蜂蜜中的氯霉素的测定

液相色谱- 串联质谱法测定蜂蜜中氯霉素残留量的不确定度作者：陈梅斯，练习中，郑丽斯来源：《现代食品》 2018年第23期摘要：本文参照SN/T 1864-2007《进出口动物源食品中氯霉素残留量的检测方法液相色谱- 串联质谱法》中检测方法，采用液相色谱- 串联质谱（LC-MS/MS）法测定蜂蜜中的氯霉素残留量，按照JJF 1135-2005《化学分析测量不确定度的评定》的指导，通过建立数学模型，分析不确定度的来源，对其进行量化，由此确定影响检测结果的主要因素，反映该方法的置信度。

关键词：不确定度；氯霉素；液相色谱- 串联质谱法1 实验部分1.1 主要仪器设备与试剂1.1.1 仪器设备液相色谱- 串联质谱联用仪（API4000，美国AB公司）、液相色谱柱（Shim-pack XR-ODS 3.0 mm×75 mm，2.2 μm)、振荡器（上海南汇横沔厂）、固相萃取装置（AB-1110，美国Abel）、电子天平（JJ-2000B，常熟市双杰测试仪器厂）、旋转蒸发仪（RE-52AA，上海亚荣生化仪器厂）、水浴氮吹仪（WD-12，杭州奥盛仪器有限公司）。

1.1.2 试剂氯霉素标准品、氯霉素-D5 标准品，无水硫酸钠、氯化钠均为分析纯，乙酸乙酯、甲醇为色谱纯。

1.2 测试方法按照SN/T 1864-2007《进出口动物源食品中氯霉素残留量的检测方法液相色谱- 串联质谱法》的规定，本法使用内标法对样品中氯霉素残留量进行定量。

实验操作方法如下：称取5.00 g 蜂蜜试样置于50 mL 具塞离心管中，准确加入0.1 mL 氯霉素-D5（10 ng·mL-1）内标溶液，加15 mL 15% 氯化钠水溶液，加25 mL 乙酸乙酯后振荡提取1 min，离心取上层乙酸乙酯提取液过无水硫酸钠柱，收集于浓缩瓶中，样品残渣中再加入20 mL 乙酸乙酯重复上述操作，合并乙酸乙酯提取液在50 ℃水浴旋转蒸发浓缩至近干，用4 mL 水溶解浓缩物后过C18 固相萃取柱净化，再用10 mL 水分两次洗涤浓缩瓶，洗涤液均过固相萃取柱，经淋洗后，最后用6 mL 甲醇洗脱，洗脱液用氮吹仪浓缩近干后加10 mL50% 甲醇水溶液溶解，过滤膜后上机测定。

蜂蜜中氯霉素残留量的测定方法液相色谱—串联质谱法
新方法学考察报告
依据蜂蜜中氯霉素的测定方法液相色谱—串联质谱法进行以下实验：
1、标准曲线的建立：
精密量取氯霉素标准储备液中间液（0.1µg/ml）适量，用空白样品提取液配制成浓度为 0.5ng/ml、1.0ng/ml、5.0ng/ml、10.0ng/ml、50.0ng/ml、100.0ng/ml 的标准工作液，现配现用。

将标准工作液依次从低浓度到高浓度测定，每一浓度进样3针，按其所得峰面积与对应的对照溶液浓度作标准曲线，得出以下回归方程及相关系数（标准曲线图谱附后）。

表1 氯霉素的回归方程表
氯霉素的回归方程及相关系数表明：在0.5ng/ml～100.0ng/ml的浓度范围内呈现良好的线性关系。

2、回收率实验：
精密称定5g试样，置于50ml离心管中，添加氯霉素标准工作液使浓度为0.10µg/kg、0.20 µg/kg，按实验方法操作测得其回收率。

根据以上实验结果表明在所添加的浓度范围内的回收率为80%～110%，批内批间RSD值均<20％。

3、实验结论：
通过实验得出：按照液相色谱串联质谱法操作可以较好地将蜂蜜中的氯霉素药物提出，标准曲线呈现良好的线性关系，并且准确度、精密度均达到标准规定的要求，实验过程简单、可行，实验结果可靠。

