SOD活性测定POD活性测定CAT活性测定质膜透性测定MDA含量测定色素含量测定实验方案及数据记录表格

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化复原法）1、试剂的配制1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液:取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/LPBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4)228.75ml，B母液(NaH2PO4)21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。

参照文件：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育第一版社，2000：267～268。

2）14.5mM甲硫氨酸溶液：取2.1637gMet用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至1000ml。

（3）30μMEDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。

（4）60μM核黄素溶液：取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保留。

5）2.25mM氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.1840gNBT用PBS定容至100ml，避光保留。

酶液制备：取0.2g（可视状况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入1.6ml50mmol/L 预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。

2、酶活性测定1）反响混淆液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液0.6ml，磷酸缓冲液5.4ml，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混淆后摇匀；（2）分别取3ml反响混淆液和30μl酶液于试管中光照下反响（3）将试管置于光照培育箱中在4000lux20min；同时做两支比较管，此中后测定作为最大光复原管，1支试管取3ml反响混淆液加入30μlPBS（不加酶液）照光另1支只加缓冲液置于暗中测准时用于调零。

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制（1）L磷酸缓冲液(PBS，：A母液：L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量）71.7g；B母液：L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量）31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml。

L PBS（）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) ，B母液(NaH2PO4) ，用蒸馏水定容至1000ml。

参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。

（2）甲硫氨酸溶液：取 Met用磷酸缓冲液（）定容至1000ml。

（3）30μM EDTA-Na2溶液：取用磷酸缓冲液定容至100ml。

（4）60μM核黄素溶液：取核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。

（5）氮蓝四唑(NBT)溶液：取 NBT用PBS定容至100ml，避光保存。

酶液制备：取（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。

2、酶活性测定（1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液，磷酸缓冲液，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀；（2）分别取3ml反应混合液和30μl酶液于试管中（3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反应20min；同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30μl PBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。

（4）以不照光的对照管（只有缓冲液并置于暗处）调零后，避光测OD560(出现颜色即可测定)。

（5）酶活性计算：SOD活性单位以抑制NBT光化还原50％所需酶量（测的样品值要在最大管的一半左右才合适，否则要调整酶量）为1个酶活单位（u）。

SOD，POD,CAT测定方法抗氧化酶活性的测定：（2.5g样）0.05mol/L磷酸缓冲溶液 (PBS)（pH=7.8）溶液的配制：65.5506g Na2HPO4·12H2O + 2.65285gNaH2PO4·2H2O, 定容到4L。

（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》，P134）。

取低温保存的鲜样，称2g左右的叶片（或根）放在50ml的离心管，加入20ml浓度为0.05mol/L 磷酸缓冲溶液（pH=7.8）（最好是较冷的磷酸缓冲溶液，防止研磨时温度过高使酶失活），研磨（用磨碎机磨），8000r/min的冷冻离心机下离心20分钟，上清液为粗酶液。

1超氧化物歧化酶（SOD）的测定：NBT(400ml)混合反应液:392mlPBS(Ph=7.8),+0.0206g NBT+ 0.776g甲硫酸铵+8ml核黄素溶液+0.4ml EDTA-Na溶液（100mlPBS缓冲溶液中含0.01204g核黄素）。

（另配）100ml PBS溶液加EDTA-Na 3.7224gEDTA-Na测试时：取3ml反应液+0.05ml(根)或0.02 ml(叶)粗酶液，于光照培养箱中6-10分钟，OD650下测定吸光度。

2过氧化物酶（POD）的测定：0.05mol/L磷酸缓冲溶液(PBS)（pH=7.0）溶液的配制：10.9251g Na2HPO4·12H2O + 3.042975gNaH2PO4·2H2O,定容到1000ml。

0.3%H2O2溶液的配制：吸2.5ml 30%H2O2，用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)定容到250ml。

0.2%愈创木酚溶液的配制：称0.5g愈创木酚，用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)定容到250ml。

2ml 0.3%H2O2溶液 + 0.95ml 0.2%愈创木酚溶液 + 1ml 0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)+ 0.02ml？？（原来为0.01）酶液（根加0.05ml酶液）（对照用0.05mol/L磷酸缓冲溶液代替酶液）（做三个重复），记录470nm处OD降低速度。

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。

参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。

（2）14.5mM甲硫氨酸溶液：取2.1637g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至1000ml。

（3）30μM EDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。

（4）60μM核黄素溶液：取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。

（5）2.25mM 氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.1840g NBT用PBS定容至100ml，避光保存。

酶液制备：取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入1.6ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。

2、酶活性测定（1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液0.6ml，磷酸缓冲液5.4ml，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀；（2）分别取3ml反应混合液和30μl酶液于试管中（3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反应20min；同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30μl PBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。

抗氧化酶活性测定方法抗氧化酶是一类对抗氧化反应具有重要作用的酶。

其主要功能是清除体内的自由基，抑制过氧化物形成和脂质氧化反应，从而保护细胞免受氧化应激的伤害。

测定抗氧化酶活性有助于评估生物体内的氧化应激水平，为疾病的诊断和治疗提供重要的指导。

本文将介绍几种常见的抗氧化酶活性测定方法。

1.超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法：SOD能够催化超氧阴离子（O2-）的还原反应，将其转化为较为稳定的氧气和过氧化氢。

