牛病毒性腹泻-黏膜病病毒斑点酶联免疫吸附检测法的建立

牛病毒性腹泻——黏膜病的诊治工作研究牛病毒性腹泻——黏膜病（BVD）是影响牛群的一种重要的传染性疾病，它会给牛只带来严重的健康问题，同时也对畜牧业产生了严重的经济损失。

为了有效地控制和治疗这种疾病，科研工作者们进行了大量的诊治研究工作，积累了许多宝贵的经验和信息。

本文将对牛病毒性腹泻——黏膜病的诊治工作进行综述，希望能够为相关研究和实践工作提供一定的参考。

一、疾病特征牛病毒性腹泻——黏膜病是由牛病毒性腹泻病毒（BVDV）引起的一种传染性疾病，主要通过呼吸道分泌物和粪便传播。

患病的牛只会出现食欲不振、腹泻、发热、呼吸困难、暂时性粘膜损伤等症状，严重者可能导致胎儿畸形和流产，甚至死亡。

由于病毒感染后患牛只会有一部分表现出症状，而另一部分可能表现为隐性感染状态，这就给疾病的诊断和控制带来了一定的困难。

二、诊断方法1. 临床诊断临床诊断是最为常见的诊断方法，通过观察牛只的临床症状来判断是否患有牛病毒性腹泻——黏膜病。

一般来说，出现腹泻、发热、食欲不振等症状的牛只有可能患病，但这种方法不能100%确定诊断结果。

2. 实验室检测实验室检测是确定病情的可靠方法之一，包括病毒抗体检测、PCR检测、病毒分离等。

病毒抗体检测能够判断牛只是否存在病毒感染，PCR检测能够确定病毒的存在和种类，病毒分离则能够帮助科研人员研究病毒的生物学特性。

三、治疗方法目前，牛病毒性腹泻——黏膜病的治疗并不是特别理想，一般主要是针对症状进行处理，例如对发热的牛只进行退热治疗、对腹泻的牛只进行止泻治疗等。

对于胎儿畸形和流产的情况，也需要及时进行处理，包括保温、营养补充等。

防疫工作也是非常重要的，主要包括疫苗接种和隔离措施。

疫苗接种能够帮助牛只产生免疫力，减少病毒的传播和疾病的发生，而隔离措施则能够有效地阻断病毒的传播途径，减少疾病的传播范围。

四、预防工作预防工作是控制牛病毒性腹泻——黏膜病的关键，主要包括以下几个方面：1. 加强养殖管理，保持环境卫生和牛只饮食的健康。

肉牛传染病的牛病毒性腹泻黏膜病临床诊疗技术牛病毒性腹泻-黏膜病其特征为黏膜发炎、糜烂、坏死和腹泻。

（一）病原牛病毒性腹泻病毒，又名黏膜病病毒。

本病毒对乙醚、氯仿、胰酶等敏感，pH3以下易破坏，50℃氯化镁中不稳定；50℃很快被灭活。

血液和组织中的病毒在冰冻状态（-70℃）和冻干可存活多年。

（二）流行特点各种年龄的牛均易感，幼龄牛易感性较强，患病牛和带毒牛是本病的主要传染源。

本病的流行特点：新疫区急性病例多，不论放牧牛或舍饲牛，成年牛或幼龄牛均可感染发病，发病率通常不高，约为5品，其病死率为90号～100号，发病牛以6～18个月者居多；老疫区则急性病例很少，发病率和病死率很低，而隐性感染率在50号以上。

本病常年均可发生，通常多发生于冬末和春季。

封闭饲养的牛群发病时往往呈暴发式。

现已确定，本病毒能通过胎盘屏障而使其胎儿感染。

因此，妊娠牛感染本病后可导致其后代产生高滴度抗体并出现该病的特征性损害。

（三）症状急性病牛突然发病，体温升高至40～42℃，持续4～7d，有的还有第二次升高，随体温升高，白细胞减少，持续1～6d，继而又有白细胞微量增多，有的可发生第二次白细胞减少。

病牛精神沉郁、厌食、鼻眼有浆液性分泌物，2～3d内鼻镜及口腔黏膜表面糜烂，舌面上皮坏死、流涎增多，呼出的气体恶臭。

通常在口内损害之后常发生严重腹泻、开始水泻，以后带有黏液和血。

慢性病牛很少有明显的发热症状，但体温可能有高于正常的波动。

特征性的表现是鼻镜上的糜烂，此种糜烂可在鼻镜上连成一片。

眼常有浆液分泌物。

由于蹄叶炎及趾间皮肤糜烂坏死而致的跛行是最明显的症状。

大多数患牛2～6个月内死亡，母牛在妊娠期感染本病时常发生流产，或产下有先天性缺陷的犊牛。

（四）病理变化本病主要病变在消化道和淋巴组织。

鼻镜、鼻腔黏膜、齿龈、上腭、舌面两侧及颊部黏膜有糜烂及浅溃疡，特征性损害是食道黏膜糜烂，呈大小不等形状与直线排列；第四胃炎性水肿和糜烂；肠壁因水肿增厚，肠淋巴结肿大，小肠急性卡他性炎症，盲肠、结肠、直肠有卡他性、出血性、溃疡性以及坏死性等不同程度的炎症；蹄部的损害是在趾间皮肤及全蹄冠有急性糜烂性炎症以至发展为溃疡及坏死。

