如何添加酶切位点

序列分析软件DNAMAN 的使用方法简介DNAMAN 是一种常用的核酸序列分析软件。

由于它功能强大，使用方便，已成为一种普遍使用的DNA 序列分析工具。

本文以DNAMAN 5.2.9 Demo version 为例，简单介绍其使用方法。

打开DNAMAN，可以看到如下界面：第一栏为主菜单栏。

除了帮助菜单外，有十个常用主菜单，第二栏为工具栏：第三栏为浏览器栏：在浏览器栏下方的工作区左侧，可见Channel 工具条，DNAMAN 提供20 个Channel，(如左所示：)点击Channel 工具条上相应的数字，即可击活相应的Channel。

每个Channel 可以装入一个序列。

将要分析的序列（DNA 序列或氨基酸序列）放入Channel 中可以节约存取序列时间，加快分析速度。

此版本DNAMAN 提供自动载入功能，用户只需激活某个Channel，然后打开一个序列文件，则打开的序列自动载入被激活的Channel 中。

本文以具体使用DNAMAN 的过程为例来说明如何使用DNAMAN 分析序列。

1．将待分析序列装入Channel（１）通过File Open 命令打开待分析序列文件，则打开的序列自动装入默认Channel。

（初始为channel1）可以通过激活不同的channel (例如：channel5)来改变序列装入的Channel。

（２）通过Sequence/Load Sequence 菜单的子菜单打开文件或将选定的部分序列装入Channel 。

通过Sequence/Current Sequence/Analysis Defination 命令打开一个对话框，通过此对话框可以设定序列的性质（DNA 或蛋白质），名称，要分析的片段等参数。

2．以不同形式显示序列通过Sequence//Display Sequence 命令打开对话框，如下图所示：根据不同的需要，可以选择显示不同的序列转换形式。

对话框选项说明如下：Sequence &Composition 显示序列和成分Reverse Complement Sequence 显示待分析序列的反向互补序列Reverse Sequence 显示待分析序列的反向序列Complement Sequence 显示待分析序列的互补序列Double Stranded Sequence 显示待分析序列的双链序列RNA Sequence 显示待分析序列的对应RNA 序列3．DNA 序列的限制性酶切位点分析将待分析的序列装入Channel，点击要分析的Channel，然后通过Restriction/Analysis 命令打开对话框，如下所示：参数说明如下：Results 分析结果显示其中包括：Show summary（显示概要） Show sites on sequence（在结果中显示酶切位点）Draw restriction map（显示限制性酶切图）Draw restriction pattern（显示限制性酶切模式图）Ignore enzymes with more than（忽略大于某设定值的酶切位点）Ignore enzymes with less than（忽略小于某设定值的酶切位点）Target DNA （目标DNA 特性）circular（环型DNA），dam/dcm methylation（dam/dcm 甲基化）all DNA in Sequence Channel（选择此项，在Sequence Channel 中的所有序列将被分析，如果选择了Draw restriction pattern，那么当所有的channel 中共有两条DNA 时，则只能选择两个酶分析，如果共有三个以上DNA 时，则只能用一个酶分析。

查看文章DNAMAN使用说明书（中文）2008年04月16日星期三下午10:50DNAMAN 是一种常用的核酸序列分析软件。

由于它功能强大，使用方便，已成为一种普遍使用的DNA 序列分析工具。

本文以DNAMAN 5.2.9 Demo version 为例，简单介绍其使用方法。

打开DNAMAN，可以看到如下界面：第一栏为主菜单栏。

除了帮助菜单外，有十个常用主菜单，第二栏为工具栏：第三栏为浏览器栏：在浏览器栏下方的工作区左侧，可见Channel 工具条，DNAMAN 提供20 个Channel，(如左所示：)点击Channel 工具条上相应的数字，即可击活相应的Channel。

