分批补料发酵 ppt课件

dX X dt
比生长速率μ与细胞种类、培养温度、pH、培养基组成成分和限制性基质浓度等因素有关。在对数生长期内， 细胞的生长不受限制，比生长速率达到最大值μm，
dX m X dt
如在 t1 时的菌体细胞浓度为X1，则在 t2 时的细胞浓度为： X2 =X1 exp［μm(t2 – t1)］ 所以，在对数生长期，细胞浓度随时间指数增长，细胞浓度增长一倍所需的时间称为倍增时间 (doub1ing time，td)。根据式上式可得倍增时间的计算公式：
分批发酵中细胞浓度的变化 1. 延迟期；2. 对数生长期；3. 减速期； 2. 4. 稳定期；5. 衰退期
① 延迟期或延滞期
发酵培养基在接种后，一段时间内细胞浓度的增加不明显，该阶段为延迟期。新环境中存在某些旧环境中没有的营养
物质，细胞须合成有关酶类来利用该营养物质，从而出现延迟期。许多胞内酶需要辅酶或活化剂，它们是一些小分子物质

mS
Ks S
当限制性基质浓度很低时，增加该基质浓度可明显提高细胞的比生长速率，但若该基质浓度与Ks相比已相当高时，再 增大其浓度就不能明显地增加细胞的比生长速率。这时，细胞的比生长速率接近“饱和”。 在培养动植物细胞和微生物细胞生产代谢产物时，产物的最大生产速率往往是在生长受到抑制的情况下得到的。采用 适当的限制性基质限制细胞生长，有时会有利于产物的积累。如：酵母菌Y33::YFD71-3是一株腺嘌呤、组氨酸和亮氨酸缺 陷的基因工程菌. 在进行摇瓶培养时，菌体生长受腺嘌呤限制时菌体分泌的蛋白明显增加，而菌体生长受亮氨酸限制时，蛋白的生产受 到影响。如下表所示。这是因为生长受到腺嘌呤的限制时，过量存在的氨基酸可用于蛋白质合成，而生长受亮氨酸限制时， 蛋白质的合成也受到了限制。

啤酒发酵罐
§3.3
分批发酵
一、概述 1.定义： A.在一封闭培养系统内进行的一次加入发酵原料， 一次放出发酵产物的发酵方式。“1+1+1” B.在一封闭培养系统内进行的、所有主物料（除空 气、消沫剂、调pH的酸，碱外）一次加入发酵罐，然 后灭菌，接种，培养，发酵结束后将整个罐内的发酵 产物一次放出。清罐毕，重复前述过程的发酵方式。 用数学式表示：培养Fin=0，产物Fex=0 ，in、ex 分别示流入、流出，即发酵过程中主物料流入、流出 的速度为期内支持微生物生长、增殖； 微生物的生长、繁殖在有限的营养条件下进行。 随着微生物的生长代谢，培养基和生长环境不断 发生变化，微生物的比生长速率也随之变化。 整个微生物的生长过程中出现4个主要时期： A.延滞期： 或称适应期：刚接种后的一段时间内，几乎未见 菌体浓度增加。工业生产要求尽可能缩短延滞期！
研究发酵产物形成动力学的意义： 1.了解发酵产物形成时间： A.确定放罐时间； B.确定应维持的“恒定状态”： 应延长的阶段及应缩短的阶段 分批发酵：对数期；稳定期 连续发酵中：“恒化，恒浊” 尽量延长“产品合成时期”，以提高产量。 2.了解产品的形成途径 底物→发酵产物：生长连动型；混合型， 酶等初级产物 细胞内初级代谢产物→发酵产物：非生长连动型 抗生素等次级产物
工业的发酵方式
不同工业发酵 方式的简介 微生物生长 的代谢规律 适应期 特点 优点 缺点 稳定期 对数期 衰亡期
分批发酵
补料分批发酵 连续发酵
生长连动型
非生长连动型 混合型
第 3章
发酵方式
§3.1 概述
一、按供氧方式 1.厌氧发酵： 2.好氧发酵 二、按照发酵基质物态 1.固态发酵： 2.液态发酵： 三、按物料进出方式 1.分批发酵：！ 2.连续发酵： 3.补料分批发酵：！

