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细胞培养基本方法细胞培养是研究细胞生物学和生物医学的重要方法之一、它可以提供一种控制环境，使细胞能够在体外生长、分化和繁殖。
细胞培养基本方法包括细胞的分离、培养基的制备、细胞的培养和细胞的传代等。
一、细胞的分离细胞的分离是细胞培养的第一步，主要目的是将组织和器官中的细胞分散为单个细胞，以便于后续的培养。
常用的细胞分离方法有机械分离、酶分离和胶粒分离等。
其中，酶分离是最常用的方法之一，通过酶的作用使细胞间的粘附分子断裂，从而实现细胞的分离。
二、培养基的制备培养基是细胞在体外生长和繁殖所需的营养物质和环境因子的混合物。
培养基的制备包括基本培养基的配制和添加适当的添加剂。
基本培养基主要由无菌的培养基基础及其所需的生长因子、氨基酸、维生素、微量元素、酶和抗生素等组成。
添加剂主要包括胎牛血清、酶抑制剂和缓冲剂等。
根据不同的细胞类型和培养需求，可选择不同的培养基配方以满足特定的培养条件。
三、细胞的培养细胞的培养是将其在无菌条件下放入培养基中，在恒定的温度、湿度和二氧化碳浓度下，利用细胞自身的增殖和分化能力，使细胞在体外生长和繁殖。
培养细胞前需要对细胞进行处理，如选择合适的培养容器和分配密度，以及消毒培养器具等。
之后，将细胞悬浮液加入培养基中，放入恒温培养箱中培养。
培养过程中需要对培养基的温度、pH值和营养物质的浓度等进行控制和调节，以保证细胞的正常生长和繁殖。
四、细胞的传代细胞在培养过程中会不断地增殖和分化，但当细胞达到一定密度或生长状态改变时，需要进行细胞的传代。
细胞的传代是指将已培养的细胞重新分离并接种到新的培养基中，以保持细胞的活性和增殖能力。
传代过程中需要注意细胞的分离方法、传代倍数和传代间隔，避免对细胞产生不良影响。
除了以上基本方法外，细胞培养还包括细胞补充和细胞冻存等技术。
细胞补充是指将培养中的细胞重新接种到新的培养器中，以扩大培养量或维持细胞的活性。
细胞冻存是将培养中的细胞经处理后储存在液氮中，可以长期保存和传递细胞。
细胞培养方法总结细胞培养是生物学研究中重要的实验技术之一，通过在体外人工创造和维持细胞生长环境，使细胞能够持续繁殖、生长和分化。
本文将对常用的细胞培养方法进行总结，并介绍其步骤和注意事项。
一、细胞培养基的配制细胞培养基是细胞生长所必需的营养物质和生长调节因子的混合物，根据细胞类型和实验需求的不同，培养基种类繁多。
在配制培养基时，应按照标准操作流程，确保成分准确无误并避免细菌和真菌的污染。
二、细胞的分离和传代1. 细胞的分离：将细胞从原来的培养皿中取出，并用消化酶、细胞分离酶等方法进行细胞的离散处理，以获得单细胞悬浮液或小团的细胞群。
2. 细胞的培养：将悬浮的细胞或细胞小团转移至新的培养皿中，添加适量的培养基，并静置于恒温培养箱中，创造适宜的生长环境，促进细胞的生长。
3. 细胞的传代：当原始细胞群生长至饱和状态时，需进行细胞的传代，即将部分细胞转移到新的培养皿中，以保持细胞的活力和增长。
传代过程中，注意维持传代比例和规律的同时，避免细胞超密植或过稀。
三、细胞冻存和解冻细胞冻存是将培养好的细胞保存在低温下，以延缓其代谢过程，以备后续使用。
具体步骤包括：1. 预处理：加入冻存保护剂，如二甲基亚砜(DMSO)或甘油，以降低冻存过程对细胞的伤害。
2. 储存管制备：将细胞转移到冻存管中，并标记相关信息，如细胞类型、培养时间等，以方便后续的识别。
3. 冷冻：将装有细胞的冻存管放置在低温环境中，逐渐降温至最终低温储存条件下，一般为液氮温度（-196°C）。
4. 解冻：将冻存管取出，快速置于37°C预热的培养基中解冻，然后将细胞转移至培养皿中，尽快恢复细胞活性。
四、细胞凋亡检测细胞凋亡是指细胞主动发生的自我死亡过程。
为了研究细胞凋亡的发生机制，需对细胞进行凋亡检测。
以下是常用的细胞凋亡检测方法之一：1. Annexin V/PI双染法：利用Annexin V亲和素与磷脂酰丝氨酸的结合，通过荧光检测乙酰胆碱酯酶的失活，以区分早期和晚期凋亡。
