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HPLC-电雾式检测器（CAD）检测法测定脂质体中磷脂含量

HPLC-电雾式检测器（CAD）检测法测定脂质体中磷脂含量

HPLC-电雾式检测器（CAD）检测法测定脂质体中磷脂含量HPLC.电雾式检测器(CAD)检测法测定脂质体中磷脂含量姜庆伟,杨瑞,梅兴国(军事医学科学院毒物药物研究所,北京lOO85O)摘要:目的建立HPLC一电雾式检测器(ChargedAerosolDetection,CAD)检测脂质体磷脂含量及降解产物的方法.方法选用几种类脂材料制备成空白脂质体注射剂及冻干粉针剂,利用HPLC.CAD测定脂质体磷脂膜中各种类脂的含量,采用反相c色谱柱,流动相为甲醇一水,梯度洗脱,流速1mL?min～.结果4种类脂材料的平均回收率分别为99.2%,98.7%,99.5%,99.1%;RSD分别为1.1%,1.5%,0.8%,1.3%.结论实验充分证明了HPLC一电雾式检测器联合应用,可以快速,高效,准确地检测脂质体中的磷脂含量及杂质.关键词:脂质体;二棕榈酰磷脂酰胆碱;二硬脂酰磷脂酰甘油;单棕榈酰磷脂酰胆碱;二硬脂酰磷脂酰乙醇胺一聚乙二醇;高效液相色谱法中图分类号:R944文献标识码:A文章编号:1001—2494(2007)23—1794—03 DeterminationofPhospholipidandItsDegradationProductsinLiposomesforInjectionbyH PLC-ChargedAerosolDetection(CAD)JIANGQing—wei,YANGRui,MEIXing—guo(InstituteofPharnm~ologyandToxicology,AcademyofMilitaryMedicalSciences,8e~ng100850,China)ABSTRACT:OBJECTIVETodevelopaHPLC?CADmethodforthedeterminationofDSP E—PEG,phosphatidylcholine(DPPC),DSPG,lysophosphatidylcholine(MPPC)inphospholipidbilayerofblankliposomesforinje ction.METHODSAseparationwasper-formedonaCRcolumnwiththemobilephaseofme山anol—watergradientelutionattheflowrateof1mL?min～.RESULTSTheav. eragerecoveriesofDSPE—PEG,DSPG,MPPCandDPPCwere99.2%,98.7%,99,5%and99.1%andwithRSDsof1.1%, 1.5%,0.8%and1.3%respectively.CONCLUSIONHPLC—CAD,anewmethodforphospholipidsanalysis.provideshighsensitivityand reproducibility.KEYWORDS:liposome;DSPG;MPPC;DPPC;DSPE—PEG;HPLC电雾检测器(CAD)是一种独特的技术,HPLC洗脱液经雾化器中氮气的作用而雾化,其中较大的液滴在碰撞器的作用下经废液管流出,较小的溶质(分析物)液滴在室温下干燥,形成溶质颗粒.同时,用于载气的氮气分流形成的第二股氮气流经过电晕式装置(含高压铂金丝电极)形成带正电荷的氮气颗粒,与溶质颗粒反向相遇时经碰撞使溶质颗粒带上正电.为了消除由带有过多正电荷的氮气所引起的背景电流,在含溶质颗粒的气流流入静电检测计之前,通过一种称之为离子井的装置(带有低负电压)使迁移率较大的颗粒(即粒度较小的氮气颗粒)的电荷中和,而迁移率小的带电颗粒把它们的电荷转移给一个颗粒收集器,最后用一个高灵敏度的静电检测器测出带电溶质的信号电流.