每个Channel 可以装入一个序列。

将要分析的序列（DNA 序列或氨基酸序列）放入Channel 中可以节约存取序列时间，加快分析速度。

此版本DNAMAN 提供自动载入功能，用户只需激活某个Channel，然后打开一个序列文件，则打开的序列自动载入被激活的Channel 中。

本文以具体使用DNAMAN 的过程为例来说明如何使用DNAMAN 分析序列。

1．将待分析序列装入Channel（１）通过File Open 命令打开待分析序列文件，则打开的序列自动装入默认Channel。

（初始为channel1）可以通过激活不同的channel (例如：channel5)来改变序列装入的Channel。

（２）通过Sequence/Load Sequence 菜单的子菜单打开文件或将选定的部分序列装入Channel 。

通过Sequence/Current Sequence/Analysis Defination 命令打开一个对话框，通过此对话框可以设定序列的性质（DNA 或蛋白质），名称，要分析的片段等参数。

2．以不同形式显示序列通过Sequence//Display Sequence 命令打开对话框，如下图所示：根据不同的需要，可以选择显示不同的序列转换形式。

引物设计原则及酶切位点选择和设计：最初的时候，由于害怕设计酶切位点最后且不开，所以经常采用最通用的方法，用[整理]载体克隆解决问题，但后来发现她也有问题，就是浓度提不上去，你需要体大量的载体来T连入质粒中的重要目的酶切，所以感到还是直接扩增好一点。

但这就需要你仔细设计引物。

扩增出靶基因的时候在核就是进行酶切和连接，当然首先就是在想要合成或者是进行PCR可以在质粒的图谱说明书上酸的两端接入酶切位点，酶切位点是与你的质粒的特点相关的，找取相应的位点，进行设计。

（一）设计引物前应做的准备工作：准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分对片断进行酶切分析，确定一下那些酶切位点不能用准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用（二）设计引物所要考虑的问题往往导致两个，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，两个位点应是载体上的，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点。

只能切一个，酶都切不好。

因此，紧挨在一起，还有一种情况是：不能有碱基的交叉，比如promega的说明书上说，最好隔四个。

我看AGATCTTAAG，这样的位点比较难切。

两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。

最好使用酶切效率高的。

的酶。

最好使用双酶切有共同buffer最好使用自己实验室有的酶，这样可，ecor1等），最好使用较常用的酶（如hind3，bamh1以省钱。

的问题，很多的战友都有疑惑。

其实园子里有很多的解释了。

的计算，关于TmTm大家可以理解，双链溶解所需的温度。

即是DNA叫溶解温度（melting temperature, Tm），Tm因此，的溶解是没有作用的。

而不互补的区域对DNA 这个温度是由互补的DNA区域决定的，（除时，只计算互补的区域Tm才有贡献。

计算Tm只有和模板互补的区域对对于引物的Tm，过低，是因为他们误把保护碱。

不少战友设计的引物都Tm 非你的酶切位点也与模板互补）反应的诸多困难。

引物设计原则及酶切位点选择和设计[整理]：最初的时候，由于害怕设计酶切位点最后且不开，所以经常采用最通用的方法，用T载体克隆解决问题，但后来发现她也有问题，就是浓度提不上去，你需要体大量的载体来酶切，所以感到还是直接扩增好一点。

但这就需要你仔细设计引物。

连入质粒中的重要目的就是进行酶切和连接，当然首先就是在想要合成或者是进行PCR扩增出靶基因的时候在核酸的两端接入酶切位点，酶切位点是与你的质粒的特点相关的，可以在质粒的图谱说明书上找取相应的位点，进行设计。

（一）设计引物前应做的准备工作：准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分对片断进行酶切分析，确定一下那些酶切位点不能用准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用（二）设计引物所要考虑的问题两个位点应是载体上的，，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，往往导致两个酶都切不好。

