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柱切换技术
在线痕量富集技术可分离/净化牛奶样品中9种磺胺 类药物：
磺胺类药物在预富集柱RP-C18(10µm)中被保留浓缩, 干扰杂质用淋洗剂洗去后,预柱中的磺胺类药物再用 洗脱液洗脱,进入分析柱中分离。
有研究者将TSK凝胶渗透柱和PLRP-S预富集柱串 联使用,用于净化猪组织中的磺胺二甲氧嘧啶、磺胺 甲恶唑和甲氧苄啶。
般采取均质、液-液萃取或固相萃取净化等步骤。 液-液萃取操作烦琐,而蛋白沉淀后直接进样,虽操作简便、
并具有较高的回收率,但对色谱柱的损害较为严重。
溶剂提取
溶剂提取时,应尽可能使组织中结合态的残留物溶解,并 且除去大部分的蛋白质。
一般可采用酸性水溶液、乙腈、氯仿、乙酸乙酯、二氯 甲烷、丙酮或混合溶剂等极性溶剂进行提取。
第六章 兽药残留检测技术
第五节 磺胺类药物残留的危害分 析与检测方法
一、概述
磺胺类(Sµlfonamides)药物是兽医上较常用的一 类合成抗感染药物,具有抗病原体范围广、化学 性质稳定、使用方便、易于生产等优点。
磺胺药种类繁多,兽医上常用的有10余种(图) 。
磺胺药单独使用,病原体易产生耐药性,与抗菌增 效剂如TMP(甲氧苄啶)等联用,抗菌范围扩大,疗 效明显增强,用来治疗畜禽肠道感染、乳腺炎、 肺炎等疾病。
离子对提取法亦有应用,例如,水相提取液调节pH至 10~11,加入四丁基铵离子对试剂,形成磺胺类离子对,可以 被二氯甲烷提取。
用正己烷或乙醚进行液-液萃取,可以脱脂肪。
固相萃取
由于甲氧苄啶常和其他磺胺药物同时使用,而它们具有不 同的pKa和溶剂亲和力,难以在给定的pH值和溶剂系统 中同时提取,宜采用固相萃取法(SPE)。
有时为了获得高的净化效果,几种方法相结合应用。
液-液萃取
液-液萃取尽管操作烦琐、耗费溶剂,但在所有净化方法 中应用最广。
通过调节样液的pH值,使磺胺类药物有选择性地在有机 相与水相之间进行分配。
例如,有机相提取液中的磺胺类药物可以被强酸溶液或碱 性溶液抽提,若将水相提取液调节pH至5.1~5.6,可用二氯 甲烷或乙酸乙酯进行再抽提。
二氯甲烷中加入离子对试剂四丁基铵(pH10),对鱼肉和动 物组织的提取,发现磺胺二甲氧嘧啶和奥美普林的提取率 很高。
另外,提取过程中加入无水硫酸钠可脱去组织样品中的水 分,有助于样品ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ充分提取。
2、净化
初提取液中含大量的内源性干扰杂质,在痕量分析时会干 扰组分的测定,因此还需要净化处理。
净化方法有液-液萃取、固相萃取、基质固相分散、在 线痕量富集、液相色谱、在线透析和超临界流体萃取等。
在线透析
采取在线透析、富集的方法,可测定动物源食品 (肌肉、牛奶和蛋)中的13种磺胺类药物：
利用纤维素膜选择性渗过分析物,到达预富集柱 (C18、XAD-2或XAD-4),干扰杂质用淋洗剂洗去, 浓缩后的分析物被洗脱后,进入分析柱分离。
乙酰化是磺胺的主要代谢产物,无抗菌活性。
体内分布、代谢
磺胺药在体内分布相当广泛。各种组织和体液均能到达。 以血液中含量最高,肝、肾次之,胸水、腹水、滑膜液、房 水中浓度也较高,并能透过胎盘进入胎儿体内。
磺胺药在神经、肌肉及脂肪组织中的含量则较低。
磺胺药主要在肝脏代谢,代谢方式有乙酰化、羟基化、结 合等,其中以乙酰化为主。
(R′=H),两性化合物,可溶于酸或碱溶液。
其化学性质可从四部分结构上表现出来, 即:磺酰胺基(— SO2NHR)、 芳伯氨基(— NH2)、芳环、N1及N4上的取代基。
磺酰胺基
化学性质
本类药物水溶性较低,易溶于极性有机溶剂如乙醇、丙酮、 乙腈、氯仿和二氯甲烷,难溶于非极性有机溶剂。
由于磺胺药具有酸碱两性,通过调节溶液的pH值(pH7~9), 可以使磺胺药呈不同状态,即中性分子还是离子分子,从 而改变水相和有机相的分配系数。
例如,磺胺的中性分子,在二氯甲烷等有机溶剂中分配系 数大;离子态分子,则水性溶液中分配系数大。
生物样品通过多次液-液萃取,可达到净化的目的。
1、提取
液体样品(如牛奶)可用水稀释过滤后,荧光直接检测,亦可 用水性缓冲液或氯化钠溶液稀释,再进行净化处理。
蜂蜜样品可用水或水性缓冲液稀释。 组织样品(如肌肉、肾脏、肝脏)的预处理相对复杂些,一
磺胺药尚可经肠液、胆汁分泌排出,也可由乳汁排泄,但 量较少。
常见磺胺药
磺胺嘧啶 三甲氧苄啶 磺胺二甲嘧啶 磺胺二甲氧嘧啶 磺胺喹恶啉 磺胺噻唑 巴喹普林
二、样品处理
常用的磺胺类药物,除少数外,一般具有以下的基本结构:
磺酰氨基的酸性表现在 N1上的活泼氢原子,其酸 性的大小取决于N1上的 取代基R。R的吸电性 越大,则其酸性越强。
同时也被广泛的用作饲料添加剂,用来增肥 犊牛 和猪。
吸收后存在形式
磺胺药吸收后,一部分在血浆中保持游离状态(游 离型),一部分与血浆蛋白相结合(结合型),另一部 分在肝脏中高度乙酰化变成乙酰磺胺。
游离型具抗菌作用,且能透过毛细血管进入各种 体液和组织。
结合型无抗菌活性,也不能透入体液或组织中,但 结合较疏松,能不断分解出游离型磺胺。
磺胺药乙酰化后失去抗菌作用,且在尿中的溶解度降低,易 在肾小管析出结晶,造成对泌尿道的损害。应注意同服碳 酸氢钠,并增加饮水,可减少或避免其对泌尿道的损害。
部分磺胺药及代谢产物在肝内成为水溶性的葡萄糖醛酸结 合物而失去活性。
排泄
内服难吸收的磺胺药,主要由粪便排出;
内服易吸收的磺胺药主要通过肾脏排泄,通过肾小球滤过 或肾小管分泌到达肾小管腔内的药物,有一部分被肾小管 重吸收。重吸收少、排泄快的药物如磺胺异恶唑在尿中 浓度较高,适用于治疗泌尿道感染。主要由肾小管分泌, 重吸收多的药物在尿中浓度低,但在血中有效浓度维持时 间较长,多属长效如SMZ、SMM等。
常用的SPE柱,如C18和C8、硅胶柱、离子交换柱、 Florisil柱和碱性氧化铝柱等。
该法操作较为简便、并对生物样品具有较高的“净化” 能力,可提高方法的提取回收率和精密度。亦可将几种小 柱串联应用,可获得更高的净化效果。
基质固相分散法目前只使用C18吸附剂,该方法简便、提 取率和净化能力均高,已应用于鱼肉、牛肉、猪肉和牛奶 样品的预处理。