牛病毒性腹泻病毒（BVDV）纳米抗体生物学特性研究及ELISA检测方法的建立牛病毒性腹泻病毒（BVDV）纳米抗体生物学特性研究及ELISA检测方法的建立引言牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）是一种引起牛的持续性和急性呼吸道疾病的病毒。

它对全球畜牧业造成了巨大的经济损失和健康威胁。

因此，准确快速地检测牛病毒性腹泻病毒对于疾病的控制和预防具有重要意义。

传统的检测方法存在一些限制，如病毒毒力传播、耗时长等。

本研究旨在探索牛病毒性腹泻病毒的纳米抗体生物学特性，并建立一种高效准确的ELISA检测方法。

方法1. 牛病毒性腹泻病毒的纳米抗体生物学特性研究（1）克隆和表达BVDV的毒血凝素E2基因；（2）制备毒血凝素E2蛋白纳米抗体；（3）对纳米抗体的亲和力和特异性进行表征。

2. ELISA检测方法的建立（1）设计并合成特异性抗原表位肽；（2）免疫动物，制备特异性抗体；（3）优化ELISA反应条件，包括抗原浓度、抗体浓度和反应时间；（4）对样本进行检测，比对传统检测方法。

结果和讨论1. 牛病毒性腹泻病毒的纳米抗体生物学特性研究结果显示，毒血凝素E2基因成功克隆并表达，纳米抗体表现出很高的亲和力和特异性。

这为后续的ELISA检测方法的建立提供了可靠的基础。

2. ELISA检测方法的建立结果表明，设计的特异性抗原表位肽成功合成，并通过免疫动物制备了特异性抗体。

在优化的反应条件下，利用ELISA方法检测各种样本，包括感染样本和健康样本，与传统检测方法进行比较分析。

结果显示，本研究建立的ELISA方法在检测牛病毒性腹泻病毒方面具有高度的敏感性和特异性，并且检测速度明显提高，与传统方法相比具有显著优势。

结论本研究通过探索牛病毒性腹泻病毒的纳米抗体生物学特性，成功建立了一种高效准确的ELISA检测方法。

该方法具有较高的敏感性和特异性，并且相较于传统方法更加快速。

该研究为牛病毒性腹泻病毒的控制和预防提供了有力的技术支持，为畜牧业的发展和健康做出了贡献。

牛病毒性腹泻-粘膜病实验室诊断技术牛病毒性腹泻-粘膜病需要采用实验室检测对病毒进行识别，为病毒诊断提供有效依据。

随着对牛病毒性腹泻-粘膜病诊断技术的深入研究，已经建立了多种诊断牛病毒性腹泻粘膜病的诊断方法，本文将主要的方法介绍如下，供参考和选择。

1 临床表现牛病毒性腹泻-粘膜病是由牛病毒性腹泻病毒感染引起，对牛具有较大的危害，该病的潜伏期7～10d。

该病的临床症状比较明显可分急性和慢性两种。

（1）急性病症潜伏期一般在1周左右，病牛将出现持续高烧、精神不振等症状。

严重时，将会引发腹泻，致使牛体内水分流失，使其体温升高，进而引发牛的死亡。

（2）慢性病症病牛的体温长期偏高，临床表现不如急性腹泻剧烈，但同样会对牛造成较大影响。

而且，牛的眼角、鼻腔会出现大量的分泌物，导致牛逐渐消瘦，使其失去健康的体征。

该病后期，病牛会极度消瘦，黏膜会出现大量的充血，肠道伴有粘液、气泡等，导致牛无法正常采食，使其逐渐衰弱而死亡。

所以，需要做好该病的防治工作，避免该病的发生和流行，应结合实验室诊断的方式，使病变能够得到及早预防，降低粘膜病对牛的影响。

2 实验室诊断技术2.1 免疫过氧化物酶技术该技术具有较强的可靠性，诊断结果较为准确。

采用该技术检测时，需要对BVD-MDV抗原进行检测，对其分布状况进行确定，对抗原，需要采用过氧化物酶进行处理，制作组织切片，抗原将固定在组织中，确保抗原检测精确度。

切片需要采用0.02%蛋白酶进行处理，在4℃环境下，对切片进行消化处理，提高切片对酶的亲和度。

牛病毒性腹泻—粘膜病属于持续性的病毒血症，对组织的影响较为严重，对病毒抗原应进行严格检测，提高病原检测技术的有效性。

对BVD-MDV可以采用间接鉴定形式，通过过氧化物酶对切片的着色检查，借由免疫荧光法进行检验，进而可以通过显微镜进行观察，确保染色后的细胞能够肉眼可见。

2.2 蛋白A胶体金免疫电镜技术电镜检查是病毒诊断的重要方式，能够实现病毒粒子的检测，对病毒粒子进行敏感识别。

·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报摘 要：为建立一种牛病毒性腹泻病毒（BVDV ）的快速检测方法，本研究根据国内BVDV 流行毒株5'-UTR 序列保守区域设计1对特异性引物和TaqMan 探针，并优化了反应条件，最终建立了一种检测BVDV 基因1型（BVDV-1）的TaqMan 探针荧光RT-PCR 检测方法，并开展7省份BVDV-1型检测和流行情况分析。