参数，使有利于生
产菌而不利于杂菌的生长，如降低发酵温度等。加人某些 抑制杂菌的化合物也不失为一种急办法，条件是这种化合 物对生产菌无害对生产影响不大和在下游精制阶段能被完 全去除。中后期染菌除非是噬菌体，通常后果不会那么严 重，这时发酵液中己产生一定浓度的抗生素，对杂菌已有 一定抑制作用。实际生产中常采用大接种量的原因之一是 即使不慎污染了极少量杂菌，生产菌也能很快占优势。
• 补料-分批发酵：是在
分批发酵过程中补入 新鲜料液，以克服由 于养分的不足，导致 发酵过早结束。
• 半连续发酵：在补料-
分批发酵的基础上加 上间歇放掉部分发酵 液便可称为半连续发 酵。
• 连续发酵： 是指发酵
过程中一面补入新鲜 的料液，一面以相同 的流速放料，维持发 酵液原来的体积。
5.2发酵条件的影响及其控制
生产方法
• 胰岛素的生产方法主要有两种，一种是从
动物脏器中生化提取的动物胰岛素，如猪 胰岛素、牛胰岛素等，动物脏器中生化提 取产量低、成本高（100公斤动物胰腺只 能提取4-5克胰岛素，一个病人所需胰岛 素要从40头牛或50头猪的胰腺中提取）、 纯度低，疗效差；一种是通过基因工程手 段的人胰岛素，基因重组人胰岛素纯度高、 疗效好.
5.4.发酵终点的判断与自溶的监测
• 5.4.1发酵终点的判断 • 发酵类型的不同，要求达到的目标也不同，因而
对发酵终点的判断标准也应有所不同。
• 判断放罐的指标主要有产物浓度、过滤速度、菌
丝形态、氨基氮、pH、DO、发酵液的粘度和外 观等。
• 对抗生素发酵，老品种抗生素发酵放罐时间一般
都按作业计划进行。但在发酵异常情况下，放罐 时间就需当机立断，以免倒罐。新品种发酵更需 探索合理的放罐时间。

菌种生产性能越高，其生产条件越难满足。
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3
发酵过程技术原理
分批发酵 补料-分批发酵 半连续发酵 连续发酵
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4
分批发酵
几个重要参数：
为比生长速率,h-1； -qs 为比基质消耗速率,(g/g)/h； qp 为比产物形成速率,(g/g)/h 。
uX dX dt
q xX d S dt
补充养分，同时解除/消弱代谢产物的抑制。
不足：
丢失了未利用的养分和处于生长旺盛期的菌体；送去提炼 的发酵液体积更大；丢失代谢产生的前体物；利于非产生 菌突变株的生长。
实施：海洋微藻合成藻红素和EPA。
需要摸索最佳的培养基更新速率。
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连续发酵
发酵过程中一面补入新鲜的料液，一面以相同的流速 放料，维持发酵液原来的体积。（恒化培养）
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1
发酵过程优化与控制
发酵
狭义——厌氧条件下葡萄糖通过酵解途径生成 乳酸或乙醇等的分解代谢过程。
广义——微生物把一些原料养分在合适的发酵 条件下经特定的代谢途径转变成所需产物的过 程。
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2
发酵是一个很复杂的生化过程，其好坏涉及诸多因素： 菌种性能、培养基组成、原料质量、灭菌条件、种子 质量、发酵条件和过程控制等
pH变化会影响酶活，菌对基质的利用效率和细
胞结构，从而影响菌的生长和产物的合成。
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选择最适发酵pH的原则是获得最大比生产速率和
适当的菌量。
分阶段pH控制策略
如何控制发酵液pH？
基础培养基的配方；通过加酸碱或中间补料 例如，青霉素发酵，通过调节加糖速率来控制pH；链 霉素的生产，补充NH3来控制pH，同时为产物合成提 供氮源。
培养液pH可反映菌的生理状况：pH上升超过最适值，意 味着菌处于饥饿状态，可加糖调节；糖的过量又使pH下 降；用氨水中和有机酸需防止微生物中毒，可通过监测 培养液种溶氧浓度的变化来控制。