细胞实验要点总结引言细胞实验是研究细胞生物学和分子生物学的重要手段之一，通过对细胞的培养、处理和观察，可以深入研究细胞的结构、功能和相互作用。
本文将总结细胞实验中的关键要点，包括细胞培养、细胞处理和细胞观察等方面，以便研究人员在进行细胞实验时能够正确操作并获得可靠的结果。
一、细胞培养细胞培养是细胞实验的基础，良好的细胞培养条件对实验结果的准确性和可重复性起着至关重要的作用。
以下是细胞培养的关键要点：1. 细胞的来源选择在进行细胞实验前，需要选择合适的细胞系。
常用的细胞系有Hela细胞、293T细胞等。
选择细胞系时应考虑细胞特性、来源及适应性等因素。
2. 细胞培养基的选择细胞培养基应选择适合细胞生长和实验需要的培养基，常用的细胞培养基有DMEM、RPMI-1640等。
培养基中应添加适量的培养基补充物，如胎牛血清(FBS)、青年公牛血清等。
3. 培养条件的控制在细胞培养过程中，需要控制好温度、湿度、CO2浓度等条件。
一般细胞培养箱内的温度保持在37摄氏度，湿度保持在95％左右，CO2浓度保持在5％。
4. 无菌操作细胞培养需要在无菌条件下进行。
操作前应做好消毒，并佩戴无菌手套、面罩等防护用品。
培养器具、培养基等都应进行预处理，并确认无菌后使用。
二、细胞处理细胞处理是细胞实验中的关键步骤，包括细胞的处理、转染、感染等。
以下是细胞处理的要点：1. 细胞处理方法选择根据实验的需要，选择合适的细胞处理方法，如细胞刺激、细胞转染、细胞感染等。
不同的方法对细胞的处理方式和处理时间有不同的要求。
2. 转染试剂的优化在进行细胞转染实验时，需要优化转染试剂的浓度和转染条件。
根据实验的需要，选择适当的转染试剂，并进行试剂浓度的调优实验。
3. 细胞处理时间控制在进行细胞处理时，需要控制好处理时间，避免处理时间过长或过短对细胞产生影响。
处理时间应根据实验的需要和细胞的特性来确定，一般根据先前的文献资料或进行预实验来确定最佳处理时间。
细胞生物学实验技巧总结细胞生物学是一门研究细胞结构、功能和生命过程的学科，实验是探索和验证细胞生物学理论的重要手段。
为了更好地进行细胞生物学实验，我们需要掌握一些实验技巧和方法。
本文将总结一些常用的细胞生物学实验技巧，帮助读者更好地开展相关实验。
一、细胞培养技巧1. 细胞选取与分离：在细胞培养实验中，正确选择和分离细胞是非常重要的。
首先，根据实验的要求选择适当的细胞系或原代细胞。
其次，使用无菌技术将细胞转移到培养皿中，并确保培养容器的无菌状态。
2. 培养基的配制：细胞培养基的配制要根据细胞类型和实验要求进行合理的选择。
通常包括基础培养基和补充物。
在配制过程中，要注意严格按照要求添加培养基成分，保证培养基的质量。
3. 细胞培养条件的控制：细胞的生长和繁殖需要特定的环境条件。
在培养细胞的过程中，要注意控制温度、湿度和二氧化碳浓度等参数。
此外，定期更换培养基，并检查细胞的形态和活性。
二、细胞染色技巧1. 原位染色：原位染色是观察细胞形态和分子定位的重要方法。
其中，荧光原位杂交技术（FISH）可以用来检测基因的表达和定位。
使用特定的探针与目标DNA高度特异地结合，然后使用荧光探针显色，利用荧光显微镜观察染色体和核酸分子的位置。
2. 免疫染色：免疫染色是通过特异性抗体与目标分子结合，然后使用荧光标记的二抗进行检测，用于检测蛋白质的定位和表达。
在进行免疫染色时，需要注意选择适当的抗体和染色方法，并进行有效的洗涤步骤，以避免非特异性染色。
三、细胞分离和提取技巧1. 胞内蛋白提取：细胞内的蛋白质提取是许多分子生物学研究的基础。
为了获得高质量的胞内蛋白样品，可以使用细胞裂解缓冲液使细胞破碎，并添加蛋白酶抑制剂来保护蛋白质免受降解。
此外，离心操作可以用来去除细胞碎片和细胞器。
2. DNA/RNA的提取与纯化：DNA/RNA分离是研究基因组和转录组的重要步骤。
对于DNA的提取，可以使用DNA提取试剂盒，按照说明书进行提取和纯化。
生物学考研生物学常见实验技巧总结在生物学考研中，实验技巧是非常重要的一部分。
掌握常见的实验技巧不仅能提高实验效果，还能在解答问题和分析数据过程中起到关键的作用。
本文将对生物学考研中的常见实验技巧进行总结和分析。
