临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法讲解学习

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样本采集及保存

临床PCR检验标本的采集、处理、保存及核酸提取方法
江西省肿瘤医院陈文学
检验误差的发生率

1997年，一位意大利著名检验专家对急诊检验误差发生的种类和发生率进行了统计。结果显示，约有68.2%的检验误差发生在检验前期，而来自检验中期和检验后期的误差率分别为 13.3%和18.5%。 2007年，这位专家又进行了类似的统计，结果显示，检验前期的误差发生率仍高达61.9%
痰

痰属于分泌物,临床上常用作为结核杆菌DNA测定标本。痰标本中含有大量粘蛋白和杂质,故在核酸提取时, 需对样本进行初步处理，即用1 mol/L NaOH或变性剂液化。如用于非结核杆菌如肺炎支原体的PCR检测，痰标本只能室温悬浮于生理盐水中，充分振荡混匀，促使大块粘状物下沉，取上清离心，所得到的沉淀物即可用于核酸提取。液化标本如不立即用于核酸提取,可保存于-70℃ 下。
去除或减轻抑制的一些方法

加入0.6% (wt/vol)牛血清白蛋白（BSA）可降低血液对Taq DNA聚合酶的抑制效应，既使在2%（vol/vol）血液存在下亦可成功扩增，而通常血液含量只能是0.2%。 BSA也可增加Taq DNA聚合酶的扩增能力，使其对粪便和肉类标本中抑制物的抵抗能力分别提高10和20倍。单链DNA结合T4基因32蛋白（gp32）有类似BSA的增强效应。

临床标本的滤纸上保存

临床标本置于经过处理的滤纸片上，如靶核酸为DNA，可室温保存数月至数年，如靶核酸为 RNA，则可稳定数周。保存在滤纸上的标本，保存时间长，还可因为标本中的PCR抑制物如血红蛋白、酶、免疫球蛋白等吸附于滤纸上，而不对后面的扩增检测造成影响。不管是全血、血清（浆）。还是尿液、粪便、分泌物等均可此种方法。

临床基因扩增检验标本的处理、保存和核酸提取方法及质量控制3讲述

RNA 检测：及时分离血浆，置于无RNase 的离心管中送检 EBV-DNA检测（小心使用）：小心分离LC，避免混入RBC
标本采集
其他体液（TB/EBV-DNA等病原）
痰：深部痰液，不是唾液胸腹水：无菌抽取，加抗凝剂尿液：尿道口消毒，中段尿鼻咽部：咽后壁分泌物EBV-DNA
分泌物（CT/UU/HPV-DNA等病原）
的整个提取操作过程中,都应戴一次性手套。在RNA提取实验中，应勤换手套。
RNA提取的常用方法
表面活性剂加蛋白酶K，氯仿-酚抽提法。胍盐提取结合氯仿-酚抽提法。胍盐提取结合玻璃粉、二氧化硅等颗粒悬浮吸附法等。
核酸提取的改良方法
旋转离心柱（SPIN COLUMN）方法玻璃粉吸附法二氧化硅（Se）或硅藻吸附法微量全血核酸提取法：NaI 方法其它方法：疏水性Immobilon-P膜、全自动核酸纯
去除或减轻抑制的一些方法
加入0.6% (wt/vol)牛血清白蛋白（BSA）可降低血液对Taq DNA聚合酶的抑制效应，既使在2%（vol/vol）血液存在下亦可成功扩增，而通常血液含量只能是0.2%。
BSA也可增加rTth或Taq DNA聚合酶的扩增能力，使其对粪便和肉类标本中抑制物的抵抗能力分别提高10和20倍。
血红蛋白
1%(V/V)血液可完全抑制Taq酶活性，与Mg2+浓度无关。Tth聚合酶在含4%（V/V）血液的PCR反应混合液中可以进行扩增，加入1U单链 DNA结合蛋白——T4基因32蛋白(gp32)，Tth聚合酶在含8%（V/V）血液情况下，仍可扩增。因此，使用Tth聚合酶和gp32蛋白，可实现从临床标本不提取纯化核酸直接扩增靶DNA。
单链DNA结合T4基因32蛋白（gp32）有类似BSA的增强效应。