蜂蜜中氯霉素含量标准1. 范围本标准规定了蜂蜜中氯霉素含量的测定方法、限量规定、检验方法、检验规则、标识、标签和说明书的要求，以及包装、运输和贮存的要求。

2. 规范性引用文件本标准引用了下列文件：《食品安全国家标准食品中氯霉素残留量的测定方法》《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》3. 术语和定义本标准采用下列术语和定义：氯霉素：是一种广谱抗菌药物，常用于治疗各种感染性疾病。

蜂蜜（Honey）：是一种天然甜味物质，主要由蜜蜂采集花蜜、花粉等原材料经过发酵、酿造而成。

氯霉素残留量：指在食品中检测到的氯霉素的含量。

4. 氯霉素含量的测定方法本标准采用《食品安全国家标准食品中氯霉素残留量的测定方法》中规定的方法，对蜂蜜中氯霉素含量进行测定。

该方法包括以下步骤：a. 样品处理：称取适量蜂蜜样品，加入适量的乙酸乙酯进行萃取，萃取液经旋转蒸发浓缩至干，用流动相溶解定容。

b. 色谱条件：采用高效液相色谱法，色谱柱为C18柱，流动相为甲醇-水（60:40），流速为1.0 mL/min，检测波长为280 nm，进样体积为20 μL。

c. 标准曲线的制作：分别配制不同浓度的氯霉素标准溶液，进样分析，以峰面积与浓度绘制标准曲线。

d. 样品测定：将处理后的样品进样分析，根据保留时间确定氯霉素的峰，通过峰面积计算样品中氯霉素的含量。

5. 氯霉素含量的限量规定根据《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》的规定，蜂蜜中氯霉素残留量应不得超过0.1μg/kg。

6. 检验方法本标准采用《食品安全国家标准食品中氯霉素残留量的测定方法》所规定的检验方法对蜂蜜中氯霉素含量进行检验。

该方法包括以下步骤：a. 按照4.1.3的规定制备样品溶液。

b. 将样品溶液注入高效液相色谱仪中，按照4.1.4的规定进行色谱分析。

c. 根据保留时间确定氯霉素的峰，通过峰面积计算样品中氯霉素的含量。

d. 根据计算结果与限量规定进行比较，判断样品是否符合要求。

酶联免疫法测定蜂蜜中氯霉素残留量（二）7.1 提取称取2g试样，精确到0.01g，置于25 mL具塞离心管中，加入4 mL水和4 mL(4.2)，在液体混匀器上充分混匀2 min，使试样彻低溶解。

在振荡器上振荡10 min，以4000r/min离心10 min,精确吸取上层1 mL于10 mL具塞试管(5.7)中，用氮气吹干仪在50℃吹干。

加入0.5mL缓冲溶液(4.1.8)溶解残渣，供酶标仪测定。

此溶液含试样量0.5g，稀释系数为1。

7.2 测定条件以下全部操作应在20℃～24℃室温下举行。

7.2.1 酶标仪测定条件：酶标仪测定波长为450 nm。

7.2.2 洗板条件如下： 7.2.2.1 洗板机洗板条件：采纳条式抽干和注满，洗涤次数八次，每次注水量为250uL～350uL。

7.2.2.2 入工洗板条件：洗涤次数五次以上，每次注水量为250 uL。

7.2.3 氯霉素试剂盒中全部试剂的温度均应回升至室温(20℃～24℃)后方可用法。

标准溶液(4.1.2),氯霉素酶标志物溶液(4.1.3)和氯霉素抗体溶液(4.1.4)等均按1份试剂＋10份缓冲溶液举行稀释与制备。

每次测定所用的稀释液均应现配现用。

7.2.4 将测定需用的微孔板备齐并插入微孔架上，记录标准及样品等在微孔架上的位置(模板图)。

7.3 测定测定中吸取不同的试剂和样品溶液时应更换吸头。

7.3.l 分离吸取50uL稀释的酶标志物、氯霉素标准溶液、样品溶液和氯霉素抗体等按模板图位置，依次加入各自的微孔底部，然后，用封口膜密封孔条以防溶液挥发。

持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，于20℃～24℃避光孵育2h。

7.3.2 将微孔架置于洗板机上，按设定的洗板程序洗板后，将微孔架反扣在吸水纸上并反复拍打。

此步骤既要去除微孔中过多的残液，又不能使微孔干燥。

7.3.3 快速加入50uL酶基质和50uL发色剂于微孔底部，然后，持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，于20℃～24℃避光孵育30min。