一、细胞培养技巧细胞培养是生物学研究中常见的实验方法。
在进行细胞培养时，需要注意以下几个关键步骤和技巧：1. 无菌操作：细胞培养需要在无菌条件下进行，避免细菌和其他微生物的污染。
在进行无菌操作时，需要使用无菌培养皿、试管和培养液，并在无菌工作台下进行操作。
2. 细胞培养基的配制：合理的培养基配制对于细胞的生长和增殖至关重要。
在配制培养基时，需要按照比例将培养基粉末和溶液混合，并通过过滤或高压灭菌的方式确保培养基的无菌性。
3. 细胞的传代和处理：在进行细胞培养时，需要根据细胞的生长情况及时进行传代。
传代过程中，需要将细胞分离、计数，并按照适当的比例用新的培养基进行培养。
二、分子生物学实验技巧分子生物学是生物学研究中常用的实验方法。
在进行分子生物学实验时，需要注意以下几个关键步骤和技巧：1. DNA/RNA的提取：DNA/RNA的提取是进行分子生物学实验的基础步骤。
在提取过程中，需要选择合适的提取试剂盒，并根据试剂盒的说明书进行操作。
提取过程中，需要注意避免DNA/RNA的降解和污染。
2. PCR扩增：PCR是分子生物学中常用的技术，用于扩增DNA片段。
在进行PCR实验时，需要准确配制反应液，合理设计引物和控制实验条件。
此外，还需要避免引物交叉污染和反应管的污染。
3. 凝胶电泳：凝胶电泳是用于分离和鉴定DNA片段的方法。
在进行凝胶电泳实验时，需要准备好适当浓度的琼脂糖凝胶，并将样品按照一定比例加入凝胶槽中。
此外，为了获取更好的电泳图像，还可以添加DNA染料，如溴化乙锭。
三、蛋白质分离与检测技巧蛋白质的分离与检测是生物学研究中常见的实验方法。
在进行蛋白质分离与检测时，需要注意以下几个关键步骤和技巧：1. 蛋白质的提取：蛋白质的提取是进行蛋白质实验的基础步骤。
细胞培养实验总结引言细胞培养是现代生物学研究中常用的实验技术之一，它可以模拟体内环境，为研究细胞的生理生化过程提供便利。
本文对进行的细胞培养实验进行总结，包括实验目的、实验步骤、实验结果及讨论等内容。
实验目的本次实验的主要目的是通过细胞培养技术培养和观察细胞生长情况，了解细胞培养过程中的操作步骤和注意事项。
同时，通过添加不同培养基成分，探究对细胞生长和分化的影响。
实验步骤1.准备实验器材和培养基：将所需的培养基放置在无菌工作台上，同时清洗好所有需要使用的培养器皿和器械，保持无菌状态。
2.细胞传代：将上一代培养的细胞用无菌吸管吸取，移至新的培养器皿中，加入新鲜准备好的培养基。
细胞传代的目的是保持细胞的生长状态和纯度。
3.细胞观察：将培养器皿放置在显微镜下，使用适当倍率进行观察。
检查细胞的生长状况和细胞数量是否符合预期。
4.添加培养基成分：根据实验设计，可以在相应的培养器皿中加入不同的培养基成分，例如细胞分化因子、抗生素等。
目的是观察添加不同成分后细胞的生长和分化变化。
5.细胞采集：当细胞达到一定的生长密度时，可以进行细胞采集。
用无菌吸管吸出细胞悬液，将其置于离心管中，并进行离心处理，获取细胞沉淀。
6.分析实验结果：对培养的细胞进行计数、生长速率分析等统计，观察实验结果是否符合预期。
实验结果根据实验步骤和操作要求，我们成功地进行了细胞培养实验，并获得了一系列实验结果。
首先，观察到细胞在培养基中显示出良好的生长状态。
细胞数量逐渐增多，呈现典型的细胞周期。
观察到细胞的形态变化，细胞逐渐变大，细胞贴壁生长良好。
这说明培养基的成分和培养条件对细胞的生长具有重要影响。
其次，实验中添加了不同的培养基成分，包括细胞分化因子和抗生素。
观察到加入细胞分化因子后，部分细胞呈现出明显的分化现象，形成不同的细胞类型。
而加入抗生素后，观察到细胞数量减少，并且呈现出不同程度的细胞死亡。
这说明细胞分化和细胞存活受到培养基成分的影响。
一、实验目的1. 熟悉细胞培养的基本原理和操作流程。
2. 掌握原代细胞培养和传代细胞培养的方法。
3. 培养无菌操作意识，提高实验技能。
二、实验原理细胞培养是指将生物体中的细胞取出，在人工控制的条件下，使其生长、繁殖或传代的过程。
细胞培养技术在生物学、医学、药物学等领域具有广泛的应用。