临床PCR检验标本的采集、处理、保存及核酸提取方法共66页

临床PCR检验标本的采集、处理、保存及核酸提取方法
11、获得的成功越大，就越令人高兴。野心是使人勤奋的原因，节制使人枯萎。 12、不问收获，只问耕耘。如同种树，先有根茎，再有枝叶，尔后花实，好好劳动，不要想太多，那样只会使人胆孝懒惰，因为不实践，甚至不接触社会，难道你是野人。(名言网) 13、不怕，不悔(虽然只有四个字，但常看常新。 14、我在心里默默地为每一个人祝福。我爱自己，我用清洁与节制来珍惜我的身体，我用智慧和知识充实我的头脑。 15、这世上的一切都借希望而完成。农夫不会播下一粒玉米，如果他不曾希望它长成种籽；单身汉不会娶妻，如果他不曾希望有小孩；商人或手艺人不会工作，如果他不曾希望因此而有收益。在哪里。——西班牙
37、我们唯一不会改正的缺点是软弱。——拉罗什福科
xiexie! 38、我这个人走得很慢，但是我从不后退。——亚伯拉罕·林肯
39、勿问成功的秘诀为何，且尽全力做你应该做的事吧。——美华纳
40、学而不思则罔，思而不学则殆。——孔子

临床PCR检验标本采集、处理、保存及核酸提取方法PPT66页

26、要使整个人生都过得舒适、愉快，这是不可能的，因为人类必须具备一种能应付逆境的态度。——卢梭
▪
27、只有把抱怨环境的心情，化为上进的力量，才是成功的保证。——罗曼·罗兰
▪
28、知之者不如好之者，好之者不如乐之者。——孔子
▪
29、勇猛、大胆和坚定的决心能够抵得上武器的精良。——达·芬奇
▪
30、意志是一个强壮的盲人，倚靠在明眼的跛子肩上。——叔本华
临床PCR检验标本采集、处理、保存及核酸提取方法
31、园日涉以成趣，门虽设而常关。 32、鼓腹无所思。朝起暮归眠。 33、倾壶绝余沥，窥灶不见烟。
34、春秋满四泽，夏云多奇峰，秋月扬明辉，冬岭秀孤松。 35、丈夫志四海，我愿不知老。
▪
谢谢！
66

5-临床标本采集、保存及核酸的提取-唐翠燕

• 总之，标本的收集及适当的预处理，对用于PCR测定的核酸模板的成功提取，具有
决定作用。
二、核酸的提取
• 待检样品中的核酸是PCR反应的模板，由于PCR具有高度的特异性和敏感性，一些样品甚至简单到不需要任何处理便可用于 PCR。但是在大多数的情况下，还是需要对样品作适当的处理才能用于PCR。
• 下列试剂是制备RNA的常规试剂:
• 裂解液：4mol/L GuSCN，25mmol/L柠檬酸钠pH7.0，0.5%Sarkosyl， 100mmol/Lβ-巯基乙醇（用前加入）
• 饱和酚：氯仿：异戊醇（50：49：1）
• 3mol/L NaAc pH5.2 • 无水乙醇 • 75%乙醇 • DEPC处理的无菌去离子水 • RNAasin(RNA酶抑制剂)
钟，待大块状物下沉后，取上清立即离心，其后的沉淀即可用于DNA提取。如不立即用于核酸提取，则需保存于-20℃下。
• 2.4 脓液
• 脓液的处理依情况而定，如用于分枝杆菌（如结核杆菌）核酸测定的标本，粘稠的脓液同痰标本的处理模式，先进行液化，再离心取沉淀提取DNA；水样的脓液则直接离心，沉淀用生理盐水洗2～3次后，即可用于DNA提取。
• 2.2 痰
• 痰属于分泌物，临床上常用作结核杆菌 DNA测定样本，由于痰中含有大量粘蛋白和杂质，故在核酸提取时，需对样本进行初步处理，用4%NaOH液化，需注意的是，液化时不能加热，液化时间不能过长。
• 液化标本如不立即用于核酸提取，可保存于-20℃下。此外，对用于非结核杆菌如肺炎支原体的PCR检测，痰标本只能室温悬浮于生理盐水中，充分振荡混匀，促使大块粘状物下沉，取上清离心，所得到的沉
5
• 2.3 75%乙醇漂洗DNA，是为了去除残余的盐类，去除过量SDS和酚等杂物，因为 SDS在75%的乙醇中保持溶解状态，不与 DNA共沉淀，从而通过弃上清液去除这种去污剂,避免对以后PCR反应的影响。

