基质金属蛋白酶—7的基因克隆和原核表达作者：刘继科等来源：《安徽农学通报》2013年第07期摘要：研究构建人基质金属蛋白酶7（MMP-7）的原核表达载体，并进行原核表达获得重组蛋白MMP-7。
以人肾肿瘤组织总RNA为模板，PCR方法获得MMP-7成熟蛋白的基因序列，构建含10xhis标签的原核表达载体，转化大肠杆菌BL21（DE3），并经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达，获得重组蛋白，并经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），检测其表达情况。
最终得到pET24a（+）-MMP-7-10his重组质粒，诱导表达后重组蛋白占总蛋白的41%左右，获得21.2kD大小蛋白，与目的蛋白大小一致，纯度大于90%，为进一步研究奠定基础。
关键词：基质金属蛋白酶-7；基因克隆；原核表达中图分类号 Q55 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2013）07-31-04基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一类依赖Zn2+的参与ECM降解的蛋白水解酶，可降解基底膜和细胞外基质（extracellar matrix， ECM）的大多数蛋白质，并参与调节ECM动态平衡，是维持ECM稳态最重要的一类酶，其与机体许多病理过程密切相关[1-2]。
在血管形成、炎症、风湿活动、胚胎发生、纤维化及肿瘤侵袭转移等生物体内的生理及病理过程中的研究显示，这些生理及病理过程中伴随有MMPs的表达量上升[3-7]。
自1962年，Gross和Lapiere在蝌蚪尾巴组织发现间质胶原酶（即MMP-1）[8]，其后陆续发现的MMPs被依次按发现时间顺序命名，至今至少已发现人源MMP23种，包括胶原酶、明胶酶、基质降解素、膜型MMPs和其他共五大类。
其中基质金属蛋白酶7（MMP-7）属基质溶解素（Matrilysin），与肿瘤发生、细胞凋亡和血管形成等病理过程联系密切[9]，是近年来的研究热点。
本研究利用基因工程技术，通过基因克隆，构建基质金属蛋白酶7成熟蛋白原核表达载体，并进行原核表达以获得高纯度重组蛋白，可以为进一步研究MMP及各种机体的病理相关性提供基础。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌种与质粒载体pET24a（+），菌株E.coli DH5a和BL21（DE3）均为本实验室保存。
1.1.2 主要试剂人肾肿瘤组织总RNA购自Biochain，内切酶Nde I、BamH I、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶以及T载体pMD18-T simple购自TaKaRa公司，反转录第一链cDNA合成试剂盒购自罗氏，引物合成和测序由英骏生物技术有限公司提供，其他试剂均为进口或国产分析纯。
1.2 方法1.2.1 MMP-7基因克隆根据GeneBank中MMP-7成熟蛋白的基因编码序列信息，采用软件Primer Premier5设计引物S1/A1（引物序列见表1）。
以人肾肿瘤组织总RNA为模板，按罗氏的反转录第一链cDNA合成试剂盒说明进行反转录实验，合成cDNA，并以其为模板扩增目的基因。
RT-PCR程序为：65℃，10min、55℃，30min、85℃，5min。
PCR程序为：94℃预变性5min；以94℃，30s、52℃，30s、72℃，1min为循环条件，30个循环；72℃，10min。
1%凝胶电泳鉴定条带大小，应为519bp，PCR鉴定为阳性的话，纯化回收PCR产物，连接到pMD18-T simple载体中得到pMD-MMP-7质粒，转化到E.coli DH5a克隆菌株中，提取转化质粒，PCR鉴定，结果为阳性后送测序。
1.2.2 pET24a（+）-MMP-7-10his原核表达载体的构建设计引物A2/A3和引物S2（引物序列见表1），上游引物S2的5’端携带Nde I酶切位点，下游引物A3的5’端引物携带BamH I 酶切位点，和编码10xhis标签和两个终止密码子的序列。
以pMD-MMP-7质粒为模板，S2/A2为引物进行PCR应得到551bp片段，再将其纯化后作为模板，以S2/A3为引物进行PCR应得到578bp片段。
1%凝胶电泳鉴定条带大小，应为578bp，PCR鉴定为阳性的话，纯化回收PCR产物，连接到pMD18-T simple载体中，转化到E.coli DH5a克隆菌株中，提取转化质粒，PCR鉴定，结果为阳性后送测序。
PCR程序分别为：94℃预变性5min；以94℃，30s、55℃，30s、72℃，1min为循环条件，30个循环；72℃，10min。
94℃预变性5min；以94℃，30s、60℃，30s、72℃，1min为循环条件，30个循环；72℃，10min。