本实验主要涉及原代细胞培养和传代细胞培养。
三、实验材料与仪器1. 材料：动物组织块、胎牛血清、DMEM培养基、胰蛋白酶、青霉素、链霉素、DMSO、细胞培养瓶、移液枪、超净工作台、CO2培养箱、显微镜等。
2. 仪器：细胞培养瓶、移液枪、超净工作台、CO2培养箱、显微镜、酒精灯、高压灭菌器等。
四、实验步骤1. 原代细胞培养（1）取动物组织块，用生理盐水清洗，去除杂质。
（2）将组织块放入培养皿中，用眼科剪剪成小块。
（3）将组织块加入含有胰蛋白酶的DMEM培养基中，37℃水浴消化30分钟。
（4）将消化后的组织块用移液枪吹打，使细胞离散成单个细胞。
（5）将细胞悬液转移至培养瓶中，加入胎牛血清，混匀。
（6）将培养瓶放入CO2培养箱中，37℃、5%CO2条件下培养。
2. 传代细胞培养（1）待细胞生长到一定密度时，用移液枪吸出细胞，加入胰蛋白酶消化。
（2）消化后的细胞用移液枪吹打，使细胞离散成单个细胞。
（3）将细胞悬液转移至培养瓶中，加入胎牛血清，混匀。
（4）将培养瓶放入CO2培养箱中，37℃、5%CO2条件下培养。
五、实验结果1. 原代细胞培养：细胞从组织块中离散出来，形成单个细胞，细胞呈圆形或椭圆形，细胞之间相互连接。
2. 传代细胞培养：细胞生长旺盛，细胞密度逐渐增加，细胞形态与原代细胞相似。
六、实验讨论1. 细胞培养过程中，无菌操作至关重要，应严格遵守无菌操作规程。
2. 细胞培养过程中，培养基、胎牛血清、CO2培养箱等条件对细胞生长具有重要影响。
3. 细胞传代过程中，应注意细胞密度，避免细胞过度生长或生长缓慢。
4. 本实验成功培养了原代细胞和传代细胞，为后续实验提供了细胞来源。
细胞培养方法简介细胞培养是一种将细胞从其天然环境中分离出来并在人工培养介质中进行生长的技术。
细胞在体外培养的过程中，可以提供所需的营养物质和适宜的环境条件，以促进其生长和繁殖。
细胞培养在许多生命科学领域中都有着广泛的应用，包括细胞生物学、医学研究和药物开发等。
细胞培养的基本步骤1. 细胞来源：选择适合培养的细胞类型，可以来自动物、植物或微生物等。
2. 细胞分离：将细胞从组织或培养物中分离出来，常用的方法包括酶消化、机械振荡或离心等。
3. 细胞培养基准备：根据细胞类型的需求，配制适宜的培养基，包括营养物质、生长因子和抗生素等。
4. 细胞接种：将分离的细胞接种到培养器具中，如培养皿、培养瓶或培养皿等。
5. 培养条件调节：控制适宜的温度、湿度和二氧化碳浓度等环境条件，以促进细胞生长。
6. 细胞观察和维护：定期观察细胞的生长情况，并补充培养基中所需的营养物质。
7. 细胞传代：当细胞达到一定密度或增殖能力下降时，将细胞进行分离或传代。
8. 细胞收获：当需要的细胞数量达到要求时，收获并进行后续实验或应用。
常用的细胞培养方法1. 单细胞悬浮培养：将细胞悬浮在培养基中，通过摇床或搅拌培养器进行培养。
常用于细胞株的扩增和大规模培养。
2. 基质附着培养：将细胞接种在培养基预涂的培养器具表面，依靠细胞与基质的黏附进行培养。
常用于原代细胞培养和复杂组织的培养。
3. 三维培养：将细胞培养在类似于体内环境的三维结构中，如培养基中的凝胶或支架。
常用于细胞分化、组织工程和肿瘤研究等。
总结细胞培养是一项重要的实验技术，在生命科学领域中有着广泛的应用。
通过掌握基本的细胞培养方法，可以进行细胞生长、繁殖和实验的准确控制，为进一步的研究和应用奠定基础。
在进行细胞培养时，需要注意清洁和无菌操作，以确保培养过程的成功和可靠性。
参考文献：1. Freshney, R. I. (2010). Culture of animal cells: a manual of basic technique. John Wiley & Sons.2. Masters, J. R. (2002). Animal cell culture: a practical approach. Oxford University Press.。
实验室细胞培养的一般步骤细胞培养是一项重要的实验室技术，广泛应用于生命科学研究以及医药产业中。
下面将为您介绍一般的细胞培养步骤，希望能为您提供一些指导意义。