因此，紧挨在一起，只能切一个，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点。

我看promega的说明书上说，最好隔四个。

还有一种情况是：不能有碱基的交叉，比如AGATCTTAAG，这样的位点比较难切。

两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。

最好使用酶切效率高的。

最好使用双酶切有共同buffer的酶。

最好使用较常用的酶（如hind3，bamh1，ecor1等），最好使用自己实验室有的酶，这样可以省钱。

Tm的计算，关于Tm的问题，很多的战友都有疑惑。

其实园子里有很多的解释了。

Tm叫溶解温度（melting temperature, Tm），即是DNA双链溶解所需的温度。

大家可以理解，这个温度是由互补的DNA区域决定的，而不互补的区域对DNA的溶解是没有作用的。

因此，对于引物的Tm，只有和模板互补的区域对Tm才有贡献。

计算Tm时，只计算互补的区域（除非你的酶切位点也与模板互补）。

不少战友设计的引物都Tm过低，是因为他们误把保护碱基和酶切位点都计算到Tm里了，最后的结果是导致了PCR反应的诸多困难。

DNAMAN中文使用说明好不容易找到了一个中文说明，希望可以帮助初学使用DNAMAN的朋友，更快的进入状态，当然现在网上也有汉化版的软件了，但是这个说明还是可以起到很好的帮助作用，与大家分享！DNAMAN 是一种常用的核酸序列分析软件。

由于它功能强大，使用方便，已成为一种普遍使用的DNA 序列分析工具。

本文以DNAMAN 5.2.9 Demo version 为例，简单介绍其使用方法。

打开DNAMAN，可以看到如下界面：第一栏为主菜单栏。

除了帮助菜单外，有十个常用主菜单，第二栏为工具栏：第三栏为浏览器栏：在浏览器栏下方的工作区左侧，可见Channel 工具条，DNAMAN 提供20 个Channel，(如左所示：)点击Channel 工具条上相应的数字，即可击活相应的Channel。

每个Channel 可以装入一个序列。

将要分析的序列（DNA 序列或氨基酸序列）放入Channel 中可以节约存取序列时间，加快分析速度。

此版本DNAMAN 提供自动载入功能，用户只需激活某个Channel，然后打开一个序列文件，则打开的序列自动载入被激活的Channel 中。

本文以具体使用DNAMAN 的过程为例来说明如何使用DNAMAN 分析序列。

1．将待分析序列装入Channel（１）通过File Open 命令打开待分析序列文件，则打开的序列自动装入默认Channel。

（初始为channel1）可以通过激活不同的channel (例如：channel5)来改变序列装入的Channel。

（２）通过Sequence/Load Sequence 菜单的子菜单打开文件或将选定的部分序列装入Channel 。

通过Sequence/Current Sequence/Analysis Defination 命令打开一个对话框，通过此对话框可以设定序列的性质（DNA 或蛋白质），名称，要分析的片段等参数。

2．以不同形式显示序列通过Sequence//Display Sequence 命令打开对话框，如下图所示：根据不同的需要，可以选择显示不同的序列转换形式。

经常有战友对一些常见问题在丁香园反复问答了很多遍，所以希望园子中一些战友，特别是低分与0分战友，能将好的帖子归纳总结了一下，并结合自己的经验整理，一方面这是个学习提高的过程，另一方面也能帮助大家解决这方面的问题。

同时如有不当或不完善的地方，希望各位战友不断补充，争取有朝一日我们能把园子里战友的经验系统整理，给大家以帮助。

我先把设计引物如何设计酶切位点这方面的帖子整理一下，因为昨天一下子看到三个相似问题。

原帖如下：我想向你求教一个问题,假如说我想把胰岛素基因和腺病毒载体连接起来,如何确定设计目的基因PCR时的引物呢?和相应的限制性核酸内切酶呢?谢谢老师能给予讲解,谢谢[整理]：最初的时候，由于害怕设计酶切位点最后切不开，所以经常采用最通用的方法，用T载体克隆解决问题，但后来发现她也有问题，就是浓度提不上去，你需要体大量的载体来酶切，所以感到还是直接扩增好一点。

但这就需要你仔细设计引物。

连入质粒中的重要目的就是进行酶切和连接，当然首先就是在想要合成或者是进行PCR扩增出靶基因的时候在核酸的两端接入酶切位点，酶切位点是与你的质粒的特点相关的，可以在质粒的图谱说明书上找取相应的位点，进行设计。

