软骨细胞培养

摘要：本研究旨在通过体外培养软骨细胞，探讨软骨细胞的生长特性、增殖能力及其在生物医学领域的应用潜力。

通过一系列实验，我们对软骨细胞的体外培养条件、增殖状态、细胞形态及功能进行了深入研究。

以下为实验总结。

一、实验目的和要求：1. 建立软骨细胞体外培养体系，优化培养条件。

2. 观察软骨细胞的增殖状态、细胞形态变化及功能表达。

3. 探讨软骨细胞在生物医学领域的应用前景。

二、实验仪器设备：1. 培养箱2. 超净工作台3. 移液器4. 倒置显微镜5. CO2培养箱6. 电热恒温水浴锅7. 流式细胞仪8. 低温离心机9. 低温冰箱三、实验设计及调试：（一）实验内容：1. 软骨细胞分离与培养2. 软骨细胞增殖实验3. 软骨细胞形态观察4. 软骨细胞功能实验（二）实验电路：无（三）实验设计及调试步骤：1. 对实验内容和实验电路进行分析，理出完成实验的设计思路。

2. 列出程序设计所需的特殊标志位、堆栈sp、内部ram、工作寄存器等资源的分配列表，分配列表时注意考虑资源在程序执行过程可能会出现冲突的问题。

3. 画出程序设计流程图，包括主程序和各子程序流程图。

4. 根据上述内容写出实验程序。

5. 调试程序，使用模拟仿真器进行模拟实验，观察结果，修改程序，继续调试，直至实验成功。

（四）实验调试过程中所遇到的问题、解决问题的思路和方法：1. 问题：软骨细胞在培养过程中出现污染。

解决方法：加强无菌操作，提高实验室空气质量，定期更换培养箱内的空气。

2. 问题：软骨细胞增殖缓慢。

解决方法：优化培养条件，调整细胞密度，增加生长因子。

3. 问题：软骨细胞功能表达不足。

解决方法：延长培养时间，提高细胞浓度，优化培养条件。

四、实验结果与分析：1. 软骨细胞在体外培养条件下，成功分离并建立了稳定的细胞系。

2. 软骨细胞增殖实验结果显示，细胞在体外培养条件下具有较好的增殖能力。

3. 软骨细胞形态观察表明，细胞呈典型的软骨细胞形态，细胞质丰富，细胞核清晰。

软骨细胞培养及其调控(一)关键词：软骨细胞自从1965年chestman和Smith首先开始软骨细胞体外培养用于软骨缺损修复的研究以来〔1〕，人们开始对关节软骨损伤不能通过自身的软骨增殖修复的概念有了新的认识。

实验证明不仅年幼且年老的关节软骨标本仍可在体外培养出新生透明软骨〔2〕。

虽然软骨细胞增殖能力有限，其质与量直接影响体外培养扩增效果，软骨细胞生长环境不同所表现出的生物学特性也有差别。

软骨细胞在悬浮培养或半固体琼脂培养基中生长良好并保持表型稳定，在培养瓶底水凝胶覆盖的四维培养环境中长期培养时软骨细胞可形成结节结构其细胞形态胞外基质分泌和软骨特异性基因表达皆与关节软骨相似。

软骨细胞的生长密度对其生长也至关重要。

在同样的条件下体外单层培养时，由于细胞密度不同，软骨细胞的生长分裂经过和形态功能完全不同。

组织学检查表明，细胞形态不同，其碱性磷酸酶活性、细胞分泌特异性基质的功能及对细胞作用因子的反应也不同，进一步研究表明，软骨细胞靠自分泌或旁分泌信号的方式而存活。

1细胞因子对体外培养软骨细胞的影响软骨细胞的有限增殖性及存活密度的要求是限制软骨细胞单层培养修复关节软骨缺损及体外大量扩增的因素之一，随着细胞生物学的发展，软骨细胞体外培养特异基因表达的研究日益深入，细胞因子参与调节软骨细胞的增殖、分化过程渐被人们所揭示，这对软骨细胞体外培养研究又提出了一个新方向。

近年来，关于细胞因子等多肽蛋白质对软骨细胞体外增殖分化等的影响研究也较多。

也有些学者发现软骨细胞内含许多细胞因子及其受体，且表明许多细胞因子通过自分泌或旁分泌两种基本方式来调节软骨细胞。

目前认为促进软骨细胞增殖和基质合成代谢的细胞因子有：IGFs.TGF-βs.PDGF,FGF.EGF，对软骨细胞有抑制作用的有IL-1、IL-2、IL-7、TNF-α、IFN-γ等，现就对软骨细胞有显著调节的细胞因子分述如下：1.1转化生长因子beta(TGF-β)TGF-β最初是由Robert等学者在1978年作为一种可诱导大鼠成纤维细胞增殖因子而描述。