发酵的方式有:
(1) 分批发酵 (Batch Fermentation)
(2) 补料分批发酵 (Fed-batch Fermentation)
(3) 连续发酵 (Continue Fermentation) (4) 高密度发酵(High Density Fermentation） (5) 工程菌发酵 (Engineered Strain or Recombinant Strain Fermentation)
二 补料分批发酵（Fed-batch Fermentation）
1．补料分批发酵技术的含义 2．补料分批发酵与分批发酵，连续发酵的区别？ 3．补料分批发酵技术的特点：
4．补料分批发酵技术的类型：
5．补料分批发酵的适用范围 6.流加物料的方式
1）恒定流速补料操作
2）恒定底物浓度操作 3）指数流速操作 7.补料分批发酵技术的评价
为了运用最优化控制理论，需要建立描述对象系统状态特征的数学模 型。若数学模型不能正确表达系统的特征，得到的最优解事不可靠的，因 此，数学模型必须尽可能正确。检验模型可靠性的过程称为模型识辨。必 须重视模型辨识。
Constantinides等运用统计学方法比较了青霉素发酵的集中模型的适 用性后，采用了如下模型：
(8.17) 式中tT、tL和tD 指转移、停滞和搁置（如对培养基分批转料及消毒）的时间，X0和 Xt是细胞最初和最终浓度。因此，总生产率P可以用方程式（8.18）来表示： (8.18) 从这个方程式可以测定过程变化对总的生产率的影响。种子量较大 时，X0增大，过 程缩短。转移或搁置时间减少，同样也缩短周期，如应用一种促进生长的种子培养物 可以消除停滞期。倘若发酵周期较短（如：18-48h),像面包酵母和谷氨酸生产，转移 时间对总的生产率来讲显得很重要。另一方面，对于长发酵周期来说（例如150200h),如在抗生素生产中，几小时的差别没有很大意义。

典型的分批发酵工艺流程图
1) 主要设备 主培养罐 (主发酵罐) 和种子培养罐(种子罐), 均属于深层培养装置。(含有配料, 蒸气灭菌, 冷却, 通 气, 空气过虑, 搅拌和消泡装置等)。种子罐: 为主发酵罐培养基接种所需要的菌体种子。 摇瓶培养 ---- 种子培养 ---- 发酵培养 (10倍体积逐级扩大)
分批发酵中细胞浓度的变化 1. 延迟期；2. 对数生长期；3. 减速期； 4. 稳定期；5. 衰退期
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
① 延迟期或延滞期
发酵培养基在接种后，一段时间内细胞浓度的增加不明显，该阶段为延迟期。新环境中存在某些旧环境中没有的营养
物质，细胞须合成有关酶类来利用该营养物质，从而出现延迟期。许多胞内酶需要辅酶或活化剂，它们是一些小分子物质
dX X dt
比生长速率μ与细胞种类、培养温度、pH、培养基组成成分和限制性基质浓度等因素有关。在对数生长期内， 细胞的生长不受限制，比生长速率达到最大值μm，
dX m X dt
如在 t1 时的菌体细胞浓度为X1，则在 t2 时的细胞浓度为： X2 =X1 exp［μm(t2 – t1)］ 所以，在对数生长期，细胞浓度随时间指数增长，细胞浓度增长一倍所需的时间称为倍增时间 (doub1ing time，td)。根据式上式可得倍增时间的计算公式：
第七章 分批发酵、补料分批发酵和高密度发酵
一. 分批发酵 (batch fermentation) 1. 分批发酵概况操作工艺 2. 分批发酵中的菌体生长规律、代谢变化 3. 分批发酵过程的最优化、生产率 二. 补料分批发酵（Fed-batch Fermentation） 1．补料分批发酵技术含义及二者区别 2．补料分批发酵技术特点和类型： 3．补料分批发酵的适用范围 4. 流加物料的方式和补料分批发酵的技术评价