由此产生的信号电流与溶质(分析物质)的含量成正比.CAD可实际应用于任何非挥发或半挥发化合物,包括:药物化合物,脂类,碳水化合物,多肽,药物分子支架,类固醇,蛋白质,聚合物等.磷脂和胆固醇是脂质体主要成分,其稳定性直接影响脂质体药物的包封率和渗漏率及脂质体在体内的行为.磷脂酰胆碱可能水解产生有害杂质——溶血磷脂酰胆碱¨J,与动脉粥样硬化及血栓形成关系密切.目前,磷脂分析多采用HPLC—ELSD法,其特点是散射光的对数响应值与组分的质量的对数成线性关系,但此对数关系变异性较大,且其灵敏度较低,最低检测限在50～100ng之间.CAD检测器作为一种通用型检测器,在磷脂的分析检测方面显示出了非凡的能力,文献报道甘油三酯,胆固醇等类脂物质的最低检测限达到了1ng_9J.本实验建立了HPLC.CAD测定空白脂质体注射液及冻干粉针剂中DSPE.PEG,DSPG,MPPC,DPPC的含量,考察了不同放置条件下脂质体中磷脂的稳定性.作者简介:姜庆伟,男,硕士研究生通讯作者:梅兴国,男,教授,博士生导师Tel:(010)66932644E-mail:*****************ChinPharmJ,2007December,V o1.42No.23中国药学杂志2007年l2月第42卷第23期1材料与方法1.1材料与仪器2130型高效液相色谱仪(Hitachi公司),Corona电雾式检测器(美国ESA公司),超纯水机(LABCONCO),二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC),二硬脂酰磷酯酰甘油(DSPG),单棕榈酰磷酯酰胆碱(MPPC),二硬脂酰磷脂酰乙醇胺.聚乙二醇(DSPE.PEG)对照品(Lipoid公司,纯度>99%),甲醇为色谱纯,三氯甲烷为分析纯,纯水(实验室自制).1.2色谱条件Corona参数:气体:241.3KPa氮气;Filter:Low;Range:200pA;HPLC参数:流动相A为水;流动相B为甲醇.梯度洗脱时问表:0.0min,10/90(%A/%B,以下同);2.5min,0/100;12.0min,0/100;15.0rain,10/90.流速1.0mL?min～,色谱柱Ve—nusilXBPC8(4.6mm×250mm,5m),柱温25℃,进样量10L.1.3溶液的配制1.3.1标准溶液的配制精密称取DSPE.PEG, DSPG,MPPC,DPPC各10mg,置于10mL量瓶中, 加入甲醇.三氯甲烷(1:2)溶液3mL溶解,并用甲醇稀释至刻度.分别精密量取0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.6mL的贮备液到1～6号10mL量瓶中,加入甲醇一三氯甲烷(8:2)稀释至刻度,混合均匀,依照浓度递增分别标定为1～6号标准溶液.1.3.2脂质体样品溶液配制分别取实验室自制的空白脂质体注射液及冻干复水空白脂质体(磷脂质量浓度约为25g?L)20L,加入到10mL量瓶中,加入3mL三氯甲烷.甲醇(2:1)的溶液溶解,并加入甲醇稀释至刻度,经0.45m的微孔滤膜过滤后,备用.1.3.3系统适应性溶液配制取空白脂质体样品经酸(1mol?LHC1),碱(1tool?LNaOH),氧(向溶液中通氧3h),热(100℃水浴,2h),强光照射(4500Lx,72h)破坏后,按"1.3.2"样品配置方法配制系统适用性溶液,备用.1.4系统适用性取初始流动相进样测定,观察基线状况.空白脂质体注射液中各辅料及酸,碱,氧化,高温,强光破坏试验中产生的杂质是否影响各磷脂成分的检测. 