结果显示：所建立方法能够特异性检测出BVDV-1，与基因2型BVDV 、猪瘟病毒、边界病毒、牛冠状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛轮状病毒等病原无交叉反应；灵敏度高，最低检测下限为4.3 copies/μL ；批内和批间变异系数均小于2%，重复性良好。

7省份规模化牛养殖场BVDV-1型平均阳性率为17.40%（161/925），序列分析表明我国主要流行的为BVDV-1a ，BVDV-1c 亚型。

本研究成功建立了一种良好的诊断BVDV 的方法，监测地区优势流行毒株为BVDV-1a 与1c 亚型，为临床中BVDV 早期诊断和流行病学调查监测提供了技术和数据支持。

关键词：牛病毒性腹泻病毒；荧光RT-PCR ；诊断；流行病学调查中图分类号：S852.65文献标志码： A文章编号：1674-6422（2024）02-0139-07Development and Clinical Application of TaqMan Reverse Real Time PCR forDetection of Bovine Viral Diarrhea VirusYUAN Ye 1,2, DONG Yaqin 2, ZHANG Hui 2, LIU Shuang 2, CUI Jin 2, Ni Bo 2, WEI Rong 2, GU Congcong 3,DUAN Gang 1, ZHANG Feng 2, LI Xiaocheng 2, DAI Feiyan 1(1. College of Veterinary Medicine, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China; 2. China Animal Health and EpidemiologyCenter, Qingdao 266032, China; 3. Huantai animal husbandry and Fishery Service Center, Zibo 300384, China)收稿日期：2022-02-23基金项目：“十四五”国家重点研发计划（2021YFD180030）作者简介：袁野，男，硕士研究生，临床兽医专业通信作者：张锋，E-mail：******************；李晓成，E-mail：********************；代飞燕，Email：*****************牛病毒性腹泻病毒TaqMan 探针荧光RT-PCR 方法的建立和临床应用袁 野1,2，董雅琴2，张 慧2，刘 爽2，崔 进2，尼 博2，魏 荣2，顾丛丛3，段 纲1，张 锋2，李晓成2，代飞燕1（1.云南农业大学动物医学院，昆明650201； 2.中国动物卫生与流行病学，青岛266032；3.桓台县畜牧渔业服务中心，淄博256400）2024,32(2):139-145Abstract: A TaqMan-based real-time RT-PCR assay was developed in the present study for rapid detection of bovine viral diarrhea virus (BVDV) using a pair of primers and TaqMan probe targeting the BVDV-1 conserved 5'-UTR gene sequence of domestic epidemic strains. Then this detection method was used to conduct surveillance and epidemic analysis of BVDV-1 in 7 provinces. The results showed that the developed real-time RT-PCR assay was specifi c for BVDV-1 and had no cross-reaction with BVDV-2, classical swine fever virus, border disease virus, bovine coronavirus, infectious bovine rhinotracheitis virus and bovine rotavirus. The detection limit of the assay was as low as 4.3 copies /μL . In addition, this assay has good reproducibility with less than 2% of the coeffi cient of variation within batches· 140 ·中国动物传染病学报2024年4月牛病毒性腹泻病（bovine viral diarrhea, BVD）又称为黏膜病（mucosal disease, MD），是由牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus, BVDV）引起的高度接触性传染病，各年龄牛都易感，其中，犊牛易感性最高，临床上主要表现为腹泻、流产以及小牛先天持续性感染[1-2]。

中图分类号:S 852.659.6　文献标志码:A 文章编号:167324696(2010)0120051204牛病毒性腹泻病毒RT 2PCR 检测方法的建立及应用孟　雨1,2,吴发兴2,朱紫祥1,张　志2,张燕霞2,刘　爽2,李晓成23,王晶钰13(1.西北农林科技大学,陕西杨凌　712100;2.中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛　266032) 摘要:根据GenBank 中登录的牛病毒性腹泻病毒(BVDV )5′U TR 基因序列,设计合成了1对特异性引物,建立了检测BVDV 218bp 片段的R T 2PCR 方法。

通过对该方法的特异性、敏感性和重复性进行试验,结果显示,该方法从BVDV 标准毒株Oregon C 24V 中扩增出了218bp 的特异性片段,而对猪瘟病毒、蓝舌病病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、MDB K 正常细胞的扩增结果均为阴性。