（一）设计引物前应做的准备工作：准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分对片断进行酶切分析，确定一下那些酶切位点不能用准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用（二）设计引物所要考虑的问题两个位点应是载体上的，，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，往往导致两个酶都切不好。

因此，紧挨在一起，只能切一个，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点。

我看promega的说明书上说，最好隔四个。

还有一种情况是：不能有碱基的交叉，比如AGATCTTAAG，这样的位点比较难切。

两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。

最好使用酶切效率高的。

最好使用双酶切有共同buffer的酶。

甲基化质粒构建甲基化质粒构建是基因治疗中的重要环节，其目的是将目的基因插入甲基化质粒载体中，以保护目的基因免受宿主细胞免疫系统的攻击。

本文将介绍甲基化质粒构建的七个方面。

1.目的基因获得目的基因可以通过基因文库、PCR、人工合成等方式获得。

这些方法都可以得到目的基因的DNA序列，但需要对其表达量和纯度进行鉴定。

2.甲基化酶切位点添加为了将目的基因插入甲基化质粒载体中，需要在目的基因和载体中添加适当的甲基化酶切位点。

这些位点可以是一些特定的酶切位点，如SacⅠ、KpnⅠ、EcoRⅠ等。

添加这些位点可以通过一些基因工程手段实现，如通过DNA重组技术将甲基化酶切位点序列添加到目的基因和载体中。

3.甲基化质粒载体构建甲基化质粒载体是携带甲基化酶切位点的质粒，可以将目的基因运送到宿主细胞中。

构建甲基化质粒载体的方法包括将甲基化酶切位点插入到质粒载体的合适位置，并保证其稳定性和可复制性。

插入位点应该选择多拷贝数和高转录效率的位点，以保证目的基因的高效表达。

4.目的基因与甲基化质粒载体酶切后连接将目的基因与甲基化质粒载体进行酶切后，可以使用DNA连接酶将它们连接起来。

这一步骤需要选择合适的连接方式，如通过T4DNA 连接酶进行连接。

同时，连接过程中需要注意温度、pH值、离子浓度等参数，以保证连接的效率和稳定性。

5.连接产物转化连接产物需要在受体细胞中进行转化，以得到甲基化阳性克隆。

转化方法可以是有丝分裂转化或电转化，其中电转化效率较高。

在进行转化时，需要选择合适的受体细胞，如大肠杆菌、酵母等。

同时，需要对受体细胞进行筛选，以得到含有目的基因的阳性克隆。

6.甲基化阳性克隆筛选甲基化阳性克隆是指含有目的基因并且具有甲基化酶切位点的克隆。

筛选这些阳性克隆可以通过一些分子生物学技术，如PCR、DNA 测序等。

初步筛选可以找到一些阳性克隆，但为了确保目的基因的稳定表达和正确甲基化，需要进行进一步鉴定。

7.甲基化质粒大量制备在得到甲基化阳性克隆后，需要进行大量制备以满足后续实验或应用的需求。

引物加酶切位点的原理
引物加酶切位点是一种在分子生物学实验中常用的技术，用于引导限制性内切酶切割特定的DNA序列。

其原理如下：
1. 设计引物：首先，根据需要切割的DNA序列，设计两个引物。

这两个引物通常位于目标序列的两端，其序列会与目标序列的末端互补配对。

引物的设计要求尽可能准确，以确保引物与目标序列的互补配对能够稳定形成。

2. 引物结合：将设计好的引物与待切割的DNA序列加热至高温，使其双链DNA解链。

随后，将体系温度降低，使引物与DNA序列的互补链能够重新结合。

3. 添加限制性内切酶：在引物结合的体系中添加限制性内切酶。

限制性内切酶是一类能够识别并切割特定DNA序列的酶。

它
们通常与特定的核酸序列互作，并在该序列特定的位置引发剪切作用。

4. 酶切：限制性内切酶与DNA序列中的酶切位点结合，以酶
切作用切割DNA链。

由于引物结合形成的DNA序列中引入
了酶切位点，因此限制性内切酶能够在这些位点上发挥作用，导致DNA序列在酶切位点处断裂。

5. 分析：酶切作用后，可通过各种分析方法来检测DNA序列
的切割情况。

常见的方法包括琼脂糖凝胶电泳、聚合酶链反应（PCR）、或者直接观察DNA条带的可见性。

总结起来，在引物加酶切位点的方法中，引物的设计与酶切位点的结合是关键步骤。