PCR核酸检测样本采集、送检、处理流程学习资料

PCR核酸检测样本采集、送检、处理流
程学习资料
一、样本采集
* 样本采集前需洗手并佩戴口罩、手套等个人防护用品。

* 使用无菌棉签或吸管采集鼻腔或咽喉部分泌物样本。

对于深
部呼吸道样本，采用支气管肺泡灌洗液或痰液。

* 确保样本采集工具和无污染，且采集过程要避免空气污染。

* 将采集的样本及时放入适当的中，并密闭保存。

二、样本送检
* 样本采集完毕后，尽快送往PCR实验室进行检测。

* 在运输中需遵循安全规定，确保样本不泄漏、不变质。

* 样本上需标注采集时间、日期等信息，确保溯源和易于处理。

三、样本处理
* 样本到达实验室后，应尽快进行处理，以保持样本的可靠性。

* 样本处理前，检查样本是否完整，并对样本进行初步质检，
确保样本质量可靠。

* 样本处理过程中要确保操作环境无菌、无污染。

* 根据PCR实验方案，提取样本中的核酸。

* 根据真实样本的情况，可以进行一定的前处理，如样本离心、去除杂质等。

四、流程总结
PCR核酸检测的样本采集、送检、处理流程是一个关键的环节，对结果的准确性和可靠性具有重要影响。

在每个操作环节中都要严
格遵守操作规程，确保样本的采集、送检和处理过程都符合相关要求。

这样才能有效预防污染，提高检测水平。

临床PCR检验标本的采集、处理、保存及核酸提取方法

过晚都可能会出现假阴性结果）
标本采集部位的准备（适度消毒）标本的类型和采集量（衣原体上皮细胞）采样质量的评价（评价方法：肉眼观察、显微镜下观察和化
学分析）

采样及运输容器（一次性无菌器材,防腐剂,抗凝剂）标本采集中的防污染（一次性无菌容器，防止混入操作
者头发，表皮等，如玻璃容器要高压灭菌）
临床PCR检验标本的采集、处理、保存及核酸提取方法
江西省肿瘤医院陈文学
检验误差的发生率

1997年，一位意大利著名检验专家对急诊检验误差发生的种类和发生率进行了统计。结果显示，约有68.2%的检验误差发生在检验前期，而来自检验中期和检验后期的误差率分别为 13.3%和18.5%。 2007年，这位专家又进行了类似的统计，结果显示，检验前期的误差发生率仍高达61.9%

试剂准备 ①裂解液：50 mmol/L Tris-HCl， 10 mmol/L EDTA, 2% Triton X-100, 4 mol/L 异硫氰酸胍盐（GITC）, 0.3 mol/L 醋酸钠。 ②玻璃珠：（直径：425-600um）
乳汁标本离心6000rpm，5min，弃上清脂质和沉淀用750ul裂解液重悬重悬液移入含100mg玻璃珠离心管搅拌煮沸5min，离心14000rpm，3min 650ul上清转移到另一离心管中，等体积异丙醇沉淀
IgG
IgG的抑制作用是由于其与单链DNA
的相互作用，使得靶DNA不能与DNA 聚合酶相互作用
使用煮沸作为标本处理方法或使用
PCR前的热启动,将增强IgG对PCR反应的抑制
去除或减轻抑制的一些方法
NaOH处理可中和临床标本中的Taq
DNA聚合酶抑制剂，但这种方法不适用于DNA含量低的标本，因为NaOH处理可使DNA大量丢失。

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临床PCBiblioteka 检验标本的采集处理保存及核酸提取方法
16、自己选择的路、跪着也要把它走完。 17、一般情况下)不想三年以后的事，只想现在的事。现在有成就，以后才能更辉煌。
18、敢于向黑暗宣战的人，心里必须充满光明。 19、学习的关键--重复。
20、懦弱的人只会裹足不前，莽撞的人只能引为烧身，只有真正勇敢的人才能所向披靡。
31、只有永远躺在泥坑里的人，才不会再掉进坑里。——黑格尔 32、希望的灯一旦熄灭，生活刹那间变成了一片黑暗。——普列姆昌德 33、希望是人生的乳母。——科策布 34、形成天才的决定因素应该是勤奋。——郭沫若 35、学到很多东西的诀窍，就是一下子不要学很多。——洛克

临床PCR检验标本的处理、保存及核酸提取方法共59页

拉
60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地走到底，决不回头。 ——左
45、法律的制定是为了保证每一个人自由发挥自己的才能，而不是为了束缚他的才能。—— 罗伯斯庇尔
Hale Waihona Puke 56、书不仅是生活，而且是现在、过去和未来文化生活的源泉。 ——库法耶夫 57、生命不可能有两次，但许多人连一次也不善于度过。— —吕凯特 58、问渠哪得清如许，为有源头活水来。—— 朱熹 59、我的努力求学没有得到别的好处，只不过是愈来愈发觉自己的无知。 ——笛卡儿
临床PCR检验标本的处理、保存及核酸提取方法
41、实际上，我们想要的不是针对犯罪的法律，而是针对疯狂的法律。 ——马克·吐温 42、法律的力量应当跟随着公民，就像影子跟随着身体一样。— —贝卡利亚 43、法律和制度必须跟上人类思想进步。— —杰弗逊 44、人类受制于法律，法律受制于情理。— —托·富勒