常见的SOD活性测定方法有：-标准醛缩法：根据SOD催化的还原反应，利用NBT（硝基蓝盐）和醛缩剂的变色反应来测定SOD活性。

-自动化测定法：利用包含其中一种还原物质和pH染料的较为稳定的底物，通过测定底物的氧化程度来确定SOD活性。

-XTT法和WST-1法：由于SOD具有还原型的性质，可以通过测定细胞培养基中的还原型琼脂糖（XTT）或水溶性四硝基噻唑盐（WST-1）的还原动力学来测定其活性。

2.过氧化氢酶（CAT）活性测定方法：CAT主要参与还原过氧化氢（H2O2），将其转化为氧和水。

常见的CAT活性测定方法有：-色素法：利用黄曲霉素作为还原剂，观察黄曲霉素的消费量来测定CAT活性。

-光度法：通过测定样品中H2O2浓度的下降程度来间接测定CAT活性。

-氧化还原电极法：通过测定样品中H2O2浓度的下降速度来测定CAT活性。

3.过氧化物酶（POD）活性测定方法：POD主要参与氧气与还原型供体之间的氧化还原反应，转化为过氧化物（ROO-）。

常见的POD活性测定方法有：-色谱法：利用酚类底物的氧化反应，测定产生的醌类产物的含量来测定POD活性。

-酶标法：POD催化氧化反应会形成有色产物，通过测定产物的吸光度来测定POD活性。

4.谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性测定方法：GPx主要参与还原过氧化物，将其转化为相对稳定的醇和水。

常见的GPx活性测定方法有：-碳酸盐法：根据GPx还原底物中的碳酸盐，观察样品溶液pH值的变化来测定GPx活性。

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。

加入10gPVP（聚乙烯吡咯烷酮）参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。

（2）130mmol/L甲硫氨酸溶液：取1.399g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至100ml。

网上说定容到100ML我也不懂。

拜托（3）100μmol/L EDTA-Na2溶液：取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；（4）100μM核黄素溶液：取0.0075g核黄素用蒸馏水定容至100ml，避光保存，随用随配，并稀释10倍（5）750μmol/L氮蓝四唑（NBT）溶液：称取0.06133g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml 避光保存；酶液制备：取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，加2ml 磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，加缓冲液使终体积为10ml。

取5ml于10000r/min下离心10min，上清液即为SOD粗提液。

提取酶液时如何保存;如果没有测完的需要放在4℃的冰箱里。

2、酶活性测定2．显色反应取试管（要求透明度好）5支，3支为样品测定管，1支为对照管，另外1支作为空白，按表39-1加入各溶液。

混匀后将空白管置暗处，其它各管于4000lx日光灯下反应20min（要求各管受光情况一致，反应室的温度高时时间可适当缩短，温度低时时间可适当延长）。

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。

参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。

（2）14.5mM甲硫氨酸溶液：取2.1637g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至1000ml。

（3）30μM EDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。

（4）60μM核黄素溶液：取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。

（5）2.25mM 氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.1840g NBT用PBS定容至100ml，避光保存。

酶液制备：取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入1.6ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。

2、酶活性测定（1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液0.6ml，磷酸缓冲液5.4ml，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀；（2）分别取3ml反应混合液和30μl酶液于试管中（3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反应20min；同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30μl PBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。

缩写：SOD：超氧化物歧化酶； CAT：过氧化氢酶； POD：过氧化物酶； MDA：丙二醛；PVP：聚乙烯吡咯烷铜K-30；L-Met：甲硫氨酸；NBT：氮蓝四唑；TBA：硫代巴比妥酸；TCA：三氯乙酸；PBS: 磷酸缓冲液1.SOD的测定方法加样顺序：（V=3ml）磷酸缓冲液：1.5ml L-Met: 0.3ml NBT: 0.3ml EDTA-Na2: 0.3ml 核黄素：0.3ml 酶液：0.05ml 蒸馏水：0.25ml试剂配制：(1) 0.05mol/L PBS：pH7.8(2) 130mmol/L L-Met: 1.9399g Met用PBS定容至100ml(3) 750mmol/L NBT: 0.06133g用PBS定容至100ml(避光保存)(4) 100umol/L EDTA-Na2: 0.03721g用PBS定容至1000ml(5) 20umol/L核黄素: 0.0753g用蒸馏水定容至1000ml(避光保存) 注：（1）对照：以加缓冲液、不照光为空白；照光的为最大还原管(2) 照光后至显蓝色要立即避光放置、迅速测定A560值2.MDA的测定方法试剂配制：（1）5% TCA： 5g用蒸馏水定容至500ml（2）0.5% TBA：2.5g用TCA定容至500ml方法：酶液1ml—3ml0.5%TBA和5%TCA—混合后在100度水浴煮沸15min—迅速冷却，10000r/min离心10min—用蒸馏水调零分别测定上清液在532nm、600nm处的吸收值3.POD的测定方法试剂配制：（1）0.1mol/L的醋酸缓冲液：8.8mlA+41.2mlB得到100mlph5.4的醋酸缓冲液A(0.2mmol/L的HAc溶液)—6ml冰醋酸溶到494ml蒸馏水中B(0.2mmol/L的NaAc溶液)—（2）0.25%愈创木酚溶液—125um愈创木酚溶于50ml 50%乙醇中（临用前配制）（3）0.75%H2O2溶液：1.25ml 30% H2O2定容至50ml（临用前配制）方法：比色杯中依次加入2ml 0.1mol/L的醋酸缓冲液—1ml 0.25%愈创木酚溶液—xml酶液（5min值为500-800即可）—0.1ml 0.75%H2O2溶液—迅速巅到混匀把A460调零并开始计时—1次/30s,连续读取3min4.CAT的测定方法试剂配制：(1) 50mmol/L的PBS（pH7.0） (2) 0.3% H2O2—1ml H2O2定容至100ml 方法：(1)以不加H2O2的50mmol/L的PBS（pH7.0）为空白把A240调零(2)50ul酶液—3ml 50mmol/L的PBS（pH7.0）—0.2ml 0.3% H2O2—迅速颠倒混匀，开始计时—1min后在240nm下比色，1次/1min(连续读取5min)。