通过合理设计引物，并选择适合的限制性内切酶，可以实现精确的DNA序列切割。

这对于分子生物
学研究、基因工程、或者遗传性疾病诊断等领域具有重要意义。

经常有战友对一些常见问题在丁香园反复问答了很多遍，所以希望园子中一些战友，特别是低分与0分战友，能将好的帖子归纳总结了一下，并结合自己的经验整理，一方面这是个学习提高的过程，另一方面也能帮助大家解决这方面的问题。

同时如有不当或不完善的地方，希望各位战友不断补充，争取有朝一日我们能把园子里战友的经验系统整理，给大家以帮助。

我先把设计引物如何设计酶切位点这方面的帖子整理一下，因为昨天一下子看到三个相似问题。

原帖如下：我想向你求教一个问题,假如说我想把胰岛素基因和腺病毒载体连接起来,如何确定设计目的基因PCR时的引物呢?和相应的限制性核酸内切酶呢?谢谢老师能给予讲解,谢谢[整理]：最初的时候，由于害怕设计酶切位点最后切不开，所以经常采用最通用的方法，用T载体克隆解决问题，但后来发现她也有问题，就是浓度提不上去，你需要体大量的载体来酶切，所以感到还是直接扩增好一点。

但这就需要你仔细设计引物。

连入质粒中的重要目的就是进行酶切和连接，当然首先就是在想要合成或者是进行PCR扩增出靶基因的时候在核酸的两端接入酶切位点，酶切位点是与你的质粒的特点相关的，可以在质粒的图谱说明书上找取相应的位点，进行设计。

（一）设计引物前应做的准备工作：准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分对片断进行酶切分析，确定一下那些酶切位点不能用准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用（二）设计引物所要考虑的问题两个位点应是载体上的，，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，往往导致两个酶都切不好。

因此，紧挨在一起，只能切一个，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点。

我看promega的说明书上说，最好隔四个。

还有一种情况是：不能有碱基的交叉，比如AGATCTTAAG，这样的位点比较难切。

两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。

最好使用酶切效率高的。

最好使用双酶切有共同buffer的酶。

1.设计引物前应做的准备：准备载体图谱，大致准备把片段插在哪个部分，对片段进行酶切分析，确定哪些酶切位点不能用，准备一本公司酶的商品目录，便于查询各种酶的数据及两种酶是否可以配用。

2.设计引物所要考虑的问题是两个位点应是载体上的，所以连接片段上没有这两个位点，且距离不能太近，往往导致两个酶都切不好。

因此，紧挨在一起，只能切一个，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点，最好是隔4隔。

两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。

最好使用酶切效率高的。

最好使用双酶切有共同的buffer的酶。

2.关于Tm。

设计引物的时候先不管5端的修饰序列，把互补区的T值控制在55度以上，在加上酶切位点和保护碱基。

高的T值引物就比较容易克服3端发卡，二聚体及3，非特异结合等问题。

3.引物间的自由能的绝对值，如果小于10一般是问题不大的。

如果稍大，PCR时可以提高一下退火温度，一般是没有问题的。

如果3，端形成二聚体，并且自由能绝对值较大，如果PCR没有条带，建议重新设计引物。

此外，所加的三个核苷酸的保护序列经过尽心设计有时候也可以降低二聚体的自由能。

在设计酶切位点时最好能尽可能多的利用引物本身的碱基。

这是因为一个特异性引物一般都是20bp左右，在加上酶切位点序列和保护碱基，大致就是28bp。

4.设计时限制性酶切位点应该是在5端的顶端。

在设计引物时，常在5端添加酶切位点，以利于PCR产物连接到载体。

设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。

先利用软件设计出合适的引物，引物的3端是引发延伸的起点，因此一定要与模板准确配对，应尽量避免在引物3端的第一位碱基是A.（容易错配）引物3端最佳碱基是G或C，行程的碱基比较稳定。