td
ln 2
m

0.693
m
微生物细胞的倍增时间较短。细菌一般为0.25～1小时，酵母菌约为1.15～2小时，霉菌约为2～6.9小时。 动植物细胞的倍增时间较长，如哺乳动物细胞的td一般为15～100小时，植物细胞约为24～74小时。
③ 减速期 随着细胞的大量繁殖，培养基中的营养物质迅速消耗，目的产物开始大量积累的同时，有害代谢物亦逐渐积累， 细胞的生长速率逐渐下降，进入减速期。当培养液中不存在抑制细胞生长的物质时，细胞的比生长速率和限制性基质浓度S 的关系可用Monod方程来表示：
解淀粉芽孢杆菌LL330 L发酵体系生产γ-PGA
图 红霉素发酵前期OUR、CER 及R Q 趋势曲线图
相关参数：摄氧率( OUR)、二氧化碳释放率(CER )、呼吸商( RQ)、氧传递系数( K La)
4. 分批发酵过程的最优化 分批发酵的最优 + 操作费(通气费+搅拌费)
X X mexp t
方程进一步变换形式后即为： X = Xme-αt 式中Xm为静止期细胞浓度，g/L；α 为细胞比死亡速率，s-1；t 为进入衰亡期时间，s。
2）多底物培养基上的生长 当微生物在含有两种碳源的培养基中生长时，往往会出现二峰生长现象，表现出两段生长时期。在实际 工业发酵中，许多常用的复合培养基都含有多种碳源或含有成分复杂的营养物（如麸皮、豆饼粉）。在这 样的培养基中，微生物的生长会经历连续的变化，难以区分开其中的各个生长时期。每一时期都伴随着相 继的 生长速率的降低。在生长过程中，随着时间的进程，生长的斜率（μ）逐渐降低，看不出明显的指数 生长期。
谢以及菌体细胞物质的合成代谢，二者有机地联系在一起。营养物质不断被消耗，新菌体不断 合成，溶解氧水平不断下降。当营养消耗至一定程度，菌体生长速率减慢；出现与产物合成有 关的新酶等原因，转入产物合成阶段。

当还原糖浓度降至2%时，发酵开始由菌体生长阶段向代 谢产物合成阶段转变，此时补糖并维持糖浓度在2%可延长抗 生素分泌期，并使纳他霉素以最大的生产速率不断合成。
27.07.2020
长江大学生科院生物工程系
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补糖量
补糖量的控制，以控制菌体浓度不增或略增为 原则，使产生菌的代谢活动有利于产物合成。
一般在补糖开始阶段控制还原糖在较高水平，以 利于产物合成，但高浓度的还原糖不宜维持过久， 否则会导致菌体大量繁殖影响产物的合成。一般还 原糖水平维持在0.8～1.5%之间较为合适。
生产上补氮有两种： ◆ 补充有机氮源 ◆ 补充无机氮源：通氨、补硫酸铵
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从图中可看出，采用恒pH补料分批培 养既可以获得较高的菌体浓度，菌体中 GSH含量也较高，达到了菌体合成和GSH 生产的相对统一。因此，发酵液中的总 GSH含量最高。
27.07.2020
长江大学生科院生物工程系
残糖浓 补糖时间 补糖总量 菌体量 纳他霉素增 度(%) （h) （g/L） （g/L） 长率(%)
3.0
38
27
9.37
16.7
2.5
44
22
8.48
14.3
2.0
50
23
7.23
32.1
1.5
60
13
6.96
20.2
补糖时间过早，刺激菌体大量繁殖，加速糖的利用，进而 影响抗生素产量的增加；补糖时间过迟，使菌体所需能量供应 跟不上。
27.07.2020