经对标准毒株的细胞毒进行检测,其敏感度达10-1TCID 50。

不同人员用该方法进行检测,结果均一致,表明其重复性好。

应用该方法对70份临床疑似发病猪样品进行检测,结果检出11份阳性,阳性检出率约为15.7%。

在对5份细胞培养用犊牛血清的检测中,亦检出2份阳性。

表明,建立的R T 2PCR 方法具有特异、灵敏、高效、快速的特点,可用于BVDV 的临床检测及流行病学监测。

关键词:牛病毒性腹泻病毒;5′U TR 基因;反转录聚合酶链反应;检测Establishment and application of RT 2PCR for detectionof bovine viral diarrhea virusM EN G Yu 1,2,WU Fa 2xing 2,ZHU Zi 2xiang 1,ZHAN G Zhi 2,ZHAN G Yan 2xia 2,L IU Shuang 2,L I Xiao 2cheng 2,WAN G Jing 2yu 1(1.N orthwest S ci 2Tech Universit y of A g riculture and Forest ry ,Yangling 712100,China;2.China A nimal Health and Epi demiology Center ,Qing dao 266032,China ) Abstract :A reverse t ranscription PCR (R T 2PCR )for detection of bovine viral diarrhea virus (BVDV )was established using a pair of specific primers based on t he 5′U TR gene of BVDV p ublished in GenBank.This met hod could specifically amplify a 218bp f ragment f rom BVDV Oregon C 24V st rain ,but not f rom classical swine fever virus ,blue tongue virus ,infectious bovine rhinotracheitis virus ,porcine reproductive and respiratory syndrome virus ,porcine p seudorabies virus and normal MDB K cells.In a test of 70samples suspected wit h swine disease ,t he detection rate was about 15.7%.Out of 5calf sera for cell cult ure ,2were po sitive wit h BVDV.The established R T 2PCR was specific ,sensitive ,efficient and rapid for t he detection ,monitoring and epidemiological investigation of BVDV infection.K ey w ords :bovine viral diarrhea virus ;5′U TR gene ;R T 2PCR ;detection 牛病毒性腹泻病(bovine viral diarrhea ,BVD )是由牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea vi 2rus ,BVDV )引起的临床上以发热、黏膜糜烂溃疡、腹泻、咳嗽、持续性感染与免疫耐受以及怀孕母牛流产、畸胎甚至死胎等为主要特征的牛传染病[1]。

2021年第38卷第3期99BVDV 、BRV 和BCoVTaq Man 三重RT-qPCR 检测方法的建立孙亚杰1，关平原1，周伟光1，徐晓静1，希尼尼根1，于景丽2（1. 内蒙古农业大学兽医学院，农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室，内蒙古呼和浩特　010018；2. 内蒙古大学生态与环境学院，内蒙古呼和浩特　010021）摘　要：为建立牛病毒性腹泻病毒（BVDV ）、牛轮状病毒（BRV ）和牛冠状病毒（BCoV ）的快速检测方法，根据GenBank 中登录的BVDV 5'-UTR 、BRV NSP5和BCoV N 基因序列设计特异性引物和探针，通过优化反应体系和条件，建立了同时检测上述3种病毒的Taq Man 三重RT-qPCR 方法。

该方法仅对BVDV 5'-UTR 、BRV NSP5和BCoV N 基因扩增呈阳性，而对牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒、魏氏梭菌（A 型、B 型和D 型）、多杀性巴氏杆菌（A 型和B 型）等犊牛腹泻相关病原扩增均呈阴性；最低检出限为10拷贝/μL ；组内和组间变异系数均小于2%。

利用本研究建立的Taq Man 三重RT-qPCR 方法对29份临床样品进行检测，获得BVDV 、BRV 、BCoV 的4种混合感染型，其中BVDV 与BCoV 的混合感染率最高（27.6%）；与已有单重RT-qPCR 方法比较，发现两种方法检测BVDV 、BRV 和BCoV 的符合率分别为100%、96.5%、100%。

结果表明，本研究建立的Taq Man 三重RT-qPCR 方法具有特异性强、敏感性高、重复性好、可行性高等优点，可为今后BVDV 、BRV 和BCoV 共感染引起的牛腹泻性疾病的鉴别诊断和流行病学调查提供新技术手段。

关键词：牛病毒性腹泻病毒；牛轮状病毒；牛冠状病毒；Taq Man 三重RT-qPCR ；混合感染中图分类号：S852.65 文献标识码：A 文章编号：1005-944X （2021）03-0099-08DOI ：10.3969/j.issn.1005-944X.2021.03.020 开放科学（资源服务）标识码（OSID ）：Establishment of Taq Man Triple RT-qPCR for Detecting BVDV ，BRV and BCoVSun Yajie 1，Guan Pingyuan 1，Zhou Weiguang 1，Xu Xiaojing 1，Xininigen 1，Yu Jingli 2（1. College of Veterinary Medicine ，Inner Mongolia Agricultural University ，Key Laboratory of Clinical Diagnosis and Treatment of Animal Diseases ，Ministry of Agriculture and Rural Affairs ，Hohhot ，Inner Mongolia 010018，China ；2. School of Ecology and Environment ，Inner Mongolia University ，Hohhot ，Inner Mongolia 010021，China ）Abstract ：In order to establish a rapid method for detecting bovine viral diarrhea virus （BVDV ），bovine rotavirus （BRV ）and bovine coronavirus （BCoV ），the specific primers and probes were designed according to the sequences of 5'-UTR ，BRV NSP5 and BCoV N genes registered in GenBank ，followed by the optimization of reaction systems and conditions ，then the Taq Man triple RT-qPCR was established to simultaneously detect the above three viruses. By which ，positive results only occurred in the amplification of BVDV 5'-UTR ，BRV NSP5 and BCoV N genes ，but negative for infectious bovine rhinotracheitis virus （IBRV ），bovine parainfluenza virus （BPIV ），Clostridium welchii （type A ，B and D ），Pasteurella multocida （type A and B ）and other pathogens related to calf diarrhea ；the minimum detection limit was 10 copies/μL ；and the variation coefficients of intra-and inter-group were less than 2%. 29 clinical 收稿日期：2021-01-21　修回日期：2021-02-05基金项目：内蒙古自治区科技重大专项（2020ZD 0006）；国家自然科学基金项目（31660724）通信作者：希尼尼根。