5.酶切位点都需要保护碱基，以利于内切酶的有效切割，酶切位点前加保护碱基1，两个酶切位点至少隔上3个碱基，在做载体构建的时候设计引物扩增片段进行定向连接，除了酶切位点，还要在两端加一个3个核算的保护序列，否则PCR产物很难被酶切，因此就会导致连接失败，因为内切酶需要一定的辅助性碱基才能顺利切割，在没有辅助碱基的情况下，有的酶是可以切割的，比如：Shali和SpeI,他们不需要辅助性碱基即可切割。

寡核苷酸近末端位点的酶切(Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides))为什么要添加保护碱基？在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。

由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。

其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。

该如何添加保护碱基？添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。

什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。

添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。

如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。

为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。

实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。

在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。

单位的寡实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260核苷酸。

取1 µg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。

反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl,25 mM DTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。

20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。

本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。

酶切位点的设计（一）设计引物前应做的准备工作：准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分对片断进行酶切分析，确定一下那些酶切位点不能用准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用（二）设计引物所要考虑的问题两个位点应是载体上的，，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，往往导致两个酶都切不好。

因此，紧挨在一起，只能切一个，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点。

我看promega的说明书上说，最好隔四个。

还有一种情况是：不能有碱基的交叉，比如AGATCTTAAG，这样的位点比较难切。

两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。

最好使用酶切效率高的。

最好使用双酶切有共同buffer的酶。

最好使用较常用的酶（如hind3，bamh1，ecor1等），最好使用自己实验室有的酶，这样可以省钱。

Tm的计算，关于Tm的问题，很多的战友都有疑惑。

其实园子里有很多的解释了。

Tm叫溶解温度（melting temperature, Tm），即是DNA双链溶解所需的温度。

大家可以理解，这个温度是由互补的DNA区域决定的，而不互补的区域对DNA的溶解是没有作用的。

因此，对于引物的Tm，只有和模板互补的区域对Tm才有贡献。

计算Tm时，只计算互补的区域（除非你的酶切位点也与模板互补）。

不少战友设计的引物都Tm过低，是因为他们误把保护碱基和酶切位点都计算到Tm里了，最后的结果是导致了PCR反应的诸多困难。

所以，设计引物的时候，先不管5'端的修饰序列，把互补区的Tm控制在55度以上（我喜欢控制在58以上，具体根据PCR的具体情况，对于困难的PCR，需要适当提高Tm），再加上酶切位点和保护碱基，这样的引物通常都是可用的，即使有小的问题，也可以挽回。

Tm温度高的引物就比较容易克服3‘发卡、二聚体及3'非特异结合等问题。

简单的计算公式可以用2+4的公式。

若你计算的Tm值达到了快90 ，不包括酶切位点。

DNAMAN使用方法DNAMAN 是一种常用的核酸序列分析软件。

由于它功能强大，使用方便，已成为一种普遍使用的DNA 序列分析工具。

本文以DNAMAN 5.2.9 Demo version 为例，简单介绍其使用方法。

打开DNAMAN，可以看到如下界面:第一栏为主菜单栏。

除了帮助菜单外，有十个常用主菜单，如下所示第二栏为工具栏:如下所示:第三栏为浏览器栏:如下所示:在浏览器栏下方的工作区左侧，可见Channel 工具条，DNAMAN 提供20 个Channel，点击Channel 工具条上相应的数字，即可击活相应的Channel。

