论文第49卷第7期 2004年4月NO参与真菌诱导子对红豆杉悬浮细胞中PAL 活化和紫杉醇生物合成的促进作用徐茂军①②董菊芳②朱睦元①*(①浙江大学生命科学学院植物生理学和生物化学国家重点实验室, 杭州 310012; ②杭州商学院食品、生物与环境工程学院, 杭州310035. * 联系人, E-mail: myzhu@)摘要由桔青霉(Penicillium citrinum)细胞壁制备的诱导子可以诱发红豆杉悬浮细胞产生多种防卫反应, 包括NO合成、PAL活化和紫杉醇合成加强. NO淬灭剂cPTIO和一氧化氮合酶(NOS)抑制剂PBITU可以阻断桔青霉诱导子对红豆杉悬浮细胞中PAL活化和紫杉醇合成的促进作用. NO 供体SNP单独处理也可以触发红豆杉细胞中PAL活化和紫杉醇合成加强. PBITU可以抑制桔青霉诱导子诱发红豆杉悬浮细胞中NO的增加. 实验结果证实了在桔青霉诱导子处理下红豆杉悬浮细胞中NO合成与PAL活化和紫杉醇合成加强之间的因果关系, 表明桔青霉诱导子诱导红豆杉悬浮细胞通过NOS产生NO, NO作为信号分子活化PAL并触发紫杉醇生物合成.关键词NO诱导子信号分子红豆杉悬浮细胞紫杉醇紫杉醇是近年来发现的存在于红豆杉植物中的一种天然抗肿瘤药物. 由于天然红豆杉植物资源有限, 因此利用细胞培养技术生产紫杉醇被视为解决紫杉醇药源短缺问题的一条有效途径[1,2]. 培养细胞中紫杉醇产量低是利用细胞培养法生产紫杉醇技术难以产业化的主要制约因素. 包括紫杉醇在内的植保素类次生代谢物质在植物体内的主要功能之一是提高植物对病原物的抗性, 在受到病原物浸染时植物体内紫杉醇等防御性次生物质的合成加强是植物特征性防卫反应之一. 诱导子是来源于病原微生物的一类化学物质, 具有诱导植物细胞中防卫基因表达、诱发植物过敏反应和促进植物细胞中特定次生代谢产物的合成等多种功能[3]. 利用病原物诱导子激活植物细胞中的次生代谢途径已成为提高植物细胞培养物中目标产物产量的有效手段之一[4]. 真菌诱导子被广泛地用于促进各种红豆杉细胞培养物中紫杉醇的合成[5,6]. 然而, 目前对真菌诱导子促进红豆杉细胞中紫杉醇合成的信号转导分子机制尚不清楚. 研究表明, 离子跨膜运输、活性氧(ROS)合成以及蛋白质磷酸化和脱磷酸化作用可能参与了植物细胞防卫反应的信号转导过程[7~9].NO是一类脂溶性的可扩散小分子物质, 可以作为细胞内或细胞间的信号分子. NO在人体及动物神经、心血管和免疫系统中的作用已引起了人们的广泛关注[10]. 近年来的研究表明, 在植物细胞中存在着与哺乳动物类似的一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase, NOS)[11]. 由NOS催化形成的NO在植物体内具有促进种子萌发及植株根和叶的生长发育以及诱发植物防卫反应和防御基因活化等多种功能[12~14]. NO已成为引人注目的一种新型植物信号分子.NO在植物抗病反应中的作用已有很多报道. 研究表明, NO是介导植物对生物逆境胁迫防卫反应的重要环节之一[15,16]. Durner等人[15]发现, 将动物细胞的NOS导入到烟草细胞中可以诱导抗性相关基因(PR gene)的表达. 在烟草悬浮细胞中添加NO的前体物质GSNO也可以诱导烟草细胞中抗性相关基因的表达. NO前体SNP可以诱发水稻细胞中pal, prl和chi等防卫基因的表达[17]. NO的这些功能可被NO淬灭剂cPTIO所抑制[15,17]. 这些实验结果表明, NO是触发植物防卫反应所必需的信号分子之一. 然而, 目前关于NO信号分子作用的研究主要集中在NO对植物防卫基因的表达调控方面, 所用的材料主要为拟南芥、烟草等模式植物以及大豆、水稻等农作物. NO在药用植物细胞中的形成及其功能还没有报道. 对于NO是否参与真菌诱导子诱发红豆杉等药用植物细胞中次生代谢产物的合成积累及其作用机制等问题都有待研究证实. 