测定方法一．SOD，CAT及POD活性的测定分别取0.4ｇ材料于预冷的研钵中，加入8 ml预冷的50 mmol-1磷酸缓冲液（pH 7.8）（先加2ml, 在冰浴下研磨成匀浆后，将匀浆转入10ml离心管，再用6ml冲洗），10000 rpm离心15 min，取上清液定容至10ml后于4℃保存。

上清液用于可溶性蛋白质含量、SOD活性及POD活性的测定。

SOD活性测定1.显色反应取5mL指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按表47–1加入各溶液。

混匀后，给1支对照管照上比试管稍长的双层黑色硬纸套遮光，与其他各管同时置于4000lx日光灯下反应20-30 min(要求各管照光情况一致，反应温度控制在25～35℃之间，使酶活性高低适当调整反应时间)。

当样品数量较大时，可在临用前根据用量将表47–1中各试剂(酶液和核黄素除外)按比例混合后一次加入2.65mL，然后依次加入核黄素和酶液，使终浓度不变。

3.SOD活性测定至反应结束后，用黑布罩盖上试管，终止反应。

以遮光的对照管作为空白，分别在560nm 下测定各管的OD值，计算SOD活性。

3.<结果计算>已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。

SOD总活性[u/g(FW)]=式中：SOD总活性以酶单位每克鲜重表示。

比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。

ACK ——照光对照管的吸光度。

AE ——样品管的吸光度。

VT ——样品液总体积，mL。

V1 ——测定时样品用量，mL。

W——样品鲜重，g。

蛋白质含量单位为mg/g。

愈创木酚法测定过氧化物酶（POD）活性1.取两支试管，洗涤后甩干水分。

试剂管号（对照）测定管0.05mol/L PH 5.5的磷酸缓冲液 2.9ml 2.9 ml2%双氧水溶液0 ml 1.0 ml0.05mol/L愈创木酚溶液 1.0 ml 1.0 ml蒸馏水 3.0 ml 2.0 ml总体积7.0 ml 7.0 ml将上述各管立即放入预先调好37 ℃的水浴锅中保温5min以上（酶促反应），向对照管中加入0.1 ml酶液，混匀，在λ470 nm处调零，再向测定管中加入0.1 ml酶液，并且立即计时，混匀后进行比色测定，3分钟时立即读取吸光度。

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法抗氧化酶是生物体内重要的防御系统，它们通过清除自由基来保护细胞免受氧化损伤。

其中，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）是三种主要的抗氧化酶。

测定这些酶的活性对于评估生物体的抗氧化能力具有重要意义。

本文将介绍几种常用的抗氧化酶活性测定方法。

1. 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法SOD是一种能够催化超氧阴离子自由基（O2）歧化为氧气（O2）和过氧化氢（H2O2）的酶。

常用的SOD活性测定方法包括：氮蓝四唑（NBT）法：利用NBT在超氧阴离子自由基存在下被还原成蓝色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算SOD活性。

羟胺法：利用羟胺与超氧阴离子自由基反应硝酸盐，通过测定硝酸盐的量来计算SOD活性。

2. 过氧化物酶（POD）活性测定方法POD是一种能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧气的酶。

常用的POD活性测定方法包括：愈创木酚法：利用愈创木酚在过氧化物酶存在下被氧化红色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算POD活性。

邻苯三酚法：利用邻苯三酚在过氧化物酶存在下被氧化紫色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算POD活性。

3. 过氧化氢酶（CAT）活性测定方法CAT是一种能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧气的酶。

常用的CAT活性测定方法包括：紫外分光光度法：利用过氧化氢在紫外光下具有吸收的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算CAT活性。

酶偶联法：利用过氧化氢在过氧化物酶存在下被氧化水的特性，通过测定水的量来计算CAT活性。

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定的实验步骤与注意事项实验步骤1. 样品准备提取酶：根据实验目的，选择合适的组织或细胞提取酶。