最终D值的动态变化可用下式表示： 连续流加 补料分批培养（fed-batch culture） 以补加的培养基成分来区分 定义：在分批发酵过程中补充培养基，而不从发酵体系中排出发酵液，使发酵液的体积随着发酵时间逐步增加。 酶的发酵[消除分解阻遏作用]
半稳态
分批补料发酵的应用
一、通过控制底物初始浓度水平来消除高浓度底物对生长 代谢的抑制作用或由于可被快速利用的碳源所引起的分解 阻遏作用，并且能使发酵对溶解氧的需求保持在发酵罐通 气能力范围之内；
变速流加
补料分批培养（fed-batch culture）
连续流加 补料分批培养（fed-batch culture）
单一组分补料
最终D值的动态变化以可补用下加式的表培示：养基成分来区分
多组分补料
分批补料发酵动力学
在分批发酵中，生长会受到某一底物浓度的限制，在任何发酵时 间的菌体浓度可用下式表示：
以补加的培养基成分来区分
二、避免某些培养基组分高浓度下对微生物生长及代谢的抑制甚至毒副作用快，延速长流发酵加生产时间，特别是代谢产物的积累时间，以提高
发酵产量。 青霉素发酵[保障通气条件和生产能力]
流加方式
恒速流加
以CO2产生量作为补料发酵时的控制参数 补料分批培养（fed-batch culture）
自动测定发酵罐尾气中微 量乙醇含量
严格控制糖蜜补 入量
分批补料发酵的应用
青霉素发酵[保障通气条件和生产能力]
过量葡萄糖
缺乏葡萄糖
有机酸的积累
氧需求量>供氧力 pH下降
有机氮被消耗
pH上升
计算机控制补糖率， 生产期控制溶解氧
酶的发酵[消除分解阻遏作用]
株木霉
以CO2产生量作为补料发酵时的控制参数

补料分批发酵
周敏
概述 补料分批发酵动力学
补料分批发酵的优缺点
补料分批发酵的应用
•概述
1、概念
补料分批发酵：俗称“ 流加”，是以某种方式向发 酵系统中补加一定物料，但 并不连续地向外放出发酵液 的发酵技术。
•补料分批发酵是介于分批发酵与连续发酵一种特 殊培养模式：
若假设物料流入发酵罐的速率为 F 1 ，流出发酵罐的速率为 F 2 分批发酵时 F 1 = F 2 = 0 连续发酵时 F 1 = F 2 ≠0
此时底物一旦进入系统就很快被消耗掉，其消耗速率实际接近补 料速率：
F
式中： ——最大比生长率， ——比生长速率，
②
F
V
——培养基补料速率，g ——发酵液总体积， L
Hale Waihona Puke 从式②中可以看出：补加的底物量与被细胞消耗的底物量相等， 因此 .尽管发酵液的总菌量（VX）随时间延长而增加，但细胞 这种状态称为 ： 浓度（X）实际是恒定值，即 因而 准稳定状态 ，但与连续发酵状态 在补料分批发酵准稳定状态下，虽然 不同。在连续发酵中D是常数，而在补料分批发酵中， 下的 随时间延长，体积（V）增加，稀释率（D）相对降低，此时D可表 示为： D=
3、两种类型
（2）重复补料分批发酵 • 在单一补料分批发酵的基础上，每 隔一定时间按比例放出一部分发酵液， 使发酵液体积始终不超过发酵罐的最大 容积，到发酵结束将发酵液全部放出。
• 保留了单一补料分批发酵的优点， 也避免了其缺点。
•补料分批发酵动力学
以单一补料分批发酵为例： 在某一瞬间发酵液中的菌体瞬时生长速率与底物消耗速率 之间的关系：
式中：
发酵系统初始体积，L t ——发酵时间,h
按照Monod动力学方程：