牛病毒性腹泻病毒核酸快速检测方法的建立牛病毒性腹泻病毒（BVDV）是一种广泛存在于全球范围内的病毒性疾病，在牛群中造成了严重的经济损失和动物福利问题。

准确快速地检测BVDV感染对于控制和预防该病具有重要意义。

本文旨在介绍一种牛病毒性腹泻病毒核酸快速检测方法的建立。

在建立快速检测方法之前，首先需要理解BVDV的基本特性。

BVDV是一种单股RNA病毒，属于黄病毒科。

该病毒具有很高的变异性，可分为两个亚种：Cytopathic（CPE）和非Cytopathic（non-CPE）。

感染BVDV的牛群中，出现腹泻、发热、免疫抑制等一系列症状，对牛的健康和生产性能造成严重的影响。

传统BVDV检测方法通常包括病毒分离和血清学检测。

然而，这些方法存在着复杂、耗时、成本高的问题。

因此，我们需要发展一种简便、快速、准确的检测方法来满足实际需求。

一种基于核酸检测的PCR方法被广泛应用于不同病毒的检测。

在牛病毒性腹泻病毒的核酸检测中，亦可采用PCR方法。

该方法基于病毒RNA和特异引物，在PCR反应中引物与病毒RNA结合，经过一系列特定温度的反应，产生扩增产物。

这种PCR扩增产物可以通过凝胶电泳或实时荧光PCR检测，以确定是否存在BVDV感染。

在牛病毒性腹泻病毒核酸快速检测方法的建立过程中，我们需要选择适当的引物和PCR条件。

在引物的选择中，应首先选择与BVDV RNA亚种特异性高的引物。

而在PCR条件的确定中，我们需要考虑反应温度、催化剂浓度、引物和模板浓度等因素。

通过反复试验和优化，最终确定最适合的引物和PCR条件。

另外，为了提高检测效率和准确性，还可以使用实时荧光PCR技术。

与常规PCR不同，实时荧光PCR可以在PCR反应的同时检测扩增产物的数量，通过荧光信号的强度来定量病毒RNA的含量。

这种方法具有快速、准确的特点，逐渐成为BVDV 检测的首选方法。

在实际应用中，该检测方法可以应用于动物诊断实验室、养殖场和进出口动物监测等方面。

牛病毒性腹泻病毒检测方法研究进展贾伟娟1，王海锋1，付明山1，赵心悦1，包雨鑫1*，张强21.内蒙古通辽市农牧科学研究所，内蒙古通辽 028000；2.内蒙古通辽市农牧业综合行政执法支队，内蒙古通辽 028000摘要牛病毒性腹泻是由牛病毒性腹泻病毒感染牛引起牛发生呼吸道疾病、免疫抑制及生殖障碍等特征的急性、高度接触性传染病。

由于牛感染该病后与其他引起牛腹泻的病症类似，需要根据不同的情况选择相应的检测方法，及时切断BVDV牛群间的相互传播，减少因感染该病而造成的经济损失。

因此，建立快速、准确的检测方法对该病的防控尤为重要。

本文综述了牛病毒性腹泻病原及用于检测该病的检测方法，如病毒分离鉴定、RT-PCR、微滴式数字RT-PCR（dd-PCR）、纳米PCR、二温式PCR等检测技术，以期为牛病毒性腹泻的科学检测、诊断及防控提供理论基础。

关键词牛病毒性腹泻；病原；病毒的分离鉴定；核酸检测技术；血清学检测牛病毒性腹泻（bovine viral diarrh，BVD）是由牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrh virus，BVDV）感染牛而引起病牛出现发热、咳嗽、腹泻、发育迟缓以及怀孕母牛流产或产畸形胎为主要特征的1种急性、高度接触性传染病[1-2]。

该病的易感动物以牛为主，其中，幼犊最易感且死亡率较高；此外，其还可感染猪、羊、骆驼等动物[3-4]。

目前，该病被我国认定为三类传染病，感染后发病机制较为复杂，除了导致呼吸道和消化道损伤、生殖障碍及生长发育迟缓外，还可引起继发性感染与持续感染，严重危害我国肉牛养殖业的健康发展，也给肉牛养殖业造成了巨大的经济损失[5]。