常用的提取缓冲液包括磷酸盐缓冲液、TrisHCl缓冲液等。

离心：将提取液离心，分离上清液和沉淀物。

上清液中含有目标酶，沉淀物则含有杂质。

蛋白质定量：使用 Bradford 法或 Lowry 法等蛋白质定量方法测定上清液中的蛋白质浓度。

植物组织中SOD、POD、CAT、MDA的测定一、磷酸缓冲液的配制：A液：0.2M的NaH2PO4溶液称取分析纯NaH2PO4•2H2O 31.21g，用蒸馏水定容至1000ml。

B液：0.2M的Na2HPO4溶液称取分析纯Na2HPO4•12H2O 71.64g，用蒸馏水定容至1000ml。

）二、酶液的制备：称取0.5g放入研钵中，加5ml PH=7.8的磷酸缓冲液，冰浴研磨，匀浆倒入离心管中，冷冻离心20分钟（若做可溶性蛋白，转速为4000转/分钟，若不做，则10000转/分钟），上清液（酶液）倒入试管中，置于0~40C下保存待用。

三、S OD的测定（NBT法)：1.SOD反应液的配制：母液的配制：（1）0.05M 磷酸缓冲液（pH=7.8）：A液21.25ml+B液228.25ml定容至1000ml;(2) 130mM Met(甲硫氨酸)：取1.9399gMet 用磷酸缓冲液定容至100ml；（3）750μM四氮唑蓝（NBT）：取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml；(4) 100μM EDTA-Na2: 取0.0372g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml，避光保存；(5) 20μM FD (核黄素): 0.00753gFD用磷酸缓冲液定容至1000ml。

用前配，避光！！！SOD反应液：磷酸缓冲液：Met：NBT：EDTA-Na2：核黄素（FD）：H2O的比例为15：3：3：3：3：2.5，按母液顺序配制。

2.SOD的测定：取5ml离心管，吸取20μl的酶液，加入3ml反应液，4000Lux照光30分钟，同时取四支试管，三支做对照，一支做空白（不加酶液，以缓冲液代替）；空白置暗处，对照（CK）与酶液同置于4000Lux条件下照光30分钟，遮光保存，以空白调零，560nm 比色。

3.结果计算SOD总活性（吸光度/g·FW）=（A CK—A E）×V／（W×0.5×A CK）单位：NBT光还原50%为单位SOD 比活性（酶单位/mg蛋白）= SOD总活性/蛋白质浓度四、POD的测定：1.0.1M pH6.0磷酸缓冲液的配制：0.2 M Na2HPO4 (B液)6.15mL与0.2 M NaH2PO4(A液)43.85mL充分混匀定容至100ml2.POD反应液的配制：0.1M pH 6.0的磷酸缓冲液50ml于烧杯中，加入愈创木酚28μl，磁力搅拌器加热搅拌使之完全溶解，冷却后加入30%H2O2 19μl混合，保存于冰箱中。

酶液提取:称取鲜叶样品。

0.5g于预冷的研钵中，加lml0.05mol/1 pH7.0磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。

将提取液于10000转/分冷冻离心20分钟，上清液用于测定SOD, POD, CAT活力测定及丙二醛含量测定。

SOD：测定SOD活性的试剂配制及用量:①磷酸缓冲液(PH7.8) 0.05moI/L 3.1m1，空白为3.2m1;②EDTA-Na21mg/m1 0.2mL;③L一甲硫氨酸20mg/mL 0.2m1;④核黄素0.1 mg/ml，吸取上清液0.2m1;⑤NBT lmg/ml 0.2m1;⑥提取酶液0.1ml，空白不加酶液。

反应总体积为4m1,第1组、4000Lx光照30min，遮黑布终止反应。

第2组、黑暗处理30 min。

置560nm处测定光密度。

SOD活性单位以抑制NBT光化还原50%作为一个酶活性单位(u)，按以下公式计算SOD活性:式中，Ack为照光管的吸光度值;AE为遮光管的吸光度值:V为样品液总体积((ml);Vt为测定时样品用量(ml); W为样品鲜重。

POD：在试管中依次加入4m1 0.3%愈创木酚(0.02mo1/1 pH6磷酸缓冲液配置)、50ul酶液、50 ul0.3%H202，摇匀，立即计时，1分钟后在470nm波长下比色，每1分钟记录一次吸光度值，连续记录5分钟。

以每分钟内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位(U)，按下式计算过氧化物酶活性:式中:d A470为反应时间内吸光度的变化:Vt为提取液总体积(ml); W为样品鲜重(g); Vs为测定时取用酶液体积(ml); t为反应时间(min) 。

CAT取酶提取液50 u 1，加入3m1 0.05 mol/1 pH7.0磷酸缓冲液，再加入0.3%H2O2200 u1，迅速摇匀，立即计时，1分钟后在UV-754分光光度计的240nm波长下比色，每1分钟记录一次吸光度值，连续记录5分钟。

植物组织中SOD活性MDA含量的测定方法超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量是评价植物细胞的氧化应激程度和损伤程度的重要指标。