实验方法各种溶液的配制1、配制D-Hanks液(无钙镁)1L，PH8-9（1）称量Nacl8.0g，kcl0.4g,Na2Hpo4.H2o 0.06g, kH2po40.06g，NaHco30.35g，酚红0.02g（2）依次将各成分逐个溶解于800ml水中。

（3）用5.6% NaHco3溶解酚红0.02克。

（4）将酚红液（３）加入（２）中。

（5）补加水至1000ml，混匀。

（6）将Hanks液分装盐水瓶内，110℃、8镑高压蒸汽消毒灭菌20分钟，4℃冰箱保存备用。

2、配制0.25%胰蛋白酶溶液75ml（1）称取胰蛋白酶187.5mg，用少量D-Hanks液先将胰蛋白酶粉末调成糊状。

（2）补足Hanks液至75ml，搅拌混匀，置40℃水浴搅拌帮助溶解。

（3）冷却至室温后，置4℃冰箱过夜。

（4）用滤纸粗滤，再用0.22μm微孔过滤膜过滤除菌。

（5）分装小瓶，低温冰箱冰冻保存备用。

3、配制0.3%Ⅱ型胶原酶溶液49.5ml（1）称取Ⅱ型胶原酶150mg，用D-Hanks液溶解。

（2）补足Hanks液至49.5ml，搅拌混匀。

（3）用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。

（4）分装小瓶，低温冰箱保存备用。

4、配制闪烁液（1）用电子天平称取POPOP 0.2g，PPO 2.0g。

（2）将上二者溶解在500ml二甲苯中，避光保存，备用。

取材与培养（1）取3kg重6月龄青紫蓝兔一只(购自首都医科大学动物房)，兔耳静脉注射5ml空气致死。

（2）无菌条件下取双侧下肢膝，髋关节面软骨，置于D-Hanks液中漂洗2次,并用眼科剪将软骨剪碎至1mm3大小,继续用D-Hanks液漂洗2次。

（3）吸去漂洗液，加入0.25%胰蛋白酶溶液，并置入37℃、5%CO2孵箱中消化30分钟,中途不时摇晃。

（4）吸出胰蛋白酶溶液，加入0.3%Ⅱ型胶原酶溶液，置入37℃、5%CO2孵箱中继续消化3小时。

每1小时更换Ⅱ型胶原酶溶液1次。

用离心管留取各次消化液，离心2000rpmX10min，去除上清液。

人骨关节炎软骨细胞的体外分离与培养魏钰;魏民【摘要】背景:大量针对骨关节炎细胞水平的研究仍集中在动物模型关节软骨细胞的体外培养.动物模型引发的退变效应与人骨关节炎的发生并不完全一致.如何利用人骨关节炎软骨组织构建体外细胞模型并研究其特征性蛋白变化趋势,是模拟体内骨关节炎软骨退变过程的关键.目的:探讨人骨关节炎软骨细胞的体外分离、培养方法,观察原代至第3代人骨关节软骨细胞的形态学特性和相关蛋白表达变化.方法:取6例因重度骨关节炎行关节置换术患者的废弃软骨组织(获得中国人民解放军总医院医学伦理委员会批准,伦理批号为S2017-23-7),男2例,女4例;年龄62-72岁,平均(68.3±3.39)岁,采用一步酶消化法(Ⅱ型胶原酶)分离培养人骨关节炎软骨细胞,并进行传代培养,从而构建体外人骨关节炎软骨细胞培养体系.倒置相差显微镜观察各代细胞形态;苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫荧光染色方法进行细胞鉴定.采用Western blot法检测各代软骨细胞于70％融合率时Col2a、Aggrecan与MMP-13的表达.结果与结论:经过Ⅱ型胶原酶消化后,培养1周左右可见组织块周围爬出散在的细胞,3周左右可传代进行下一步研究;形态学、苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色与Ⅱ型胶原免疫荧光染色证明培养出的细胞为人软骨细胞.第3代软骨细胞Col2a、Aggrecan的相对表达量与原代比较有明显降低(P<0.01),且随着培养代数增加表达逐渐降低;MMP-13随着培养代数的增加表达逐渐增强(P<0.01).结果表明,Ⅱ型胶原酶一步消化法可成功从标本中分离出骨关节炎软骨细胞并传代培养.体外培养的骨关节炎软骨细胞去分化特性随着传代次数增加而逐渐增强,功能性蛋白表达整体下降.3代以内的软骨细胞符合人骨关节炎时软骨退变的表现,可能是用于实验研究的最佳选择.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2019(023)025【总页数】6页(P4056-4061)【关键词】骨关节炎;关节置换;人软骨细胞;一步酶消化法;Ⅱ型胶原酶;Ⅱ型胶原;聚集蛋白聚糖;国家自然科学基金【作者】魏钰;魏民【作者单位】中国人民解放军总医院,北京市 100000;中国人民解放军总医院,北京市 100000【正文语种】中文【中图分类】R459.9;R394.20 引言 Introduction骨关节炎是最常见的老年退行性关节疾病，以软骨磨损和骨质增生为主要特征[1]。