临床上常用的检测方法主要包括病毒的分离鉴定、核酸检测技术、血清学检测方法，不同检测方法的特异性、敏感性、适用的场景及所需的时间也不同，本文综述了BVDV常用的检测技术研究进展，以期为BVDV的检测、诊断及防控提供思路。

1　BVDV病原特性BVDV是隶属于黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus），有外膜、有纤突、形状为球形的单股正链RNA病毒，长12.3~12.8 kb；包括3种不同的基因型，即BVDV-1、BVDV-2和BVDV-3，每种基因型也被分成了不同的亚型，在我国主要流行的是BVDV-1型的1 m~1 v[6-8]。

中国动物保健2021.05疾病防治牛病毒性腹泻-黏膜病是由黏膜病毒引起的，主要表现为牛出现黏膜发炎、糜烂、坏死以及患病牛出现腹泻。

这种疾病主要通过直接接触和间接接触进行传播，并且这种疾病不仅能够引起牛发病，这种病毒还能够引起羊、猪以及家兔产生疾病。

牛病毒性腹泻在全球各个地方均有发病，并且我国有20多个省市均报道过该病。

在我国海关进口动物进行动物检疫对象中，牛病毒性腹泻被列为二类传染病。

随着我国进口奶牛数量的增加，牛病毒性腹泻已经成为严重影响我国养牛业的疾病之一。

做好该病的诊断和防治可以降低该病对我国养牛业的影响。

本文主要从牛病毒性腹泻的病因、牛病毒性腹泻的症状和牛病毒性腹泻的诊断和防治出发阐述该病，以期为我国减少牛病毒性腹泻的影响提供指导。

1牛病毒性腹泻的病因牛病毒性腹泻-黏膜病是由牛病毒性腹泻病毒或者牛黏膜病病毒引起的疾病，这种病毒是一种黄病毒科、瘟病毒属的一种病毒，该病毒是一种单股正链RNA 病毒，牛黏膜病毒粒子呈圆形，并且有囊膜。

牛黏膜病毒能够感染牛、羊、猪和兔子等动物，染病病毒通过直接接触和间接接触的方式将该病毒传染给易感动物。

染病的动物或者带病毒的动物是该病的传染源。

牛黏膜病毒通过呼吸道和消化道感染，犊牛也可以通过胎盘进行感染。

牛病毒性腹泻常年都会发生，但是主要以冬末和春初染病的频率较高。

牛黏膜病毒对有机溶剂较为敏感，通常乙醚、氯仿等都可以将该病毒杀死，该病毒在酸性环境下也较为容易被杀死，一般情况下pH 在3.0以下就可以将该病毒杀死。

2牛病毒性腹泻的症状牛病毒性腹泻根据临床症状可以分为急性型牛病毒性腹泻和慢性型牛病毒性腹泻。

2.1急性型牛病毒性腹泻牛急性型病毒性腹泻的发病一般较快，并且发病的牛通常会体温升高，体温一般会升高到41℃左右，并且能够持续一周左右，感染急性型牛病毒性腹泻的牛一般表现为精神沉郁、采食量降低、口腔黏膜表面出现糜烂、舌头表面的皮肤出现坏死，有些牛的趾间皮肤也会出现糜烂从而导致牛出现跛行。

牛病毒性腹泻粘膜病的的诊断技术作者：王海荣来源：《畜牧兽医科学》 2018年第1期摘要：牛病毒性腹泻／粘膜病是兽医临床常见的一种疾病，流行范围广，传播速度快，给养殖业造成的损失大。

笔者对此病的诊断技术做了详细的阐述，以期为养殖户提供理论和技术参考。

关键词：牛病毒性腹泻／粘膜病；病毒分离；血清学诊断；分子生物学检测中图分类号：S858.3文献标识码：BDOI：10. 3969/j．issn．2096-3637. 2018. 01. 106牛病毒性腹泻，粘膜病是由病毒性腹泻病毒( BVDV)引起的一种高度接触性传染性疾病。

常见家畜如牛、猪、羊、骆驼、等都可以感染病毒性腹泻病毒。

由于感染该病的家畜表现出的临床症状并不典型，且与其它疫病引的临床症状非常相似，很难区分是何种病引起的家畜发病，因此，准确诊断技术是先决条件，本文主要针对牛病毒性腹泻／粘膜病的诊断技术做一详细的介绍，以期为养殖户提供理论和技术参考。