下面将介绍常用的测定植物组织中SOD活性和MDA含量的方法。

一、SOD活性测定方法：1. 混合植物组织提取液：将适量的植物组织（如叶片、根部等）加入冰冻磨碎器中，加入适量的冰冷提取液（Tris-HCl缓冲液，pH 7.8或其他适宜缓冲液），按比例加入少量酒石酸、酚酸、DTT等，然后将混合物离心10分钟。

2.处理提取物：将上述所得的植物组织提取液加入活性溶液，如NBT、PIP等，混匀后放置在37°C水浴中反应一定时间。

3. 停止反应：将反应液加入组织破壁液（甘油、NaCl、Tween-20等混合物），混匀后放置一段时间，离心10-15分钟。

4.测定光密度：取上清液用比色计测定光密度（OD）值，以反映SOD的活性，活性越高，OD值越低。

二、MDA含量测定方法：1.组织提取：将适量的植物组织加入冰冷提取液（如磷酸盐缓冲液，pH7.4），用冷磨具磨碎并移至离心管中，离心5分钟收集上清液。

2.加入TBA液：取上清液与TBA液（三硝基苞球菌素溶液）按比例混合，混匀后在水浴中加热（100°C，10分钟），然后迅速冷却至室温。

3.离心沉淀：将样品离心10分钟，取上清液。

4.测定光密度：分别取上清液测定OD值，OD值越高，MDA含量越高。

三、优化与改进：1.提取液的选择：根据不同植物组织的特点选择合适的提取液，以提高SOD活性和MDA含量的测定效果。

2.比色反应的时间和温度的调整：根据植物组织中SOD活性的变化调整反应时间和温度，以保证测定结果的准确性。

3.重复测量：为了提高实验结果的可靠性，可以重复测量同一样本，并取平均值作为最终结果。

4.与对照的比较：将测定样本与对照组进行比较，以评估SOD活性和MDA含量的变化，进一步分析植物组织的氧化应激程度和损伤程度。

SOD,POD,CAT测定方法抗氧化酶活性的测定：（2.5g样0.05mol/L 磷酸缓冲溶液（PBS（pH=7.8溶液的配制：65.5506g Na2HPO412H2O + 2.65285g NaH2PO42H2O,定容到4L。

（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》，P134取低温保存的鲜样，称2g左右的叶片（或根放在50ml的离心管，加入20ml浓度为0.05mol/L磷酸缓冲溶液（pH=7.8（最好是较冷的磷酸缓冲溶液，防止研磨时温度过高使酶失活，研磨（用磨碎机磨,8000r/min的冷冻离心机下离心20分钟,上清液为粗酶液。

1超氧化物歧化酶（SOD的测定：NBT（400ml混合反应液：392mlPBS（Ph=7.8,+0.0206g NBT+ 0.776g甲硫酸铵+8ml 核黄素溶液+0.4ml EDTA-Na 溶液（100mlPBS缓冲溶液中含0.01204g核黄素。

（另配100ml PBS溶液力卩EDTA-Na 3.7224gEDTA-Na测试时:取3ml反应液+0.05ml（根或0.02 ml（叶粗酶液，于光照培养箱中6-10分钟,OD650下测定吸光度。

2过氧化物酶（POD的测定：0.05mol/L 磷酸缓冲溶液（PBS（pH=7.0溶液的配制:10.9251g Na2HPO412H2O + 3.042975g NaH2PO42H2O,定容至U 1000ml。

0.3%H2O2溶液的配制:吸2.5ml 30%H2O2,用0.05mol/L pH=7.0 磷酸缓冲溶液（PBS 定容到250ml。

0.2%愈创木酚溶液的配制：称0.5g愈创木酚，用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液（PBS定容到250ml。

2ml 0.3%H2O2 溶液+ 0.95ml 0.2%愈创木酚溶液+ 1ml 0.05mol/L pH=7.0 磷酸缓冲溶液（PBS + 0.02ml??原来为0.01酶液（根加0.05ml酶液（对照用0.05mol/L磷酸缓冲溶液代替酶液（做三个重复，记录470nm处OD降低速度。

抗氧化酶SODPODCAT活性测定方法抗氧化酶SOD（超氧化物歧化酶）、POD（过氧化物酶）和CAT（过氧化氢酶）是植物体内重要的抗氧化酶，在植物的抗逆境应对中起着重要的作用。