第一步：制备培养基细胞培养的第一步是制备适合细胞生长的培养基。
培养基通常包括营养物质、氨基酸、维生素、生长因子等，可以为细胞提供足够的养分和环境条件。
根据不同的细胞类型和实验目的，制备不同种类和浓度的培养基。
第二步：分离细胞在细胞培养之前，需要将细胞从组织、器官或已有培养物中分离出来。
通常采用酶消化、机械剪切或离心等方法来分离细胞。
分离后，细胞可以在培养基中生长和繁殖。
第三步：细胞接种将分离出的细胞接种到含有培养基的培养皿或培养瓶中。
接种密度要适当，不宜过稀或过密。
同时，需要将培养基中的氧气和二氧化碳平衡，通常使用CO2培养箱来提供适宜的气体环境。
第四步：细胞培养经过接种后，细胞开始在培养基中生长和分裂。
在培养过程中，需要控制细胞的温度、湿度和pH值，保持适宜的生长条件。
此外，定期更换新鲜的培养基可以提供足够的营养物质，维持细胞的正常生长。
第五步：细胞检测和观察细胞培养的过程中，需要定期对细胞进行检测和观察。
包括细胞数量的计数、形态的观察和生长曲线的绘制等。
通过这些检测和观察，可以了解细胞的健康状态、增殖速率以及其他相关参数。
第六步：细胞应用或冻存根据研究或实验的需要，可以选择将细胞用于进一步的实验、传代培养或冻存保存。
冻存细胞需要使用适当的冻存液，将细胞缓慢冷冻并存放在液氮罐中，以便长期保存。
细胞培养是一项需要耐心和细心的工作，每一步都需要严格控制条件和遵循操作规范。
只有如此，才能获得可靠的实验结果和高质量的细胞培养。
希望本文能为您提供参考，更好地开展细胞培养工作。
细胞培养方法细胞培养是生物学实验中常用的一项技术，它可以使细胞在人工环境中生长、繁殖和维持其生理功能。
细胞培养方法的选择对于细胞的生长和实验结果至关重要。
下面将介绍一些常用的细胞培养方法。
1. 细胞培养基的选择。
细胞培养基是细胞培养的基础，不同类型的细胞需要不同种类的培养基。
常见的培养基包括DMEM、RPMI-1640、MEM等，选择合适的培养基对于细胞的生长和实验结果至关重要。
2. 细胞传代。
细胞在培养过程中会不断增殖，当细胞密度达到一定程度时需要进行传代。
传代的目的是保持细胞的生长状态，避免细胞过度密集导致细胞死亡。
传代的方法包括胰蛋白酶消化、离心、重新接种等步骤。
3. 细胞培养的条件控制。
细胞在培养过程中需要适宜的环境条件，包括温度、湿度、CO2浓度等。
通常情况下，细胞培养箱是细胞培养的最佳环境，它能够提供恒定的温度、湿度和CO2浓度。
4. 消毒和无菌操作。
在细胞培养过程中，消毒和无菌操作至关重要。
细胞培养器皿、培养基、工具等都需要进行严格的消毒处理，以避免细菌和真菌的污染对细胞培养的影响。
5. 细胞培养的细胞密度控制。
细胞密度的控制对于细胞培养至关重要。
过高的细胞密度会导致细胞之间的竞争和相互抑制，从而影响细胞的生长和实验结果。
因此，需要根据细胞类型和实验要求来控制细胞的密度。
6. 细胞培养的细胞凋亡检测。
在细胞培养过程中，细胞凋亡是一个常见的现象。
因此，需要对细胞进行凋亡检测，以保证实验结果的准确性。
常用的凋亡检测方法包括Annexin V/PI双染和TUNEL染色等。
7. 细胞培养的细胞培养器具和试剂的选择。
在进行细胞培养实验时，选择合适的细胞培养器具和试剂也是非常重要的。
比如细胞培养皿、细胞培养瓶、移液器、吸头等实验器具，以及培养基、胰蛋白酶、抗生素等试剂的选择都会直接影响到细胞培养的效果。
综上所述，细胞培养是生物学实验中不可或缺的一项技术，选择合适的培养基、控制细胞密度、细胞凋亡检测等都是保证细胞培养效果的关键。
实验总结细胞培养方法公司内部档案编码：[OPPTR-OPPT28-OPPTL98-OPPNN08]一、培养细胞常用配置培养基的配置：基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml冻存液的配置：10 % DMSO + 90%胎牛血清依次比例酌量配置。