样本采集及保存-PPT文档资料

取5ul用于PCR检测
痰标本处理中要注意的问题
痰标本在没有加入内标以控制假阴性的情况下，不能采用异硫氰酸胍盐（GuSCN）方法提取。采用这种方法提取，有可能会在提取过程中，出现一种可修饰DNA的酶，在最后一步提取中，与核酸一起洗提出来，从而抑制其后的扩增。
在PCR主反应混合液中，加入α-酪蛋白（alpha-casein）、白蛋白等，有防止此类抑制物产生的效果。
全血
以全血作为待测标本时,必须注意抗凝剂的选择,一般使用EDTA-Na2或枸椽酸钠,不可使用肝素。
全血样本如用于DNA提取检测,可4℃下短期保存,如用于RNA检测，则应在取血后，尽快提取RNA 。
外周血单个核细胞
外周血单个核细胞可从抗凝全血制备，主要有两条途径，一是使用淋巴细胞分离液分离制备；二是使用红细胞裂解液,裂解全血中的红细胞,经生理盐水数次洗涤,即可得到单个核细胞。
正确采集、运送、保存临床标本的重要性
质量保证关键性环节
解决涉及实验室检验的医患纠纷的方法之一
核酸提取的重要性
核酸提取是临床PCR检验最为关键的部分
核酸提取的成败关系到临床PCR检验的正确与否
临床PCR检验操作ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ最易出问题的环节
标本采集
标本采集时间对扩增检测结果的影响（过早或
血清（浆）全血外周血单个核细胞痰棉拭子脓液体液乳汁组织
血清（浆）
DNA测定，可按照一般的血清标本处理程序，对测定影响不大。
RNA测定，标本的获取和保存方式对测定结果，可能有决定性影响。最好是使用 EDTA抗凝(严禁使用肝素，因其对PCR扩增有抑制，且很难在核酸提取过程中完全去除)全血标本，抗凝后6小时内分离血浆，如使用血清标本，则需尽快(2小时内)分离血清，标本的短期（1～2周）保存可在-20℃下，较长期保存应在-70℃下。