因此，对这些抗氧化酶的活性进行测定和分析是研究植物生理生化过程的重要方面之一测定抗氧化酶活性的方法一般分为两类：直接法和间接法。

直接法是通过测定一些特定底物的降解速率来反映酶的活性；间接法是通过测定酶催化底物形成的产物的生成速率来间接反映酶的活性。

下面将分别介绍抗氧化酶SOD、POD和CAT活性的测定方法。

1.SOD活性测定方法：SOD活性测定方法主要分为NBT法和EPX法两种。

（1）NBT法：这是一种直接法，其基本原理是SOD将还原型的NBT 还原成穆尔蓝染色形成具有最大吸收峰值的NBT离子。

实验步骤如下：a.首先准备SOD底物溶液，其组成为：50mM磷酸缓冲液（pH7.8）+13mML-甲硫氨酸+75μM硝基蓝硝酸盐（NBT）。

b.将样品加入上述的SOD底物溶液中，混匀。

c.加入适量的酶抑制剂，使停止酶的活性，并将其放在冰上。

d.使上述反应在37℃下进行10分钟。

e.加入已经冷却的硝酸亚铁和磷酸以停止反应，并将其放在冰上10分钟。

f. 测定变色液的吸收光谱在560 nm波长处的吸光度。

（2）EPX法：这也是一种直接法，其基本原理是SOD将乙酸型形成的4-无水乙烯甲基-3-硝基噻吩染色。

实验步骤如下：a. 首先在试管中加入1 ml乙酸型测定液。

b.分别加入适量的SOD样品。

c.在30分钟内使试管中乙酸型完全消除。

d. 测定出试管中产生的4-乙烯基-3-硝基-5-硝基噻吩的吸收光谱在260 nm波长处的吸光度。

2.POD活性测定方法：POD活性测定方法可分为直接法和间接法。

（1）直接法：这种方法基于过氧化反应的特点，利用dianisidine 与过氧化氢在催化剂POD作用下形成有色产物的现象来测定POD的活性。

实验步骤如下：a.在试管中加入0.1M磷酸盐缓冲液（pH6.0）。

叶绿素含量采用无水乙醇的方法测定超氧化物歧化酶SOD活性采用邻苯三酚自氧化法测定过氧化物酶POD活性采用愈创木酚法测定过氧化氢酶采用过氧化氢法测定丙二醛采用硫代巴比妥酸法测定蛋白质含量采用考马斯亮蓝法每次测定重复3次，取平均值测定方法一．SOD，CAT及POD活性的测定分别取0.4ｇ材料于预冷的研钵中，加入8 ml预冷的50 mmol-1磷酸缓冲液（pH 7.8）（甲液：取Na2HPO4 35.9g，加水溶解，并稀释至500mL 乙液：取NaH2PO4 2.76g，加水溶解，并稀释至100mL 取上述甲液91.5mL和乙液8.5mL，混合摇匀即得。

先加2ml, 在冰浴下研磨成匀浆后，将匀浆转入10ml离心管，再用6ml冲洗），10000 rpm离心15 min，取上清液定容至10ml后于4℃保存。

上清液用于可溶性蛋白质含量、SOD活性及POD活性的测定。

SOD活性测定1.显色反应取5mL指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按表47–1加入各溶液。

混匀后，给1支对照管照上比试管稍长的双层黑色硬纸套遮光，与其他各管同时置于4000lx日光灯下反应20-30 min(要求各管照光情况一致，反应温度控制在25～35℃之间，使酶活性高低适当调整反应时间)。

当样品数量较大时，可在临用前根据用量将表47–1中各试剂(酶液和核黄素除外)按比例混合后一次加入2.65mL，然后依次加入核黄素和酶液，使终浓度不变。

液蒸馏水0.5总体积 3.33.SOD活性测定至反应结束后，用黑布罩盖上试管，终止反应。

以遮光的对照管作为空白，分别在560nm 下测定各管的OD值，计算SOD活性。

3.<结果计算>已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。

SOD总活性[u/g(FW)]=式中：SOD总活性以酶单位每克鲜重表示。

比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。

SOD活性测定POD活性测定CAT活性测定质膜透性测定MDA含量测定色素含量测定实验方案一、细胞质膜透性的测定（电导法）材料、仪器设备1.材料：植物叶片，每个样本1cm2的小叶片1g。

2.仪器药品：洗洁精；电导仪；电子天平；冰箱；真空泵；真空干燥器；恒温培养箱；电炉；50ml烧杯；50ml量筒；小镊子；纱布；表皿；滤纸条；镜头纸；剪刀；玻棒；胶头滴管；瓷盘。

实验步骤1.清洗用具所用玻璃用具均需先用洗洁精清洗，然后用自来水洗3次，再用蒸馏水洗3次，然后放入或倒置在洗净的且垫有洁净滤纸的器皿中干燥后备用。

2.实验材料的准备及处理选取叶龄叶位长势均相似的植物叶片，剪下后用湿布包住放在已经编号的保鲜袋中，最后用保鲜盒封存带回。

实验前用自来水冲洗叶片，除去表面沾污物，再用蒸馏水冲洗2次，用洁净滤纸轻轻吸干叶片表面水分放于已编号的洁净器皿中，然后分别剪成约1cm2的小叶片（或用直径为1cm2的打孔器钻取小圆片），注意除掉大叶脉。

将剪下的小叶片分别混合均匀，每个样本再快速称取鲜样2份，每份0.5g，分别放入编号为X-n-a、X-n-b的50ml烧杯中，另取编号C的烧杯，不加鲜样留作空白本底对照。

每个样本的三个烧杯中均加入蒸馏水30ml 浸泡，将盛有鲜样的a、b烧杯放入真空干燥器中，用真空泵抽气25min（以抽出细胞间隙中的空气），然后缓缓放入空气，从真空干燥器中取出a、b烧杯，a、C杯继续常温浸泡，b 杯称重，盖上表皿，置于电炉上煮沸15min，冷却后再称重并加蒸馏水至原重量，继续室温自然浸泡45min即可测定。