为此, 我们用桔青霉(Penicillium citrinum)细胞壁制备的诱导第49卷第7期 2004年4月论文子处理红豆杉悬浮细胞, 研究了红豆杉细胞在真菌诱导子作用下NO的产生及其生物学功能, 以证实在桔青霉诱导子诱发红豆杉细胞中紫杉醇合成的过程中, NO可能作为信号分子参与了紫杉醇合成的调控作用.1 材料与方法(ⅰ) 红豆杉悬浮细胞系及培养条件. 红豆杉植株由杭州药用植物园提供. 红豆杉愈伤组织的诱导按下述方法进行. 植株幼茎经自来水反复冲洗干净后, 用蒸馏水冲洗, 剪成 3 cm左右的小段, 分别用75%酒精浸泡10~20 s和0.1%HgCl2溶液浸泡10~20 min, 经无菌水浸洗后, 在无菌滤纸上切割成0.5 cm左右的小段, 接种于B5培养基(2.0 mg/L2,4-D, 1.0 mg/L 细胞分裂素, 0.1 mg/L GA3, 20 mg/L 蔗糖和8 mg/L琼脂)[18]上, 25℃暗培养. 1周后将诱导的愈伤组织转接到新鲜的B5培养基上, 继代培养2个月后, 再转接到B5液体培养基(2.0 mg/L2,4-D, 1.0 mg/L CK, 0.1 mg/L GA3, 30 mg/L 蔗糖)上, 120 r/min 25℃下黑暗振荡培养, 每2周按1∶15的体积比转接一次. 实验所用的红豆杉悬浮细胞已经过40~50次继代培养, 具有稳定的形态特征和生长速率. 实验时取转接后培养5 d的红豆杉悬浮细胞使用.(ⅱ) 桔青霉诱导子的制备. 将桔青霉菌丝接种于改良的PDA培养基(100.0 g/L 土豆, 20.0 g/L 葡萄糖, 3.0 g/L KH2PO4, 1.5 g/L MgSO4, 1.0 mg/L VB1)上, 25℃黑暗下培养, 7 d后取2 cm3左右的长满菌丝的培养基置于PDA液体培养基中, 25℃150 r/min黑暗振荡培养, 5 d后过滤取菌丝, 参照文献[19]的方法制备真菌细胞壁诱导子, 以葡萄糖为标准, 用蒽酮比色法定糖.(ⅲ) 红豆杉悬浮细胞中NO含量测定. 培养细胞中NO浓度测定按文献[20]方法进行. 在酸性条件下将NO氧化成亚硝酸盐, 利用Greiss试剂(1%对氨基苯磺酸, 0.1% N-萘基-乙二胺, 5%磷酸)测定所生成的亚硝酸盐含量推算细胞中NO浓度. 不同处理的红豆杉悬浮细胞经0.22 µm微孔滤膜过滤后, 取 1 mL 滤液加入1 mL Greiss振荡混匀, 室温下放置30 min后在550 nm处测定吸光度值, 根据吸光度值利用NaNO2标准曲线计算NO的含量.(ⅳ) PAL活性测定. 不同处理的红豆杉悬浮细胞以1000×g离心5 min, 收集沉淀细胞, 按1∶2(体积质量比, mL/g)的比例加入提取液(50.0 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0), 10.0 mmol/L巯基乙醇, 4.0 mmol/L EDTA, 1.0 µmol/L亮抑蛋白酶肽), 冰浴中研细, −4℃, 10000×g离心15 min. 取上清液1 mL 按文献[21]的方法测定PAL酶活性. PAL酶活性单位以(nmol反式肉桂酸)/mg蛋白质×h−1表示.(ⅴ) 紫杉醇含量测定. 细胞中紫杉醇提取按照文献[22]方法进行. 细胞及培养液中紫杉醇含量测定按照文献[2]方法进行, 相加后为总紫杉醇含量.(ⅵ) 红豆杉细胞的SNP, cPITO及PBITU处理方法. 以红豆杉悬浮细胞进行NO供体SNP, NO淬灭剂cPTIO和一氧化氮合酶(NOS)抑制剂PBITU对NO 释放、PAL活性、紫杉醇合成的影响实验. 将SNP, cPITO或PBITU溶液经0.22 µm微孔滤膜过滤后, 按照实验要求在不同培养时期向培养基中加入不同体积的上述溶液. 