dihy dro tanshino ne and tanshino ne are the low est in the m edi um,simultaneously tanshinone A co ntent is low er than that o f other four g roups in the hairy root. Con clusion M acro element affects the g row th and concentr ation of tanshinones significantly;Reducing the con tent of M gSO4 7H2O in the MS m edium may pro mote the g row th of hair y ro ot and the release o f tanshi none A;H ow ever,in the macro elements excessive NH4NO3does not favor the grow th of hairy r oot,the accumulatio n and release of tanshinones.Key words:Salvia miltior rhiz a;hairy roots;tanshinones;macr oelem ent;org anic elem ent丹参(S alvia miltior r hiz a Bung e)是我国的传统中草药之一,以其根及根茎入药,可广泛用于心血管系统和血液系统疾病的治疗[1]。
随着丹参市场的扩大,其需求量剧增,野生丹参资源已远远不能满足市场的需求,加之丹参有效成分在原植物中含量低且生长周期长,在传统的栽培模式下又面临着质量参差不齐、品质退化严重等问题[2],因此,有必要应用植物细胞工程和基因工程等现代生物工程技术,改良丹参品质,在保证丹参药材质量稳定性和优良性的前提下,提高丹参有效成分含量。
丹参毛状根因具有生长速度快、次生代谢产物含量稳定等特点而成为研究根积累药用植物的良好试验材料[3]。
培养基组成在丹参毛状根生长和有效成分积累中具有重要作用。
张荫麟等[4]研究发现,B5和M S 培养基有利于丹参冠瘿组织的生长,而6,7 V和WP培养基则有利于丹参酮的合成,在培养过程中丹参酮能分泌到培养液中。
宋经元等[5]进一步研究发现,6,7 V培养基有利于选择出高产株系。
张荫麟等[6]又比较了M S、6,7 V和RC3种基本培养基对丹参毛状根增殖和丹参酮类积累的影响,发现6, 7 V培养基对丹参毛状根的增殖效果最好,而M S 培养基对丹参酮类的积累效果最好。
王冲之等[7]比较了1/2M S、改良White、改良Nisch、SJ 1、B5和B5 16等6种液体培养基对西洋参毛状根生长的影响,结果发现,在B5和SJ 1培养基中西洋参的毛状根生长最好,且人参皂甙含量较高。