各样本处理时浸泡时间和处理温度要保持一致，均保持在室温下。

（注：自然浸泡需要4～5h以上，为防止样品表面气泡的影响故用真空干燥管去除气泡，也可以在振荡器上浸泡1～2h。

）3.测定电导值在测定前先将各杯浸泡液摇匀，测出各杯样本浸出液电导率值，记录到原始数据表上相应栏中。

（注意：每测定完一个样液后，用蒸馏水漂洗电极，再用滤纸将电极擦干，然后进行下一个样液的测定）原始数据表样表如下：电导率测定记录表：样本编号处理电导率值(μS · cm－1)相对外渗率（％）空白对照C管（常温蒸馏水空白）___—___ (第X组第n个重复)a管（常温）b管（煮沸）___—___a管（常温）b管（煮沸）___—___a管（常温）b管（煮沸）4、结果计算按下公式计算低温及常温处理电解质的相对外渗率：电解质的相对外渗率（％）＝× 100%二、叶绿素含量的测定（丙酮提取法）材料、仪器设备1.材料：植物叶片，每个样本0.5g。

植物组织SOD、CAT、POD活性以及MDA、H2O2含量的测定•植物组织中通过多条途径产生O-.2、OH等自由基，•这些自由基具有很强的氧化能力，对许多生物功能分子有破坏作用。

•细胞内也存在消除这些自由基的多种途径。

如SOD可以消除O-.2（超氧物阴离子自由基）：SOD 2O-2·＋2H+ ──→ H2O2＋O22H2O2＋-.────→OH·＋O2•• CAT2H2O2───→ 2H2O＋O2•••••••••••••••••••••••••••••• 细胞2O2的积累可使CO2的固定效率降低,而CAT和POD•能分解••••H2O2, 只有SOD、CAT、POD三者活性协调一致，才能使自由基维持在••••••••••一个低水平，所以上述三种酶统称为保护酶系统。

•••••••••• 在正常情况下,细胞内自由基的产生和消除处于动态平衡状态，••••••••••自由基水平很低，不会伤害细胞。

但当植物受到逆境胁迫时，•植物体内活性氧代谢系统的平衡被打破，O-.2、H2O2、OH•·（羟基自由•基）、·O2（单线态氧）的产量增加，•破坏和降低活性氧清除剂如SOD、CAT、POD、GR(谷胱甘肽还原酶以及VtE、VtC、CAR（类胡萝卜素、GSH（还原型谷胱甘肽）等的结构、活性或含量水平，从而伤害细胞。

•• 自由基伤害细胞的主要途径可能是下列两点：•• 1. 首先自由基导致膜脂过氧化作用, SOD、POD活性下降,•同时还产生较多的膜脂过氧化产物(乙烯、乙烷和丙二醛），膜的完整性被破坏；•• 2. 其次, 自由基累积过多, 也会使膜脂产生脱脂化作用,•磷脂••••••••••游离, 膜结构破坏。

膜系统破坏，•就会引起一系列生理生化紊乱，导致植物死亡。

•••••••••••••••••••••• 本实验利用正常生长和缺素培养的玉米苗为材料, •系统分析叶片中SOD、CAT、POD三种酶的活性及MDA、H2O2、可溶性蛋白质、•叶绿素的含量。

植物组织中SOD活性的测定超氧物歧化酶（SOD）是需氧生物中普遍存在的一种含金属酶。

它与过氧化物酶、过氧化氢酶等酶协同作用防御活性氧或其他过氧化物自由基对细胞系统的伤害；SOD可以催化氧自由基的歧化反应，生成过氧化氢、过氧化氢又可以被过氧化氢酶转化成无害的分子氧和水。

【原理】依据SOD抑制NBT在光下的还原作用来确定酶活性大小。

在有氧化物存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧的条件下极易再氧化而产生02-，02- 可将NBT还原为蓝色的甲，后者在560 nm 处有最大吸收。

而SOD作为氧自由基的清除剂可抑制此反应。

于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性越低，反正酶活性越高。

一个酶活单位定义为将NBT的还原抑制到对照一半（50%）时所需的酶量。

【仪器与用具】离心机；分光光度计；进样器；紫光灯（4000 Lx）；15 mm×150 mm试管；黑色硬质套。

【试剂】①0.05mol/L 磷酸缓冲液PBS（pH=7.8）提取介质50mmol/L PBS（pH=7.8）内含1% 聚乙烯吡咯烷酮② 130mmol/L 甲硫氨酸溶液：称1.9397g Met，用PBS 7.8 进行溶解并定容至100ml；③ 750umol/L NBT：称0.06132g NBT，用PBS 7.8进行溶解并定容至100ml，避光保存；④20umol/核黄素溶液：称0.0075g核黄素，用蒸馏水溶解定容至1000ml，避光保存，现用现配；⑤ 100umol/L的EDTA-Na2溶液：称0.0372g EDTA-Na2 ，用PBS 7.8定容至1000ml。