另一组培养细胞中加入等体积的蒸馏水代替SNP, cPITO或PBITU作为对照.2 结果2.1 桔青霉诱导子诱发红豆杉悬浮细胞中PAL活化、紫杉醇合成及NO释放由桔青霉细胞壁制备的诱导子对红豆杉悬浮细胞的PAL活性、紫杉醇含量及NO释放的影响如图1所示. NO的产生是红豆杉细胞在桔青霉诱导子处理下最早出现的反应之一. 在桔青霉诱导子处图1 桔青霉诱导子处理时间对红豆杉细胞的PAL活性、紫杉醇含量及NO释放量的影响结果为4次实验的平均值±SE. 诱导子浓度为60 (µg glc equ)/mL论 文第49卷 第7期 2004年4月理2 h 后, 红豆杉悬浮细胞开始产生NO, 并在6 h 左右时达到最高. 而红豆杉细胞中PAL 的活性在处理5 h 后增加, 并在12 h 左右达到最高. 红豆杉悬浮细胞中紫杉醇含量的增加稍晚于PAL 活性, 在诱导子处理10 h 后细胞中紫杉醇的含量开始出现增加, 在20 h 左右时达到最高(图1). 桔青霉诱导子诱发的PAL 活化及紫杉醇合成增加主要发生在NO 峰之后.桔青霉诱导子对红豆杉悬浮细胞的PAL 活性, 紫杉醇含量及NO 产生的影响呈现明显的浓度依赖性. 如图2所示, 诱导子浓度在0~60 (µg glc equ)/ mL 范围内, 红豆杉悬浮细胞的PAL 活性, 紫杉醇含量及NO 产生随着诱导子浓度的增加而增加. 当诱导子浓度超过80 (µg glc equ)/mL 时, 红豆杉悬浮细胞中PAL 活性、紫杉醇含量及NO 产生都出现不同程度的下降(图2).图2 诱导子浓度对红豆杉细胞的PAL 活性、紫杉醇含量及NO 释放量的影响所示结果为4次实验的平均值±SE. NO, PAL 和紫杉醇含量的测定时间分别为诱导子处理后5, 10和20 h2.2 SNP 对红豆杉悬浮细胞中PAL 活化及紫杉醇合成的诱导作用硝普钠(SNP)是常用的NO 供体. 本文实验结果表明, 以SNP 单独处理红豆杉悬浮细胞对细胞中PAL 活性及紫杉醇含量都具有明显的促进作用(图3), 表明NO 是诱发红豆杉悬浮细胞中PAL 活化和紫杉醇合成的充分条件. 在SNP 处理下, 红豆杉细胞中的PAL 活性和紫杉醇含量分别在处理后的2和5 h 开始增加, 并分别在8和15 h 达到最高, 表明红豆杉细胞对SNP 的反应快于真菌诱导子.图3 SNP 处理时间对红豆杉细胞中PAL 活性和紫杉醇含量的影响所示结果为4次实验的平均值±SE. SNP 浓度为15 mmol/L红豆杉悬浮细胞中PAL 活性及紫杉醇含量的增加对SNP 也具有浓度依赖性. 如图4所示, SNP 浓度在0~15 mmol/L 范围内, 红豆杉悬浮细胞中PAL 活性及紫杉醇含量随着SNP 浓度的增加而增加, 当SNP 浓度高于15 mmol/L 时, 细胞中PAL 活性和紫杉醇含量都出现不同程度的下降(图4). 但是即使在最适SNP浓度(15mmol/L)下, 红豆杉悬浮细胞中PAL 活性及紫杉醇含量仍低于桔青霉诱导子处理(图2和4).图4 SN 浓度对红豆杉细胞中PAL 活性和紫杉醇含量的影响所示结果为4次实验的平均值±SE. PAL 活性和紫杉醇含量的测定时间为SNP 处理后10 h第49卷 第7期 2004年4月论 文2.3 cPTIO 和PBITU 对桔青霉诱导子的抑制作用为了进一步证实NO 是桔青霉诱导子促进红豆杉细胞中紫杉醇合成所必需的信号分子, 分别考查了NO 淬灭剂cPTIO 和NOS 抑制剂PBITU 对桔青霉诱导子处理下红豆杉悬浮细胞中PAL 活性和紫杉醇合成的影响(图5). 由图5可见, cPTIO 和PBITU 能够阻断桔青霉诱导子对红豆杉悬浮细胞中PAL 活化和紫杉醇合成的促进作用, PBITU 能够抑制桔青霉诱导子诱发红豆杉悬浮细胞产生NO. 实验结果表明, NOS 是红豆杉细胞在桔青霉诱导子处理下产生NO 的主要途径, 所产生的NO 是真菌诱导子触发红豆杉细胞中PAL 活化和紫杉醇合成所必需的信号分子. 