5发酵过程控制5(补料)

补糖量
补糖量的控制，以控制菌体浓度不增或略增为
原则，使产生菌的代谢活动有利于产物合成。 一般在补糖开始阶段控制还原糖在较高水平， 以利于产物合成，但高浓度的还原糖不宜维持过久， 否则会导致菌体大量繁殖影响产物的合成。一般还
原糖水平维持在0.8～1.5%之间较为合适。
2013年8月7日星期三
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加、恒速流加、指数速率流加、变速流加。
从补加营养物成分来看，又有单组分补料和多组分补料。
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例： L-缬氨酸补料分批发酵的研究
南开大学学报，赵丽丽等，2002
分别采用不同的补料方式来进行： 一次定量加入：在发酵30h，残糖浓度为1%～2%时，一次 性补加467mL补料液（60%的葡萄糖水溶液），使总糖浓 度达到15%。 间歇定量加入：在初糖浓度降为1%～2%时，补加117mL补 料液，然后每当残糖浓度降为1%～2 %时补加，分4次补完， 总量为468mL。 间歇恒速流加：每当残糖浓度降为1%～ 2%时，就以 25g/L.h的速度流加补料液，直至467mL补料液全部补完。
发酵工程 课件
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第五章 发酵过程控制(5)
主讲人：夏帆
第五节 中间补料及其控制 (2学时)
教学目的: 了解中间补料的原因、优缺点，掌
握中间补料的意义、原则及控制。
教学重点、难点：中间补料补什么？怎么补
（补糖时间、补糖量、补料方式）？
1、补充能源和碳源 2、补充氮源 3、补前体 4、补水、无机盐和微量元素
16.7
17.3
32.63
34.65
不同补料方式，菌体浓度相差不大，但葡萄糖转化率 相差较大。
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不同的流加方式也会有不同的结果
例：补料方式对酵母菌生产谷胱甘肽的影响
工业微生物，童群义等，2003 三种不同的流加补料模式：酵母菌 解毒
◆ 恒速流加补料分批培养
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补碳源最早的例子 谷氨酸：在原工艺（初糖浓度较 高）的基础上，减少初糖（葡萄糖）浓度，增加生物素 （作用是用于细胞合成）用量达5μg/L，加大接种量到 10%左右，以利于菌体迅速繁殖，获得生产所需要的足 够量的菌体。 当进入产酸期，残糖达2%左右，连续补糖，维持糖 浓度在2%左右，提高温度到36～37℃，流加氨水或尿素， 维持pH7.0～7.5，利用菌体所形成的酶系继续进行发酵， 产酸可达10%。 后来补糖方法在抗生素发酵中普遍采用。
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不同补料方式对L-缬氨酸发酵的影响
补糖方式 L-缬氨酸 （g/L） 一次定量 45.98 菌体浓度 对葡萄糖的 残糖浓度 （g/L） 转化率（%） （g/L） 16.2 30.65 9.2 4.9 1.8
间歇定量
间歇恒速 流加
48.94
51.98
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常用的两个参考指标
●根据还原糖水平，如赤霉素还原糖降到0.6%就需要补糖；
●根据总糖水平，如抗生素发酵，有的是2%或3%不等。 具体要根据菌的酶系和pH变化的大小来决定补还原糖还 是总糖。如，菌体淀粉酶活力高就可补淀粉之类的物质(总糖)， 若淀粉酶活力低那就补还原糖；补还原糖pH变化明显，而补 淀粉，由于它是水解糖，pH变化很小较稳定。 注意：不同的发酵阶段控制的残糖浓度有可能不同。 如金霉素，前期3.5%，中期2.5%，后期1.5%。
够使反应器中营养物浓度控制在较低的水平， 而使菌体浓度呈指数增加。结果见下图：
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●
恒pH补料分批培养模式
根据培养基pH的变化流加40g/L的葡萄糖。
由于葡萄糖的分解变成小分子酸使pH下降，
当pH降低到一定程度后，加入碱液调节pH达到 设定的数值。然后随着糖被消耗越来越少，pH又 会升高。再根据糖的消耗加入适量的葡萄糖，当
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内容速览
一、中间补料的意义及原则 二、 中间补料控制
1、补能源和碳源 2、补氮源 3、补前体 4、补水、无机盐和微量元素
三、中间补料的优缺点
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一、中间补料的意义及原则
☼ 意义：控制菌的生长速率以及培养中期的代谢活动，延
长合成期，推迟菌体自溶。另外，加入前体增加合成产物的 中间体，从而使产量大幅度提高。
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补糖时间的选择