超净工作台常规配置移液器1套（2.5μl、20μl、200μl、1ml），酒精灯1盏，液器1台，斜架1台，酒精喷壶1个，酒精棉球缸1个，污缸1个，常规耗材：培养瓶（50㎝2），定量移液管（5ml、10ml），枪头（1ml、200μl、10μl），培养皿，6/24/48/96孔板，医用脱脂棉球，冻存管所需试剂：培养基，胎牛血清，双抗，DMSO，胰酶，75%酒精……实验前准备：所需的各项高压后的耗材及污物缸放于超净工作台内，用酒精喷壶喷洒实验台面，并关闭工作台打开紫外灯照射30min后开始实验操作。
培养基及胰酶恢复常温后使用，可37℃水浴5-10min二、细胞复苏步骤：1. 紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。
2. 培养液（DMEM），恒温水浴箱37℃预热20min，备用。
超净台内准备一支15ml离心管备用。
3.将所需的培养基确保瓶身干净后酒精消毒放于工作台面内，点燃酒精灯，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后需再次分别消毒瓶口和瓶盖。
4. 从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入37℃水浴中，快速摇晃，直至冻存液融化至黄豆粒大小后迅速取出。
5. 将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入4ml培养液，离心（1000r/min，5min）。
6. 取出2个培养皿并做好标记（复苏日期等），提前加入5-10ml培养液；离心结束后用1ml培养液悬液混悬沉淀细胞后分别加入培养皿内。
7. 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。
8. 将培养瓶放入培养箱内培养注意事项：1. 取细胞的过程中注意带好防冻手套。
此项尤为重要，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。
2. 冻存液的问题：冻存液的配置已是常识，在这里不作详述，但二甲基亚砜（DMSO）对细胞不是完全无毒副作用，在常温下，二甲基亚砜对细胞的毒副作用较大，因此，必须在1-2min内使冻存液完全融化。
如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤，二甲基亚砜（DMSO）最好选择进口产品。
3. 离心前须加入少量培养液。
细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤。
4. 离心问题：目前主要有两种见解。
一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液。
因为离心的目的是两个，去除 DMSO，去除死细胞，这个是标准流程，但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转的不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大，死亡。
此外在操作过程中容易污染，所以不推荐。
另一种说法为细胞悬液中含有二甲基亚砜（DMSO），DMSO对细胞有一定的毒副作用，所以须将离心后的液体前倒净，且一定倒干净。
5. 冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml－15m培养液6. 复苏细胞分装的问题：复苏1管细胞一般可分装到2-3只培养皿中，分装过多，细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。
7. 加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度，从如果你加培养基的太少，那么DMSO的浓度就会比较大，就会影响细胞生长，从以前的资料来看，DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响，还有一个说法是1％。