从图5同时可见, SNP 单独处理可以使红豆杉细胞中PAL 活性和紫杉醇含量分别上升到诱导子处理组的60.1%和79.0%, 说明NO 单独处理也足以触发红豆杉细胞中PAL 活化和紫杉醇合成加强, NO 是触发红豆杉细胞发生上述反应的充分条件. 此外, SNP+cPITO 处理组中红豆杉细胞的PAL 活性, 紫杉醇含量及NO 水平与对照组无明显差异(图5), 表明cPITO 能够有效清除NO, SNP 处理对红豆杉细胞中PAL 活性及紫杉醇图5 桔青霉诱导子和不同种类抑制剂对红豆杉细胞的PAL 活性、紫杉醇含量和NO 释放的影响所示结果为4次实验的平均值. NO 含量的测定时间为诱导子处理后5 h; PAL 含量的测定时间为诱导子处理后10 h; 紫杉醇含量的测定时间为诱导子处理后20 h. 1示CK; 2示桔青霉诱导子(60(µg glc equ)/mL); 3示桔青霉诱导子(60 (µg glc equ) /mL)+cPITO(20 mmol/L); 4示桔青霉诱导子(60 (µg glc equ)/mL)+PBITU(40 mmol/L); 5示SNP(15 mmol/L); 6示SNP(15mmol/L)+ cPITO(40 mmol/L)合成的影响确实是由NO 引起, 而非SNP 或其他分解物的作用.3 讨论本文的实验结果表明, 桔青霉细胞壁诱导子可以诱导红豆杉悬浮细胞的PAL 活化、紫杉醇合成及NO 产生. 桔青霉诱导子诱发红豆杉细胞中NO 的产生先于PAL 活化和紫杉醇合成加强, 说明红豆杉细胞中NO 的产生位于PAL 活化和紫杉醇合成途径激活的上游. NO 供体SNP 直接处理也能提高红豆杉细胞中PAL 活性和紫杉醇含量, 表明NO 是触发红豆杉细胞中PAL 活化和紫杉醇合成加强的充分条件. NO 淬灭剂cPTIO 和一氧化氮合成酶(NOS)抑制剂PBITU 可以阻断桔青霉诱导子对红豆杉悬浮细胞中PAL 活化和紫杉醇合成的促进作用, 表明NO 产生是桔青霉诱导子诱发红豆杉悬浮细胞中PAL 活化和紫杉醇合成加强的必要条件. 本文通过实验证明了NO 是介导桔青霉诱导子促进红豆杉悬浮细胞中紫杉醇合成和PAL 活化信号转导途径中必需的信号分子.大量的实验表明, 在病原物或诱导子胁迫下植物可以产生NO, NO 作为信号分子活化植物的防御反应[14~16]. NO 对红豆杉细胞中紫杉醇合成的促进作用可能与其活化植物细胞防御反应的功能有关. 苯丙烷代谢途径是植物细胞中许多防御性次生物质代谢的共同途径, 苯丙氨酸解氨酶(PAL)是这一途径的第一关键酶[23]. 在各种生物逆境胁迫下, 植物细胞的特征反应之一是苯丙烷代谢途径的激活[24], 因此苯丙烷代谢途径的关键酶PAL 活性被广泛用作为植物中防御性次生代谢反应强弱的指标. 本文的实验结果表明, 桔青霉诱导子或NO 供体SNP 单独处理都可以诱发红豆杉细胞中PAL 的活化, 说明真菌诱导子或NO 都能够激活红豆杉细胞的防御反应. 而诱导子对红豆杉细胞中PAL 的活化可以被NO 淬灭剂cPTIO 和NOS 抑制剂PBITU 阻断, 表明NO 是真菌诱导子激活红豆杉细胞防御反应的必要条件. 这与其他植物上的实验结果基本一致. 研究表明, 诱导子可以诱发烟草、拟南芥、大豆、水稻等植物细胞中防御基因表达及过敏反应(HR)等许多防卫反应[17,25], 而诱导子的这些功能可以被NO 淬灭剂所阻断[15~17]. 这些实验结果表明NO 是诱导子诱发烟草等植物细胞防论 文第49卷 第7期 2004年4月卫反应必需的信号分子. 由于包括紫杉醇在内的植保素类次生代谢物质合成是植物细胞防御反应的结果之一[26], 因此NO 作为信号分子可以通过介导真菌诱导子诱发红豆杉细胞的防卫反应, 激活红豆杉细胞中紫杉醇的合成代谢途径.在病原物和诱导子胁迫下, 植物细胞可以活化多种防卫反应, 其中过敏反应(HR)是植物细胞最典型的防卫反应之一. 