作者单位：湖北医药学院附属襄阳市第一人民医院麻醉科，湖北襄阳441000通信作者：罗辉宇，E⁃mail：****************·实验研究论著·大鼠软骨细胞与兔软骨细胞的培养与比较张振罗辉宇曾炼【摘要】目的体外分离培养大鼠及兔膝关节软骨细胞，观察并比较两种软骨细胞的培养特点。

方法采用机械-酶消化法处理SD大鼠幼鼠和新西兰兔的软骨组织，传代培养，倒置显微镜观察细胞形态，细胞计数法测定生长曲线，实时定量PCR测定不同代数的软骨细胞Ⅱ型胶原与含血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶5（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs5,ADAMTS5）表达水平，甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原酶免疫荧光染色对细胞进行鉴定。

结果原代培养大鼠软骨细胞12h，内贴壁成多角形或不规则型，排列成“铺路石”状，培养3~5d后进入快速增殖期，1周后进行细胞传代培养。

兔软骨细胞相对贴壁缓慢，生长滞后。

两类软骨细胞随着培养代数的增加，Ⅱ型胶原蛋白的mRNA表达量逐渐减少，ADAMTS5的表达逐代升高，表明随着培养代数的增加，软骨细胞活力逐渐下降。

相同代数的大鼠软骨细胞活性较兔软骨细胞更高。

甲苯胺蓝染色可见大鼠软骨细胞内成蓝色异染的糖胺多糖成分。

不同波段的荧光激发下，Ⅱ型胶原酶免疫荧光染色可见大鼠原代培养的软骨细胞胞浆和胞膜呈清晰的绿色荧光，兔软骨细胞呈红色荧光，细胞核为明亮的蓝色荧光。

结论本实验通过比较大鼠及新西兰兔软骨细胞的培养与特点，证实随培养代数增加，软骨细胞活性逐渐降低，且相同代数大鼠软骨细胞较兔软骨细胞具备更高活性。

【关键词】关节软骨；软骨细胞；细胞分离培养Culture and comparison of rat and rabbit chondrocytes.ZHANG Zhen,LUO Hui⁃yu,ZENG Lian. Department of Anesthesiology,Xiangyang First People s Hospital,Hubei Medical University,Xiangyang441100, ChinaCorresponding author:LUO Hui⁃yu,E⁃mail:****************【Abstract】Objective To isolate and culture rat and rabbit knee chondrocytes in vitro,observe and compare the culture characteristics of the chondrocytes in rats and rabbits.Methods Chondrocytes were obtained by the mechanical separation combined with typeⅡcollagenase enzymatic digestion from the cartilage of young SD rats and New Zealand white rabbits,and subcultured.The cell morphology was observed by an inverted microscope,growth curve was measured by cell counting,the expression levels of collagenⅡand a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs5(ADAMTS5)in different generations of chondrocytes were detected by real⁃time PCR,and the cells were identified by toluidine blue staining and type Ⅱcollagenase immunofluorescence staining.Results Primary cultured rat chondrocytes were presented with polygonal or irregular shape after12h,and arranged as“paving stones”.After culture for3⁃5d,chondrocytes entered a period of rapid proliferation and cell subculture was carried out after1week.The chondrocytes of rabbits were adhered and grew slower than the rat chondrocytes.By comparing the expression of CollagenⅡand ADAMTS5in two types of different generation chondrocytes,it was found that the expression of CollagenⅡin both chondrocytes decreased from generation to generation and that of ADAMTS5increased,indicating that the activity of chondrocytes gradually decreased with the increase of chondrocytes generation.And the rat chondrocytes of the same generation had higher activity than rabbit chondrocytes.The toluidine blue staining revealed that there were some blue⁃stained glycosaminoglycan components in chondrocytes.Under the fluorescence excitation of different wave bands,collagenase typeⅡimmunofluorescence staining showed clear green fluorescence in the cytoplasm and membrane of primary cultured rat chondrocytes,and red fluorescence of rabbit chondrocytes,the nucleus was bright blue fluorescence.Conclusion The study compared the culture and characteristics of chondrocytes in rats and New Zealand rabbits.It was confirmed that the chondrocyte activity gradually decreased with the increase of culture passages,and that rat chondrocytes of the sameDOI：10.3969/j.issn.1674⁃8573.2020.04.010generation had higher activity than rabbit chondrocytes.【Key words】Articular cartilage;Chondrocytes;Cell isolation culture骨性关节炎（Osteoarthritis,OA）作为一种慢性的关节退行性病变，其主要的病理改变是关节软骨损伤［1］。