所以如果你的冻存液的浓度是 10％DMSO的话那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度8. 原理：在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。
如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。
在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。
贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。
细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。
目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。
三、培养液的更换1. 紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。
2. 培养液（DMEM），恒温水浴箱37℃预热20min，备用。
3. 将所需的培养基确保瓶身干净后酒精消毒放于工作台面内，点燃酒精灯，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖。
4. 将培养皿盖内口朝上放在架子上，将培养皿内的培养液悬空倒进污缸5．拿出1支高压后的5ml定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于移液器上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3次，悬空进入培养基瓶内吸取5-10ml培养基再悬空移入培养皿内，将培养皿盖在酒精灯上消毒2-3次后盖上。
6. 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。
7. 将培养瓶放入培养箱内培养每天定时观察细胞生长情况，一般72-96h后，细胞生长密度大于90%，即可进行细胞的传代。
四、细胞传代1. 紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。
2. 培养液，胰酶，恒温水浴箱37℃预热20min，备用。
3. 将所需的培养基，胰酶确保瓶身干净消毒后放于工作台面内，点燃酒精灯，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。
4. 将培养皿盖内口朝上放在架子上，将培养皿内的培养液悬空倒进污缸。
取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取1-2ml胰酶液，悬空沿皿壁加入培养皿内。
5. 将培养皿来回倾倒使胰酶浸没整个皿底的细胞层，计时越1-3min（消化时间根据细胞不同时间不同），对着灯光可观察到细胞与细胞之间有针孔样缝隙，并有1-2个细胞脱落，镜下观察到细胞都变圆时为胰酶消化的最适时机。
（若看到成片的细胞从瓶壁脱落为胰酶消化过度；若看不到针孔样缝隙和细胞脱落，或镜下细胞多有菱角则需继续消化）。
用移液器将胰酶吸净。
6. 吸取1ml培养基于培养皿内，并用移液器吸取少量的培养基轻柔的反复冲洗培养瓶壁5-8次，使贴壁细胞完全脱落于培养基内再轻轻吹打2-3次，使细胞尽可能处于单个悬浮状态。
7. 取1或2个新的培养皿，然后将细胞培养基均匀的分到2或3个培养瓶内（注意原来传代时使用的培养瓶可继续传代使用），进行1传2或1传3的培养。
8. 拿出1支高压后的5ml定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于移液器上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3次，悬空进入培养基皿内吸取5-10ml培养基悬空移入每个培养皿内，将培养皿盖在酒精灯上消毒2-3次盖上，在皿盖上做好实验标记。