每个Channel 可以装入一个序列。

将要分析的序列(DNA 序列或氨基酸序列)放入Channel 中可以节约存取序列时间，加快分析速度。

此版本DNAMAN 提供自动载入功能，用户只需激活某个Channel ，然后打开一个序列文件，则打开的序列自动载入被激活的Channel 中。

本文以具体使用DNAMAN 的过程为例来说明如何使用DNAMAN 分析序列。

1(将待分析序列装入Channel(1)通过File|Open 命令打开待分析序列文件，则打开的序列自动装入默认Channel。

(初始为 channel1)可以通过激活不同的channel(例如:channel5)来改变序列装入的Channel。

(2)通过Sequence|Load Sequence 菜单的子菜单打开文件或将选定的部分序列装入Channel。

可以通过Sequence|Current Sequence|Analysis Defination 命令打开一个对话框，通过此对话框可以设定序列的性质(DNA 或蛋白质)，名称，要分析的片段等参数。

2(以不同形式显示序列通过Sequence|Display Sequence 命令打开对话框，如下图所示:根据不同的需要，可以选择显示不同的序列转换形式。

对话框选项说明如下: Sequence &Composition 显示序列和成分Reverse Complement Sequence 显示待分析序列的反向互补序列Reverse Sequence 显示待分析序列的反向序列Complement Sequence 显示待分析序列的互补序列Double Stranded Sequence 显示待分析序列的双链序列RNA Sequence 显示待分析序列的对应RNA 序列参数说明如下:Results 分析结果显示其中包括:Show summary(显示概要) Show sites on sequence(在结果中显示酶切位点) Draw restriction map(显示限制性酶切图)Draw restriction pattern(显示限制性酶切模式图) Ignore enzymes with more than(忽略大于某设定值的酶切位点) Ignore enzymes with less than(忽略小于某设定值的酶切位点)Target DNA (目标DNA 特性)circular(环型DNA)，dam/dcm methylation(dam/dcm 甲基化)all DNA in Sequence Channel(选择此项，在Sequence Channel中的所有序列将被分析，如果选择了Draw restriction pattern，那么当所有的channel 中共有两条DNA 时，则只能选择两个酶分析，如果共有三个以上DNA 时，则只能用一个酶分析。

酶切位点保护碱基-PCR引物设计用于限制性内切酶酶切反应本文给出了分子克隆中常用限制性内切酶的保护碱基序列，如AccI，AflIII，AscI，AvaI，BamHI，BglII，BssHII，BstEII，BstXI，ClaI，EcoRI，HaeIII，HindIII，K pnI，MluI，NcoI，NdeI，NheI，NotI，NsiI，PacI，PmeI，PstI，PvuI，SacI，S acII，SalI，ScaI，SmaI，SpeI，SphI，StuI，XbaI，XhoI，XmaI，为什么要添加保护碱基？在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。

由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。

其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。

该如何添加保护碱基？添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。

什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。

添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。

如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。

为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。

实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。

在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。

实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。

限制性内切酶酶切的常见问题及解决方法，个人觉得总结得很好，特转贴供本供大家分享。

酶切出现问题，先看内切酶说明书，相应试剂公司目录。

不同公司出产的内切酶，菌株来源、制备工艺、纯度活力、酶切活性优化可能不同，酶切效果也有差别。

可在上面找到酶单位定义、保存条件、酶切体系[buffer及与其它酶双切的buffer等]、酶切反应温度[有些酶是在50、55或30等温度下反应的]、酶是否受甲基化影响、是否有星号活性及出现星号活可能因素、保护性碱基，同尾酶、同裂酶等等。