【方法】1.酶液提取称取植物叶片0.2g（去叶脉）于预冷的研钵中，加1ml预冷的提取介质在冰浴下研磨成匀浆，加入提取介质冲洗研钵，并使最终体积为2ml，于4℃、10000r/min离心15min，上清液即为SOD粗提液。

2.显示反应取透明度好、质地相同的15mm×150mm试管4支，2支为测定，2支为对照，按下表加入试剂。

一、SOD、POD、MDA和蛋白质测定（1）酶液的提取（可用于测定SOD、POD、MDA和蛋白质）取0.5g样品加5ml 0.05M （pH7.8）的磷酸缓冲液冰浴研磨（2ml磨样，3ml冲洗）后转入10ml离心管中，4 C, 10000rpm离心20min，上清液即为酶液（2）SOD、POD、MDA和蛋白质的测定1 SOD活性测定（NBT法）试剂药品：0.05M 磷酸缓冲液（pH7.8）; 130mM甲硫氨酸（Met）; 750卩M氮蓝四唑（NBT ）; 100 卩M EDTA-2Na ; 20 卩M 核黄素（ 1.5ml 0.05M （pH7.8）PBS0.3ml 130mM Met0.3ml 750 卩M NBT① 3ml 反应体系/0.3ml 100卩M EDTA-2Nai 50卩L酶液（光对照和暗对照以磷酸缓冲液代替酶液，酶液用量可自行调节，以吸光值在0.1-0.9间即可）0.25ml蒸馏水I 0.3ml 20卩M核黄素②将1支暗对照管置暗处，其余样品日光下（4000lx）反应20min （时间可自行调节，反应体系颜色变化即可）。

以暗对昭作空白调零，测定光对照及样品560nm处吸光值。

③计算SOD 活性（U/g）= （（Ack-A E）• V T• D）/ （0.5 • Ack • W • V R）（SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位）Ack :光对照管吸光度A E :样品管吸光度V T :酶提取液总体积（ml）V R :测定时酶液用量（ml）W :样品鲜重（g） D :稀释倍数2 POD活性测定（愈创木酚法）试剂药品：0.05M磷酸缓冲液（pH5.5）; 0.2%愈创木酚溶液；0.3% H2O2广 1.0ml PBS （pH5.5）0.95ml 0.2%愈创木酚溶液] 1.0ml 0.3% H 2O2①3ml反应体系50卩L酶液（酶液用量可自行调节，I 以吸光值在0.1-0.9间即可）最后加入H2O2或愈创木酚启动反应，可使反应体系混合更均匀②以PBS pH5.5为对照调零，记录470nm处吸光值（以每1min增加0.01定义为1个酶活性单位）③POD 活性（U/ （g • min））= （△ A470 • V T• D）/ （0.01 • W • V R• t）△ A470 :反应时间内吸光度的变化V T:总的酶液提取液体积（ml）D:稀释倍数V R：测定时的酶液体积（ml）W :样品鲜重（g）t :反应时间（min ）3 MDA 含量测定（TBA法）试剂药品：0.6% TBA①反应体系：1ml提取液+2ml 0.6% TBA沸水浴15min，冷却离心，取上清在600,532,450nm 下测定吸光值②MDA含量计算：反应混合液中MDA 浓度 C （卩mol/L ）= （6.45 • （A532-A600 ））- （0.56 • A450）提取液中MDA浓度（卩mol/ml ）=（C MDA•反应液体积ml）/（测定时提取液用量ml -1000）样品中MDA含量/卩mol • g-1• Fw）=（提取液中MDA浓度•提取液总量ml）/植物组织鲜重g 4蛋白质含量测定（考马斯亮蓝G-250法）试剂药品：考马斯亮蓝①标准曲线制作：参照《植物生理生化试验原理和技术》（王学奎版）191页②提取液在室温下放置0.5-1h以充分提取，5ml考马斯亮蓝+100卩L提取液（用量可调节），混匀，反应2-5min后，在595nm下比色蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合反应十分迅速，在2min左右反应达到平衡，其颜色可在1h内保持稳定，且在5-20min内颜色的稳定性最好③样品中蛋白质含量/ mg/g鲜质量）=/X • V T• N）/ / W • V S• 1000）X :根据样品的吸光度所查得的标准曲线值（蛋白质质量卩g）V T：提取液总体积ml W :样品鲜质量gV S：测定时加样量ml N :稀释倍数、叶绿素含量的测疋试剂药品：95%乙醇①取叶片0.1-0.2g，剪成小块放入刻度试管，力口95%乙醇，于暗处放置12h，待叶片绿色褪尽，即可在665、649nm波长下测定吸光值②叶绿素含量计算：Ca=13.95 • A665-6.88 • A649Cb=24.96 • A649-7.32 • A665叶绿素含量（mg/g）= （C • V • N）/ （W • 1000）C:叶绿素a+b含量（mg/L）V :提取液体积mlN :稀释倍数W:样品鲜质量或干质量g三、GSH、AsA含量测定（1）测定液的提取取一定部位的植物叶片（视需要而定，去叶脉）0.5g剪碎加入5mL 5%三氯乙酸（TCA）溶液，研磨，15000r/min离心10min，上清液定容至5mL。