1病毒的分离鉴定病毒分离鉴定技术是诊断病毒病最常用和最可靠的方法。

病毒的分离主要是将采集的病料先进行无菌处理，再接种到原代细胞或者传代细胞上进行繁殖。

BVDV病毒对细胞没有严格的选择性，可以在多种细胞上正常生长，其中最为常用的细胞主要有牛的肾细胞和牛的鼻甲骨细胞。

随后通过观察病毒引起的细胞病变做预判定，对于没有发生细胞病变的细胞可以用免疫荧光技术或者免疫过氧化物酶的方法确定接种物中是否含有BVDV病毒。

除了采集病畜的病料外，病畜的鼻拭子、淋巴细胞、血液粪便等都可以用来分离病毒，有研究表明在病毒血症期间，BVDV病毒在以上分泌物中的含量非常高。

2血清学诊断2.1琼脂扩散试验琼脂扩散试验也就是我们常说的沉淀反应，其主要原理是病毒抗原与特异性血清在含有电解质的琼脂中相互作用发生反应。

本检测方法所用的病料可以直接选取病死动物的发炎组织或者是发生糜烂的组织，与阳性血清进行反应。

这主要是由于存在于所采集病料中的病毒抗原用琼脂扩散试验就可以直接检测到。

基于单抗捕获牛病毒性腹泻病毒抗原ELISA方法的建立及病原流行病学调查牛病毒性腹泻-黏膜病(BVD-MD)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的牛的一种临床上以高热、流涎、腹泻、粘膜充血、溃疡、生产性能下降、孕牛流产、犊牛呈现免疫耐受和持续性感染为特征的传染病。

该病在世界上许多国家和地区广泛流行,严重影响养牛业的健康发展。

BVDV除感染牛外,也可感染羊、鹿、猪及其他野生型动物。

依据病毒能否引起细胞病变,BVDV可以分为致细胞病变(cytopathic,CP)和非致细胞病变(non-cytopathic,NCP)两种生物型。

根据病毒基因组核苷酸序列的差异,BVDV又可分为I和II两种基因型,不同基因型又可进一步分为不同基因亚型。

分子流行病学研究发现,国内目前流行的BVDV毒株主要以BVDV-Ib和Im两种基因亚型为主。

近年来,BVDV感染一直是阻碍我国养牛业健康发展的重要传染病之一,因此,对BVDV的早期诊断与监控显得尤为重要。

为建立一种特异、敏感、快速、简便且易于在基层推广应用的检测BVDV抗原的诊断方法,本研究基于BVDV CC13B毒株E2结构蛋白基因序列,应用分子生物学技术扩增及大肠杆菌原核表达系统表达了E2重组蛋白,并以此制备出了抗E2结构蛋白的单克隆抗体与多克隆抗体,建立了基于单抗捕获BVDV抗原的双抗体夹心ELISA方法。

方阵滴定法试验确定出双抗体夹心ELISA方法所用的单克隆抗体的最佳包被量为200 ng/孔,酶标多克隆抗体的最佳稀释倍数为1 000倍稀释。

对100份BVDV阴性的粪便样品进行了检测,以统计学方法确定出夹心ELISA检测BVDV抗原的判定标准,即待检样品OD490值≥x+3s=0.1567时,检测结果判定为阳性。

特异性、敏感性及重复性试验结果表明本研究建立的检测BVDV抗原的方法具有特异、敏感、快速及重复性好等特点。

牛病毒性腹泻病毒SYBR,Green,Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用[��?D����”csibaskets/all-3-1.html” target=“_blank” class=“keylink”>公司;Light Cycler 480Ⅱ荧光定量PCR仪，罗氏公司;2×Easy Taq PCR SuperMix，购自北京全式金生物技术有限公司;pClone 007 Blunt Vector Kit，购自北京擎科生物技术有限公司。

1.3引物的设计与合成参考GenBank中牛病毒性腹泻病毒的全基因组核酸序列，设计特异性扩增BVDV的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR引物，由北京擎科生物技术有限公司合成，引物序列如表1所示。

1.4病毒RNA提取和cDNA合成取200 μL BVDV病毒原液，按照病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书，提取BVDV 病毒基因组RNA，然后按照反转录试剂盒说明书将RNA反转录成cDNA。

1.5阳性标准品的制备以提取的BVDV病毒基因组cDNA为模板，BVDV-F/R为引物进行PCR扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，回收目的片段，连接至pClone 007载体，鉴定正确的重组质粒作为阳性标准品，命名为pClone 007-E2。

测定质粒浓度，按照以下公式转换成质粒的拷贝数：拷贝数=质粒浓度×10-9×6.02×1023/（660×质粒长度），将pClone 007-E2质粒进行10倍倍比稀释，放于-20℃冰箱备用。

1.6建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法以pClone 007-E2质粒为模板，采用方阵法对引物浓度（5～20 pmol/L）、退火温度（55～62℃）进行摸索，最终选取Ct最小值、荧光最高值、熔解曲线特异性明显的PCR反应条件。

采用优化完成的反应条件，以10倍梯度稀释后的阳性标准品pClone 007-E2为模板，进行实时荧光定量PCR扩增，根据Ct值绘制标准曲线。

牛病毒性腹泻-黏膜病病毒双抗体夹心Dot-ELISA检测方法的建立张宁;秦建华;赵博伟;李兰芳【期刊名称】《畜牧与兽医》【年(卷),期】2008(40)12【摘要】采用辛酸-硫酸铵法提取兔抗牛病毒性腹泻-黏膜病毒(BVDV)高免血清中的免疫球蛋白IgG,辣根过氧化物酶标记提纯后IgG,建立了检测BVDV抗原的双抗体夹心斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)法。

结果显示,抗体最佳包被量为300μg/mL,酶标记抗体的最适浓度为1∶50倍稀释,以5%牛血清作为封闭液、封闭45min效果最佳,抗原最小检出量是1.34μg/mL。