1. 酶切不开或不完全1.1 质粒问题纯度差或残留酶切抑制物最为常见。

杂蛋白存在会影响酶切，表现为A260/A280低于1.8；抑制物常见酚、盐、乙醇等。

[重新提DNA，使用可靠试剂盒或可靠手工提取试剂]1.2 酶的问题：确认内切酶有效 [很多内切酶虽然有过期时间，但过期后只要能够有效酶切，可用。

确认酶切效果不好，做标记，更换] 。

【题外话：用内切酶注意】a. 内切酶如无特殊要求，保存-20~-30度。

并非越低越好，酶通常是保存在50％甘油缓冲液中，温度过低时，酶会发生冻结（运输过程例外，由于酶需要低温运输，所以方便的情况下是使用干冰，酶会冻结，但冻结次数有限，相对是一种比较好的选择），如果是经常使用的话，酶会被反复冻融，从而降低了活性。

当然如果温度过高，呵呵，你就自己想去吧。

b. 酶在使用时应置于冰盒中取酶。

这点大家都清楚，不过多强调也没坏处。

因为实验室有些同学，酶取出后是放在冰盒上的，但有两点忽略了：拿酶的时候，手不是抓着管子上端，而握在管子的底部，相当于用手在给酶进行加热；有些酶是放在冰盒中，但吸酶的时候，还是将酶拿出来。

偶尔一次没有大碍，反复如此，可能会影响酶活。

c. 酶使用完后应尽快旋紧盖子。

有时我们可以发现，即使是-20~-30度放置，酶仍然会冻结。

个人认为的可能原因是由于在配置酶切反应时，酶管的盖子在较长时间的开着，甘油会吸取空气中的水分，对于常用的大包装的酶有时就会出现冻结现象。

目的基因限制酶切位点
限制酶切位点应位于目的基因两侧，以确保后续构建载体时能够用限制性酶切出粘性末端，进而将目的基因构建到相应的载体中。

选择限制酶切位点时应确保位点数量，尽量保证后续操作的高效性和特异性。

在确定目的基因和载体上合适的限制酶切位点时，需要注意以下因素：
1.酶切位点数量：需要足够的限制酶切位点以确保能够选择合适的酶进行切割。

一般来说，目的基因和载体上应各有一个限制酶切位点。

2.酶切位点位置：限制酶切位点的位置应位于目的基因的两侧，以确保能够切割出完整的粘性末端。

同时，应尽量选择距离连接部位较近的酶切位点，以减少连接操作的难度。

3.特异性：应选择特异性较高的限制酶切位点，以避免切割过程中出现非特异性切割的情况。

这样可以提高后续操作的成功率和准确性。

4.酶切效率：选择限制酶切位点时应考虑酶切效率，尽量选择切割效率较高的限制酶。

高效率的切割可以减少操作时间，提高实验效率。

5.避免启动子和终止子：在选择限制酶切位点时应尽量避免切割位于标记基因、启动子和终止子上的位点，以避免破坏这些重要序列。

总之，选择合适的限制酶切位点是构建载体和克隆基因的关键步骤之一。

通过综合考虑以上因素，可以找到适合的限制酶切位点，提高实验的成功率和准确性。

引物添加酶切位点
引物添加酶切位点是分子生物学中常用的一种技术，用于在PCR 扩增过程中选择性地切割目标DNA的特定部位。

这种技术可以在PCR 扩增和DNA克隆等实验中起到很好的作用。

在引物设计时，可以将酶切位点添加到引物的两端。

当PCR扩增产生一段DNA片段后，酶切位点可以被特定的限制性内切酶识别并切割。

这样，只有目标DNA的特定部位被切割并保留下来，而非目标部位的DNA则被消除。

引物添加酶切位点的优点在于可以选择性地扩增目标DNA，减少了污染和杂交的可能性。

同时，也方便了后续实验的进行，如DNA克隆、测序等。

然而，引物添加酶切位点也存在一些缺点。

例如，酶切位点的添加可能会影响引物的互补性和特异性，导致扩增效率下降和非特异性扩增的出现。

此外，有些限制性内切酶的切割效率也可能受到PCR条件的影响，需要进行优化。

总的来说，引物添加酶切位点是一种有用的技术，可以在PCR扩增和DNA克隆等实验中起到很好的作用。

在实际应用中，需要根据具体实验的需要进行优化和调整，以确保实验的成功。

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