高效液相色谱-电喷雾多级质谱联用测定蜂产品中氯霉素残留沈崇钰Ξ　丁　涛　陈惠兰(江苏检验检疫局) 摘　要:高效液相色谱联合电喷雾多级质谱(LC/MS n )是一种十分有用的测定痕量兽药残留的方法。

本文介绍了利用LC/MS n方法快速、准确的测定蜂蜜、王浆中氯霉素残留。

前处理方法包括乙酸乙酯提取蜂蜜、王浆中氯霉素,PRS 、C18固相萃取,固相萃取平均回收率达到96%以上。

加标样品平均回收率达到70%～80%,定量下限(LOQ )可以达到0.1μg/kg ,检测下限(LOD )可以达到0.05μg/kg 。

关键词:高效液相色谱;电喷雾质谱;氯霉素;蜂产品1　前言氯霉素(Chloram phenicol ,简称C AP )是一种十分有效的广谱抗生素,自从1950年来,广泛的应用于食用动物的疾病预防和治疗。

由于食品中痕量残留的氯霉素对人体骨髓造血机能有抑制作用,可引起人的粒细胞缺乏病,再生障碍性贫血和溶血性贫血,对人产生致死效应。

1994年欧盟(E U )禁止在一切食用动物养殖中使用氯霉素。

中国出口的蜂产品中,由于含有违禁的氯霉素,2002年1月20日起,欧盟全面禁止中国蜂产品输入。

因此对出口蜂产品中痕量氯霉素的测定,变得十分重要。

测定氯霉素在食品中痕量残留的方法有很多种,包括电化学方法、E LIS A 法、放射性免疫检测法,气相色谱法和液相色谱法。

由于欧盟对在食品中氯霉素痕量残留的检测下限在不断的降低,现在出口的蜂蜜产品中,氯霉素的含量不能超过0.3μg/kg ,上述方法已经难以达到相应的要求。

随着液-质技术的发展和成熟,利用高效液相色谱配合多级质谱技术(LC/MS n )测定痕量氯霉素在蜂产品、家禽肉类产品和海产品中的残留越来越多的被采用。

LC/MS n 一般是利用电喷雾(ESI )或大气压化学(APCI )软电离模式,通过碰撞诱导解离(CI D )产生准分子离子,特征分子离子碎片用离子阱或三重四级杆分离收集。

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速测卡快速检测蜂蜜中的氯霉素操作视频配音稿
准备好物品后即可进行检测操作，首先是样品前处理。

离心管上做好标记，无结晶的蜂蜜样品，直接将其搅拌均匀，称取4g待检蜂蜜，加入2mL纯净水，完全振荡溶解。

加入8mL 乙酸乙酯，振荡5min，静置分层。

转移5mL上层乙酸乙酯于干净离心管中，上层乙酸乙酯不足5mL，可先3000r/min离心5min后取上层乙酸乙酯。

50℃下氮气吹干乙酸乙酯。

也可采用此简易设备。

加入600μL样品稀释液于离心管中，涡旋振荡，直至完全溶解管壁残留，待检。

使用前将试纸条、微孔试剂和待检样本恢复至室温（20℃～25℃）。

将所需微孔试剂置于空微孔板架中。

用移液器移取200μL待检样本于微孔试剂中，缓慢抽吸至检测样品与微孔试剂充分混匀，大约5～6次，使用计时器，开始计时。

室温（20℃～25℃）孵育2min，从试剂桶中取出所需数量的试纸条并插入微孔试剂中，使印有LOGO手柄端向上，另一端向下并充分浸入溶液中，开始计时。

再次室温（20℃～25℃）反应5min。

5min后取出试纸条并在2min内进行结果判读，其他时间判读结果无效。

本检测结果左侧样品为阳性，右侧样品为阴性。

氯霉素是一种常见的抑菌类合成抗生素，曾在动物养殖业广泛使用，但由于人体对氯霉素有严重的不良反应，易引起再生障碍性贫血和溶血性贫血，我国农业部235号公告[1]、193号公告中已明确规定禁止在动物中使用氯霉素[2]，在动物源性食品中氯霉素残留物不得检出。