应用建立的检测方法对河北省内78份腹泻奶牛血样进行了检测,阳性检出率为57.69%;经卡方检验分析,建立的Dot-ELISA与琼脂扩散(AGP)法相比较,阳性检出率差异显著。

试验证明,该方法具有简便快速、特异性强、重复性高的优点,适合于基层兽医的检测诊断。

【总页数】3页(P72-74)【关键词】牛病毒性腹泻-黏膜病病毒;斑点酶联免疫吸附试验;检测【作者】张宁;秦建华;赵博伟;李兰芳【作者单位】河北省畜牧兽医研究所;河北农业大学;河北省畜牧兽医服务中心;河北省保定市畜牧局【正文语种】中文【中图分类】S851.34【相关文献】1.牛病毒性腹泻/黏膜病毒抗体间接ELISA检测方法的建立 [J], 常敬伟;邢思毅;常春龙;毕莹;王士霞;李田田;周玉龙;倪宏波2.牛病毒性腹泻病毒双单克隆抗体夹心ELISA检测方法的建立及初步应用 [J], 杨俊兴;曹琛福;曾少灵;卢体康;孙洁;张彩虹;唐金明;陶虹;吕建强3.抗牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体的制备及双抗夹心ELISA检测方法的建立 [J], 蒋颖;朱国强;林燕清;陶洁;孟祥升;段小丽;王娟;王银;张信军;王建业4.双抗体夹心阻断ELISA检测血清牛病毒性腹泻—粘膜病病毒抗体的研究 [J], 王新平;程焰5.牛病毒性腹泻病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立 [J], 高存福;秦建华;赵月兰;包永占;张宁因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

牛病毒性腹泻-粘膜病病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用陈其兵;薛霜;漆世华;朱薇;张萍;谢红玲;温文生;吴玉石【期刊名称】《中国兽药杂志》【年(卷),期】2012(046)004【摘要】为建立-种牛病毒性腹泻-粘膜病病毒（BVDV）的快速检测方法，根据GenBank中登录的BVDV基因序列，针对5’UTR的保守序列，设计合成了一对特异性引物和一条TaqMan荧光探针。

通过对反应条件和反应体系进行优化，建立了一种能快速定量检测BVDV的荧光定量RT—PCR检测方法。

通过对20份胎牛血清样品和猪瘟细胞苗半成品进行检测，对该方法的特异性、敏感性和重复性进行试验。

结果显示，建立的方法能检测到BVDV，而对CSFV、PRRSV和MDBK 细胞的扩增结果均为阴性，具有高度的特异性。

在所检测的20份样品中，BVDV 阳性6份（30％）。

对所构建的标准品进行检测，在10^2-10^8拷贝／μL的范围内可以得到良好的动力学曲线，能检测低至10^3-10^4拷贝／mL的病毒量。

表明所建立的检测方法具有快速、特异、灵敏、重复性好等特点，可用于临床及科研中对BVDV的快速定量检测和对牛血清及猪瘟兔化弱毒疫苗等生物制品中是否污染BVDV进行监测。

%According to the genomic sequences within 5 ＇UTR of BVDV which published in Genbank, a pair of primers and a Taqman probe were designed. Then a rapid fluorescent quantitative RT - PCR method was developed by optimization of the reaction conditions and system. This method was established by specificity, sensibility, reproducibility. Twenty samples of fetal bovine serum and swine fevervaccine were detected by this methed. The experiment showed that six samples were positive and the ratio was 30%, and the detection result of CSFV, PRRSV and MDBK cells were all negative. A standard curve was achieved and the result showed that the sensitivity of this method was10^3 - 10^4copies/mL and the linear relation was excellent. The results show that this method is fast, specific, sensitive, repeatable and can be used to monitor the pollution of BVDV in biological products and quantitative detection of BVDV.【总页数】4页(P4-6,47)【作者】陈其兵;薛霜;漆世华;朱薇;张萍;谢红玲;温文生;吴玉石【作者单位】武汉中博生物股份有限公司,武汉430070;武汉中博生物股份有限公司,武汉430070;武汉中博生物股份有限公司,武汉430070;武汉中博生物股份有限公司,武汉430070;武汉中博生物股份有限公司,武汉430070;武汉中博生物股份有限公司,武汉430070;武汉中博生物股份有限公司,武汉430070;武汉中博生物股份有限公司,武汉430070【正文语种】中文【中图分类】S852.65【相关文献】1.猪札幌病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用 [J], 陈琰;沈权;杨世兴;康雁君;华修国2.猪瘟兔化弱毒疫苗株TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用 [J], 刘大伟;张小飞;胡来根;李郁;尹秀凤;毛火云3.猪δ冠状病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立与初步应用 [J], 郑兰兰;朱静静;王盼;舒燕;梁青青;李炳晓;王超群;魏战勇4.牛冠状病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用 [J], 谭烁;汤承;何琪富;岳华5.猪捷申病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立和初步应用 [J], 秦毅斌;欧阳康;赵武;苏乾莲;赵硕;卢冰霞;何颖;周展宏;袁婷婷;李斌;段群棚因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。