乳与乳制品微生物检验食品中大肠菌群的检测
YLNB 3.2
1、引用依据：GB/T4789.3-2003
2、术语和定义
大肠菌群：指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。
食品中大肠菌群数系以100ml(g)检样内大肠菌群最可能数（MPN）表示。
3、仪器及器材
3.1 恒温培养箱：36±1℃；
3.2 冰箱：0-4℃；
3.3 恒温水浴锅：46±1℃；
3.4 天平；
3.5 显微镜；
3.6 均质器或乳钵；
3.7 灭菌平皿：直径90mm；
3.8 灭菌试管：18×180和20×200；
3.9 灭菌吸管：1 ml和10 ml；
3.10 灭菌广口瓶或三角烧瓶：容量为500ml；
3.11 灭菌玻璃珠：直径约5mm；
3.12 载玻片；
3.13 酒精灯；
3.14 试管架；
3.15 灭菌刀、剪子、灭菌镊子等。
4、培养基和试剂
4.1 乳糖胆盐发酵管；
4.2 伊红美兰琼脂平板；
4.3 乳糖发酵管；
4.4 生理盐水；
4.5 革兰氏染色液。
5、检验程序
6、方法
6.1 检样稀释
6.1.1 以无菌操作将检样25ml（或g）放于装有225ml灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量
的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。
固体检样最好用均质器，以8000～10000r/min 的速度处理1min，做成1：10的均匀稀释液。
6.1.2 用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，注入含有9ml 灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，做成1：100的稀释液。
6.1.3 另取1ml灭菌吸管，按上条操作依次做10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用一支1ml灭菌吸管。
6.1.4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种3管。
6.2 乳糖发酵实验：（通常所说的假定试验：其目的在于检查样品中有无发酵产生气体的细菌）
将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1ml以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，1ml及1ml以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。
每一稀释度接种3管，置36±1℃培养箱内，培养24±2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。
6.3 分离培养：（目的在于检查乳糖初发酵试验呈阳性反应的试管内，有无需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌存在）
将产气的发酵管分别转种在伊红美兰琼脂平板上，置36±1℃培养箱内，培养18～24h，然后取出，观察菌落形态，并
做革兰氏染色和证实实验。
6.4 证实实验（复发酵实验）: (目的在于证明从乳糖初发酵试验呈阳性反应的试管内分离到的革兰氏阴性无芽孢杆菌，确能发酵乳糖产生气体)
在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1～2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36±1℃培养箱内，培养24±2h，观察产气情况。
凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阴性。
6.5 报告
根据证实为大肠菌群阳性的管数查MPN检索表,报告每100ml （g）大肠菌群的最可能数（见表1）。
7、注意事项
7.1 初发酵和证实试验
乳糖发酵试验不是纯菌的发酵试验，所以初发酵阳性并不代表大肠菌群阳性，因此，必须作进一步证实试验。
7.2 产气量与倒管
试验表明，大肠菌群的产气量与大肠菌群的检出率呈正相关系。
但也随样品的种类而变。
大肠菌群的产气量多者可充满整个倒气管，少者可产生比小米粒还小的气泡。
如果对产酸但未产气的乳糖发酵管如有疑问，可用手轻轻打动试管,如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。
另外，产气量与倒气管有一定的关系，倒气管口
不完整，有利于气体的进入；管口周围有沉淀等物质能影响气体的进入。
7.3 挑选菌落
在平板呈现紫黑色，有或无金属光泽，检出率最高；粉红色、粉色检出率最低。
另外，只挑选一个菌落影响大肠菌群的检出率，当菌落不典型时，应挑取2～3个菌落作证实试验，以免出现假阴性。
7.4 抑菌剂
大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。
胆盐的主要作用是抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生长。
有些抑菌剂用量甚微，称量时稍有误差，即可对抑菌作用产生影响，因此抑菌剂的添加应严格按照标准方法添加。
7.5指示剂
溴甲酚紫属于酸碱指示剂，其pH变色范围为：黄5.2～6.8紫，当料管中培养基（pH=7.4±0.1）的颜色由紫色变为黄色时，证明培养基中有酸性物质产生，此时培养基的PH ≤5.2，培养基呈酸性。
7.6 MPN检索表
MPN为最大可能数的简称，表示样品中活菌的密度，是用概率论来推算样品中菌数最近似的数值。
MPN检索表只给出了三个稀释度，如果改用不同的稀释度，则表内数值应相应
降低或增加10倍。
7.6.1 用于初发酵试验或复发酵试验的小导管内应无气泡，有气泡时就不能使用，接种之后，要用同批未接种的发酵管置于温箱内，同时培养，作为空白。
7.6.2 检查初发酵试验的乳糖胆盐管内是否有乳糖分解菌存在时，应以产气为主，产酸仅作参考。
因为培养基中所用的指示剂为溴甲酚紫，其有效PH为5.2-6.8，变色点为6.0，如果产酸未能达到使下降至6.0以下时，变色就不显著。
7.6.3 检查发酵管中小导管内气泡时，即使只有微量气泡出现，亦应判定为阳性。
有时小导管的管口被样品颗粒封住，气体未能进入导管，如加以振摇，管低有小气泡上升，亦应视为阳性。
7.6.4 大肠菌群细菌能分解乳糖产酸，使伊红和美兰结合而成黑色物，故菌落呈紫黑色（大肠杆菌）或褐色（产气克雷伯氏菌等），前者有时还产生有金属光泽。
表 1 大肠菌群最可能数（MPN）检索表
注：①本表采用3个稀释度【0.1g(mL)、0.01 g(mL)、0.001 g(mL)】、每个稀释度接种3管。
②表内所列检样量如改用1g(mL)、0. 1 g(mL)、0.01 g(mL)时，表内数字相应降低10倍；如改用0.01g(mL)、0.001 g(mL)、0.0001 g(mL) 时，表内数字相应增加10倍，其余类推。