研究表明, Ca 2+流[27]、活性氧(ROS)产生[28,29]、蛋白质的磷酸化和脱磷酸化[27]、G-蛋白和钙调素(CaM)[30]等可能参与了植物过敏反应的信号转导过程. NO 在植物过敏反应中的信号分子作用已有许多报道[15,16]. 植物过敏反应的特征之一是氧迸发(oxidative burst). 植物细胞在氧化爆发时可以产生大量的活性氧(ROS), 同时植物细胞中防御基因表达的信号转导途径被激活[28,29]. 胡向阳等人发现NO 供体SNP 与(由黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶体系提供)或NO 供体SNP 与H 2O 2(由葡萄糖和葡萄糖氧化酶体系提供)联合处理下, 水稻细胞中pal , chi , prl 基因的转录水平明显高于NO 供体、或H 2O 2单调处理,表明NO 是介导植物细胞中防卫基因表达的信号分子之一, 但NO 不是惟一的决定因子2O −2O −[17]. 我们在实验中发现NO 供体SNP 处理可以诱发红豆杉细胞中PAL 活化和紫杉醇合成加强, 但是即使在最适SNP 浓度下, 红豆杉细胞中PAL 活性和紫杉醇含量仍低于诱导子处理组. 这一结果表明, NO 是介导红豆杉细胞中PAL 活化和紫杉醇合成的重要信号分子, 但不是惟一决定因子. 在红豆杉细胞中除了NO 外可能还存在着其他信号分子或其他信号途径共同参与介导真菌诱导子对红豆杉细胞中PAL 活性和紫杉醇合成的促进作用.在真菌诱导子胁迫下, 植物细胞首先必需与诱导子相互识别, 然后才能诱发植物的防卫反应. Lig-terink 等人[31]的研究表明, 欧芹细胞通过细胞膜上的特定受体识别病原物Phytophthora sojae . 由Phyto - phthora sojae 制备的寡肽诱导子可以识别并与膜上的特定受体结合, 从而诱发欧芹细胞的防卫反应. 我们在实验中发现真菌诱导子诱发红豆杉细胞的NO 产生、PAL 活化及紫杉醇合成加强呈现典型的剂量饱和效应, 表明在红豆杉细胞膜上也可能存在着能够与真菌诱导子特异性识别结合的受体. 真菌诱导子与此受体的识别并结合是诱导子诱发红豆杉细胞的PAL 活化、紫杉醇合成及NO 产生所必需, 当膜上的受体被诱导子饱和后, 继续增加诱导子浓度, 细胞中PAL 活性、紫杉醇含量和NO 产生不会随之增加.一氧化氮合成酶(NOS)是动物细胞中NO 合成的主要途径. 研究表明, 植物中也存在NOS 活性[11,32]. 在Lupinus albus 的根等部位可以检测出NOS 活性, 用NOS 抑制剂L-NMMA(N G -monomethyl-L-arginine)可以抑制其活性[33]. 真菌诱导子可以诱发烟草细胞产生NO, 这一作用也可以被L-NMMA 抑制[34]. 本文实验结果表明, 真菌诱导子对红豆杉细胞中NO 产生的诱导作用可以被NOS 抑制剂PBITU 所抑制, 说明在红豆杉细胞中存在NOS 或与NOS 性质相似的酶.综上所述, 本文的实验结果表明在真菌诱导子胁迫下, 红豆杉细胞通过NOS 产生NO, 所产生的NO 是介导真菌诱导子触发红豆杉细胞中PAL 活化和紫杉醇合成加强所必需的信号分子.致谢 本工作为国家自然科学基金(批准号: 30100115, 30370876)资助项目.参 考 文 献1 Cragg G M, Schepartz S A, Suffness M, et al. The taxol supplycrisis-new NCI policies for handling the large-scale production of novel product anticancer and anti-HIV agents. J Nat Prod, 1993, 56(10): 1657~1668 2Wu J, Wang C, Mei X. 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