用Nde I和BamH I分别酶切MMP-7的578bp目的片段和pET24a（+）表达载体，产物凝胶纯化回收，用T4连接酶做连接反应，得到pET24a（+）-MMP-7-10his原核表达载体，将其转化E.coli DH5a菌株，提取转化质粒，PCR鉴定，结果为阳性后送测序。
原核表达载体pET24a（+）-MMP-7-10his的构建如图1所示。
1.2.3 pET24a（+）-MMP-7-10his/BL21（DE3）重组表达菌的构建及鉴定将测序结果正确的阳性重组质粒pET24a（+）-MMP-7-10his转化E.coli BL21（DE3）感受态，得到重组表达菌pET24a（+）-MMP-7-10his/BL21（DE3），将转化的重组表达菌株pET24a（+）-MMP-7-10his/BL21（DE3）涂固体培养平板（卡那抗性），37℃培养过夜，挑5个单克隆，分别接种到5mL TB液体培养基（卡那抗性），37℃，250rpm/min条件下培养6h，使菌液OD600=0.6～0.8，加入IPTG诱导剂至终浓度为0.4mmol/L诱导，37℃，200rpm/min条件下培养4h，4℃，6 000rpm/min离心5min，收集菌体，菌体加入2×SDS上样缓冲液，煮沸10min，15%SDS-PAGE检测各菌株表达情况。
1.2.4 MMP-7蛋白诱导表达、可溶性分析活化高表达菌株，按1：50转接到10mL TB液体培养基中（卡那抗性），摇床培养2h，加入IPTG至终浓度0.4mmol/L，在37℃条件下，250rpm/min培养4h，诱导目的蛋白的表达。
取1mL表达菌液，12 000rpm，5min离心，收集菌体，PBS洗涤两次后，1mL PBS重悬，做冰浴超声3min（200W，超声5s，间歇5s），破碎细胞，澄清液于4℃、12 000rpm/min离心5min，SDS-PAGE电泳分析上清和沉淀。
2 结果与分析2.1 MMP-7基因克隆与重组表达载体构建以人肾总RNA为模板反转录后，PCR获得目的基因片段，此研究中分别以S1/A1、S2/A2和S2/A3为引物经多次PCR，最终得到的PCR产物片段为578bp，与预测大小一致，包含测序正确的MMP-7基因序列，以及设计的10xhis标签序列，经双酶切后连接构建正确的重组表达载体pET24a（+）-MMP-7-10his，PCR及测序结果显示其构建正确（图1、2）。
测序结果如图4，其中下划线序列为酶切位点序列，粗体部分为10xHis序列及双终止子，方框内为载体序列，其余序列是MMP7序列，与目标序列完全重合。
2.2 重组表达菌的构建及鉴定表达菌株的表达量可能存在差异，所以在表达时，选取高表达菌株有利于后面的表达。
阳性克隆转化BL21（DE3）后涂卡那抗性抗性平板筛选，挑5个克隆与液体抗性培养基诱导表达，并经15%SDS-PAGE检测各菌株重组蛋白表达显示，结果显示，各菌株在预期蛋白大小带处均有表达，且其菌株表达量大致相当（图5）。
2.3 MMP-7蛋白诱导表达、可溶性分析菌株经液体抗性培养基诱导表达，取菌液离心，收集菌体，破碎细胞，澄清液离心后，SDS-PAGE电泳分析上清和沉淀以鉴定MMP-7蛋白表达和得到可溶性分析结果。
结果显示诱导表达后重组蛋白占总蛋白的41%左右，获得21.2kD大小蛋白，与目的蛋白大小一致，纯度大于90%，为进一步研究奠定基础（图6）。
3 讨论基质金属蛋白酶广泛参与机体的生理病理过程，尤其是关于基质金属蛋白酶与各类肿瘤发生及演变的关系的研究显示，在肿瘤发生演变过程中，往往伴随基质金属蛋白酶的过量表达并参与肿瘤侵袭转移等演变进程。
而基质金属蛋白酶抑制剂的研究显示其具有抗肿瘤、治疗心血管疾病、治疗炎症等生物活性。
其中在抗肿瘤领域，相对于细胞毒试剂治疗等传统方法，以基质金属蛋白酶为药物靶点，选择其拮抗药物成为新型的理想抗肿瘤方法。
原核表达系统具有操作简单、表达量高、成本低等优点，构建重组蛋白原核表达载体，利用原核表达系统表达，可快速获得较大量的重组蛋白。
本研究采用原核表达系统，同时为了更有利于后期的纯化，通过引物设计，在表达载体中设计加入10xhis序列和双终止子序列，10xhis序列的加入使得重组蛋白带有高亲和标签，有利于蛋白纯化，且标签分子量小，对蛋白结构功能影响小，而加入的双终止子序列则保证在加入标签时MMP-7重组蛋白更接近原始大小，利于后期的研究，最终经高表达的原核表达后，获得了高蛋白表达量和高纯度的重组人MMP-7蛋白。
但原核表达也存在表达蛋白易以包涵体形式存在的缺点，本研究表达的MMP-7重组蛋白即为包涵体，笔者尝试多次复性，均不是很理想，有待于进一步的研究。
本研究有利于MMP-7和各种机体病理相关性的进一步研究，而MMP及其抑制剂的研究也日趋热门，相信随着相关研究的不断深入，人们将在肿瘤生物学和肿瘤治疗等一些方面做出更大的成就。
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