9. 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。
10. 将培养瓶放入培养箱内培养。
注意整个培养箱底托盘内一定要放高压后的水，且定期更换确保无菌。
每天定时观察细胞生长情况，一般72-96h后，细胞生长密度大于90%，即可进行细胞的传代或保株。
五、细胞株的保存原理：细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。
细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。
如细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。
胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。
如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。
因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。
采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。
慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。
实验步骤：选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好换液。
将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。
适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。
用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。
悬浮生产细胞则不要消化处理。
然后将细胞收集于离心管中离心(1000r/min，10分钟)。
加入冻存管中，再加入1ml配置好的冻存液后放入梯度降温盒，放入-80℃冰箱中。
1. 紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。
2. 培养液，胰酶，二甲基亚砜DMSO，胎牛血清（解冻），梯度降温盒恢复常温，恒温水浴箱37℃预热20min，备用。
3. 将所需的培养基，胰酶确保瓶身干净消毒后放于工作台面内，点燃酒精灯，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。
4. 将培养瓶瓶口在酒精灯上消毒2-3次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3次，盖放于酒精灯右侧后将培养瓶内的培养液悬空倒进污缸，在酒精灯消毒2-3次瓶口，竖直放好。
取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取1.5ml胰酶液，悬空移入培养瓶内。
5. 将培养皿盖内口朝上放在架子上，将培养皿内的培养液悬空倒进污缸。
取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取1-2ml胰酶液，悬空沿皿壁加入培养皿内。
6. 将培养皿来回倾倒使胰酶浸没整个皿底的细胞层，计时越1-3min（消化时间根据细胞不同时间不同），对着灯光可观察到细胞与细胞之间有针孔样缝隙，并有1-2个细胞脱落，镜下观察到细胞都变圆时为胰酶消化的最适时机。
（若看到成片的细胞从瓶壁脱落为胰酶消化过度；若看不到针孔样缝隙和细胞脱落，或镜下细胞多有菱角则需继续消化）。
用移液器将胰酶吸净。
6. 吸取1ml培养基于培养皿，并用移液器吸取少量的培养基轻柔的反复冲洗培养瓶壁5-8次，使贴壁细胞完全脱落于培养基内再轻轻吹打2-3次，使细胞尽可能处于单个悬浮状态。
7. 将悬浮细胞吸入15ml离心管内，加入4ml培养基离心1000r/min，5min8. 预先配制冻存液：10 % DMSO + 90%胎牛血清。