残糖浓 补糖时间 补糖总量 菌体量 纳他霉素增 度(%) （h) （g/L） （g/L） 长率(%) 3.0 38 27 9.37 16.7 2.5 44 22 8.48 14.3 2.0 50 23 7.23 32.1 1.5 60 13 6.96 20.2
温度30℃，转速150r/min 培养12h后，流加40g/L的葡萄糖溶液，至 60h流加结束，72h培养结束。
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● 恒速流加培养
在培养过程中以恒定的流速加入葡萄糖
好处：解除了底物抑制——葡萄糖阻遏效应， 结果延长了菌体的生长周期，增加了菌体浓度 和GSH（谷胱甘肽）产量，结果见下图：
生产的相对统一。因此，发酵液中的总
GSH含量最高。
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酵母菌发酵的四种培养模式比较
●分批培养由于没有进行补料，到发酵后期由于碳源不
够，使得酵母菌的细胞干重和GSH总量都比较低。
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例：根据残糖浓度补料发酵提高纳他霉素产量
药物生物技术，何艳玲，2002 采用间歇补料分批发酵，补加时间以发酵液中还原糖水平 为控制指标。
实验条件：
■ 当葡萄糖浓度分别降至3%、2.5%、2%、1.5%时开始平 均每隔6h补糖一次。
■ 维持葡萄糖浓度分别在3%、2.5%、2%、1.5%，研究对 纳他霉素产量的影响，发酵周期都为96h。结果如下表 ：
☼ 原则：控制和引导产生菌在培养过程中，特别是中
后期的生化代谢活动向着有利于产物积累的方向发展。
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二、中间补料控制
补什么？ 怎么补？
1、补充微生物所需的能源和碳源物质
发酵过程中，能源是从主要碳源来的。碳源是菌体需 要量最大的物质，在发酵前期消耗很快，到了产物合成 阶段菌体要维持活性必须补充碳源，以便延长产物合成 期。 如添加葡萄糖、液化淀粉、饴糖；作为消泡剂的天然 油脂，同时也起到补充碳源的作用。
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例：不同补糖速率对L-缬氨酸发酵的影响
天津科技大学，赵丽丽，2002
初糖浓度为80g/L，发酵30h后，分别以10g/L· 25g/L· h、 h、
40g/L· h的补糖速度进行，结果如下：谷氨酸棒杆菌
补糖速度 (g/L· h) 10
L-缬氨酸 （g/L） 50.42
菌体浓度 （g/L） 16.3
pH下降到一定程度后，又加入适量的碱液调节
pH。如此反复，发酵液中始终保持在较低的葡萄 糖浓度。至60h流加结束，72h发酵结束。
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从图中可看出，采用恒pH补料分批培 养既可以获得较高的菌体浓度，菌体中 GSH含量也较高，达到了菌体合成和GSH
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2、补充微生物所需的氮源
补氮是发酵控制的另一个重要项目，主要作 用是调节pH 和补充产生菌所需的氮源，从而控 制代谢活动。 生产上补氮有两种：
对葡萄糖的 转化率（%） 33.61
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52.23
49.33
17.1
16.8
34.82
32.89
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补料方式
补料方式可分为：连续流加 不连续流加 (少量多次、大量少次)
多周期流加
连续流加效果最好，可以避免因一次大量加入引起环境突 然改变给菌体代谢带来的影响。每次流加又可分为：快速流
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纳他霉素Natamycin
Streptomyces natalensis、 Streptomyces chatanoogensis、Streptomyces gilvosporeus
一种天然、广谱、高效安全的酵母菌及霉菌等丝状 真菌抑制剂，它不仅能够抑制真菌，还能防止真菌 毒素的产生. 对人体无害，很难被人体消化道吸收，而且微生物 很难对其产生抗性 国际上唯一的抗真菌微生物防腐剂。97年卫生部 正式批准纳他霉素作为食品防腐剂。目前该产品已 经在50多个国家得到广泛使用。主要应用于乳制 品、肉制品、发酵酒、饮料等食品的生产和保藏。
2013年8月7日星期三 很重要，过早会刺激菌体生长，加速 糖的消耗，不利于合成产物；过迟所需能量供应不上菌 体已老化，合成产物的能力本身都很低了。 例：四环素 补糖时间 96h效价 20h 6000u/ml 45h 10000u/ml 62h 6000u/ml 说明：开始补糖的时间必须根据代谢的变化情况来决 定，即根据基础培养基的碳源种类及用量、菌丝生长情 况、糖的消耗速率及残留水平来综合考虑，不能单纯以 时间为依据。