然而在养蜂过程中，蜂场为避免蜂群感染某些疾病，可能会违规使用这些便宜且治疗效果较好的抗生素，因此蜂蜜中检出氯霉素残留的案例时有发生。

蜂蜜中氯霉素的检测方法很多，主要有气相色谱-质谱（GC-MS）法[3，4]、高效液相色谱（HPLC）法和液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）法[5-7]。

样品前处理方法主要包括溶剂提取、固相萃取法和QuEChERS 方法。

本研究建立了全自动固相萃取-超高效液相色谱串联质谱法测定蜂蜜中氯霉素残留量，取得了比较好的结果。

1　实验部分1.1　试样蜂蜜样品来源：随机抽取10份市售蜂蜜。

1.2　材料与试剂氯霉素标准品、D 5-氯霉素标准品，购于德国Dr.Ehrenstorfer GmbH，纯度＞99.0%；醋酸铵为阿拉丁试剂公司的质谱纯试剂；甲醇、乙酸乙酯均为德国默克公司的色谱纯试剂；浓盐酸为国药集团的优级纯试剂。

氯霉素标准品临用前甲醇稀释至100 ng/mL，D 5-氯霉素标准品临用前甲醇稀释至20 ng/mL。

1.3　仪器与设备Thermo TSQ QUANTIS 液相色谱-三重四极杆串联质谱仪，美国赛默飞；ST 16R 型高速低温离心机，美国赛默飞；PB203-N 电子天平，梅特勒；Fotector Plus 48位全自动固相萃取仪，Reeko 公司；Organomation N-EVAP 112型氮吹仪，美国Organomation；MCS 固相萃取柱（500 mg/6 mL）。

1.4　液相色谱条件ACQUITY UPLC® BEH C 18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）液相色谱柱，柱温：40 ℃；流速：0.3 mL/min；进样体积：3 μL；梯度洗脱程序见表1。

《农产品/食品快速检测技术》课程-微测试一、单选题1、蜂蜜中出现氯霉素是因为（）。

A．氯霉素是蜂蜜的成分，自然存在B．为提高蜂蜜保质期人为添加C．蜂农使用氯霉素处理蜂房防治“幼虫腐烂病”D．为增加蜂蜜甜度人为添加参考答案：C难度：中2、采用本方法快速检测蜂蜜中的氯霉素，约需（）。

A．20 minB．60 minC．90 minD．120 min参考答案：A难度：中3、采用本方法快速检测蜂蜜中的氯霉素，取出试纸条后应在（）min内完成结果判定。

A．1minB．2minC．3minD．4min参考答案：B难度：低二、多选题1、本检测阳性结果的现象为（）？A．T线比C线显色深B．T线和C线显色一样深C．T线比C线显色浅D．T线无显色，C线有显色参考答案： C ；D难度：中三、判断题1、有结晶的蜂蜜样品需要在密闭状态下水浴，但结晶全部融化后搅匀再取样。

参考答案：T难度：低2、本检测中待检样本加入微孔试剂后，不可吹吸，要等待待检样本于微孔试剂自然混匀。

参考答案：F难度：中四、填空题1、该方法中提取氯霉素用到的试剂是。

参考答案：乙酸乙酯难度：中2、本方法检测结果C线不显色，无论T线是否显色，该检测均判为。

参考答案：无效难度：低五、简答题1、简述速测卡快速检测蜂蜜中的氯霉素需要准备哪些物品。

参考答案：天平、蜗旋仪、离心机、氮吹仪、移液器等仪器。

氯霉素快速检测试纸条、氯霉素微孔试剂、样品稀释液、乙酸乙酯等试剂。

难度：中六、综合题1、请设计速测卡快速检测蜂蜜中的氯霉素的检测步骤。

参考答案：1）物品准备，包括仪器及试剂等。

2）样品前处理，包括称量、溶解、浸提、离心分离、挥干溶剂、复溶等。

3）检测操作，包括样品与微孔试剂的混匀，层析。

4）结果判读，明确阴阳性结果的现象。

难度：中。