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对于用于非分枝杆菌测定的脓液标本,如过于粘离心,沉淀用于DNA提取;如为水样,则按上述直接离心取沉淀即可。
沉淀标本的保存条件同样为-70℃。
体液
临床体液标本包括胸水,腹水,脑脊液,尿液等,可按水样标本的方式离心取沉淀后,提取核酸。沉淀样本的保存同上。
临床PCR检验标本的采集、处理、保存及核酸提取方法
江西省肿瘤医院陈文学
检验误差的发生率
1997年，一位意大利著名检验专家对急诊检验误差发生的种类和发生率进行了统计。结果显示，约有68.2%的检验误差发生在检验前期，而来自检验中期和检验后期的误差率分别为 13.3%和18.5%。
2007年，这位专家又进行了类似的统计，结果显示，检验前期的误差发生率仍高达61.9%
20000g室温离心5min取5ul用于PCR扩增
痰标本处理简单模式
试剂：（1）裂解液:含终浓度0.1 mol/L NaOH、50μg蛋白酶K和0.05% Triton X-100
50ul痰 6000g离心10分钟，弃上清加入裂解液50ul，60℃温育30min
90℃温育30min 加入Tris-HCl中和以上反应混合物
乳汁标本离心6000rpm，5min，弃上清脂质和沉淀用750ul裂解液重悬重悬液移入含100mg玻璃珠离心管搅拌煮沸5min，离心14000rpm，3min 650ul上清转移到另一离心管中，等体积异丙醇沉淀
棉拭子
在使用PCR方法检测性病病原体时,临床标本一般为棉拭子,可将棉拭子置于适量生理盐水中,充分震荡洗涤后,室温静置5～10分钟,待大块状物下沉后,取上清立即离心,其后的沉淀即可用于 DNA提取。
如不立即用于核酸提取,则需保存于70℃下.
脓液
脓液的处理依情况而定,如用于分枝杆菌(如结核杆菌)核酸测定的标本,粘稠的脓液可采用痰标本的处理模式，先进行液化，再离心取沉淀提取 DNA；水样的脓液则直接离心,沉淀用生理盐水洗2～3次后,即可用于DNA提取。
血清（浆）
DNA测定，可按照一般的血清标本处理程序，对测定影响不大。
RNA测定，标本的获取和保存方式对测定结果，可能有决定性影响。最好是使用 EDTA抗凝(严禁使用肝素，因其对PCR扩增有抑制，且很难在核酸提取过程中完全去除)全血标本，抗凝后6小时内分离血浆，如使用血清标本，则需尽快(2小时内)分离血清，标本的短期（1～2周）保存可在-20℃下，较长期保存应在-70℃下。
全血
以全血作为待测标本时,必须注意抗凝剂的选择,一般使用EDTA-Na2或枸椽酸钠,不可使用肝素。
全血样本如用于DNA提取检测,可4℃下短期保存,如用于RNA检测，则应在取血后，尽快提取RNA 。
外周血单个核细胞
外周血单个核细胞可从抗凝全血制备，主要有两条途径，一是使用淋巴细胞分离液分离制备；二是使用红细胞裂解液,裂解全血中的红细胞,经生理盐水数次洗涤,即可得到单个核细胞。
外周血单个核细胞如暂不提取核酸,可保存于-70℃下.
痰
痰属于分泌物,临床上常用作为结核杆菌DNA测定标本。
痰标本中含有大量粘蛋白和杂质,故在核酸提取时, 需对样本进行初步处理，即用1 mol/L NaOH或变性剂液化。
如用于非结核杆菌如肺炎支原体的PCR检测，痰标本只能室温悬浮于生理盐水中，充分振荡混匀，促使大块粘状物下沉，取上清离心，所得到的沉淀物即可用于核酸提取。
正确采集、运送、保存临床标本的重要性
质量保证关键性环节
解决涉及实验室检验的医患纠纷的方法之一
核酸提取的重要性
核酸提取是临床PCR检验最为关键的部分
核酸提取的成败关系到临床PCR检验的正确与否
临床PCR检验操作中最易出问题的环节
标本运送
样本一经采集，则应尽可能快的送至检测实验室。
取5ul用于PCR检测
痰标本处理中要注意的问题
痰标本在没有加入内标以控制假阴性的情况下，不能采用异硫氰酸胍盐（GuSCN）方法提取。采用这种方法提取，有可能会在提取过程中，出现一种可修饰DNA的酶，在最后一步提取中，与核酸一起洗提出来，从而抑制其后的扩增。
在PCR主反应混合液中，加入α-酪蛋白（alpha-casein）、白蛋白等，有防止此类抑制物产生的效果。
乳汁
乳汁有时也可作为标本，如乳汁中HBV DNA、HCV RNA、结核分枝杆菌和布鲁氏菌等的PCR检测。
乳汁中分枝杆菌DNA的提取
试剂准备 ①裂解液：50 mmol/L Tris-HCl， 10 mmol/L EDTA, 2% Triton X-100, 4 mol/L 异硫氰酸胍盐（GITC）, 0.3 mol/L 醋酸钠。 ②玻璃珠：（直径：425-600um）
液化标本如不立即用于核酸提取,可保存于-70℃ 下。
痰标本处理的基本模式
通用模式简单模式
痰标本处理通用模式
（1）通用标本处理（Universal sample processing, USP）溶液： 4-6 mol/L盐酸胍（GuHCl） 50 mmol/L Tris-HCl, pH7.5 25 mmol/L EDTA 0.5%十二烷基肌酸钠（Sarkosyl ） 0.1~0.2 mol/L β-巯基乙醇。
样本中如加入了适当的稳定剂,如用于RNA 测定加入GITC的血清(浆)样本和用于DNA 测定的EDTA抗凝血等,则可在室温下运送或邮寄。
实验室应根据待测靶核酸的特性，对各种临床样本的运送条件作出相应的规定。
临床标本的处理和保存
血清（浆）全血外周血单个核细胞痰棉拭子脓液体液乳汁组织
（2）0.05%Tween 80。（3）10%Chelex-100( 含0.03% Triton X-100和0.3%
Tween 20)
一定体积的痰 1.5倍体积的USP溶液,震荡30-40s 10-15ml蒸馏水，室温放置5-10min 5000g室温离心10-15min，弃上清 500ul无菌0.05%Tween80溶解或重悬 20000g室温离心10-15min，弃上清加入5倍10%chelex-100，混匀，90℃温育40min