检查酸,氧化,高温,强光破坏试验中MPPC的含量是否增大.1.5精密度取同一批样品,按"1.3.4"方法制备样品溶液,中国药学杂志2007年12月第42卷第23期平行测定6次,计算平均含量和RSD值.1.6回收率分别精密称取处方量辅料和DSPE.PEG,DSPG,MPPC,DPPC对照品适量,按样品溶液制备方法用甲醇一三氯甲烷(8:2)配成体积分数80%,100%,120%的溶液各3份,进样测定,计算回收率及RSD值.1.7标准曲线的绘制取各标准液,每份样品进样3次,进样量10L,按峰面积一浓度绘制各组分标准曲线,并计算回归方程,及r值.1.8样品测定将空白脂质体注射液和冻干粉针剂,分别置25℃(相对湿度75%),4℃的条件下放样.分别于第0,30,60,90天取样,按样品溶液配制方法配制样品溶液,进样测定,以外标法计算含量.2结果2.1系统适用性系统适用性试验结果表明,空白脂质体注射液中各辅料和酸,碱,氧化,高温,强光破坏试验中产生的杂质均不影响DSPE—PEG,DSPG,MPPC,DPPC的检测.检查酸,氧化,高温,强光破坏试验中MPPC的含量增大.见图1.3367l00l331672O0图1系统适用性HPLC色谱图A一空白色谱图;B一经酸破坏后的色谱图;1一二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇;2一二硬脂酰磷酯酰甘油;3一单棕榈酰磷酯酰胆碱;4一二棕榈酰磷脂酰胆碱,Fig1TypicalHPLCchromatogramofsystemsuitabilityA—blank;B—destroyedbyacid;1一DSPE—PEG;2一DSPG;3一MPPC;4一DPPC 2.2精密度DSPE.PEG,DSPG,MPPC,DPPC对磷脂的含量分别为3.35,3.31,3.20,12.56g?L～,RSD值分别为1.8%,2.1%,1.1%,1.5%(n=6).2.3回收率DSPE—PEG,DSPG,MPPC,DPPC的平均回收率分另U为99.2%,98.7%,99.5%,99.1%,RSD分别为1.1%,1.5%,0.8%,1.3%(n=3).Chin0J.2007December.V o1.42No.232.4标准曲线DSPE.PEG,DSPG,MPPC,DPPC4种磷脂的质量浓度与峰面积呈直线关系,且线性关系良好,回归方程分别为Y=34874x一1551O,r=0.9988;Y=33469x一26669,r=0.9983;y=40397x+16755,r=0.9991;y=46909x+23795,r=0.9995.2.5样品测定脂质体样品中的其他组分与磷脂能够有效分离,不影响磷脂的测定,其中2.70min的色谱峰为脂质体中加入冻干保护剂,在磷脂分析的过程中可以同时进行定量测定,见图2.样品测定结果见表1.由表1可见,25℃条件下放置的脂质体注射液中的MPPC含量均有不同程度的提高.实验结果表明,脂质体冻干粉针样品稳定性明显优于注射液.003367j00j33j67200t/min图2脂质体样品的HPLC色谱图1一加入冻干保护剂脂质体;2一药物Fig2HPLCChromatogramofliposomesample 1——liposomespikedwithfreeze-?dryprotectiveagent;2——drug 表1样品磷脂含量测定Tab1Phospholipidcontentsinliposomesample4讨论实验表明,CAD检测器作为一种新型通用检测器,其性能完全适用于磷脂分析.实验得到的磷脂标准曲线中,CAD检测器的响应值与组分的质量成直线关系,不同于ELSD检测器响应值与组分质量ChinPhamJ.2007December,V o1.42No.23的对数关系,更便于计算,且具有更高的灵敏度,更好的重现性.对于CAD检测器,流动相的pH值过高会造成基线飘移和噪音增大,实验中采用的流动相的pH值应小于8.5,可以采用适量的乙二胺和冰醋酸调节流动相的pH值.实验建立的反相HPLC—CAD测定磷脂的方法采用的甲醇.水溶剂系统具有溶剂系统简单,低毒的特点;使用c色谱柱具有适中的极性,满足高效分离,快速检测要求;CAD检测器操作简便,灵敏度高,重现性好.实验中需使用高纯氮气,并保持压力稳定,有利于基线的平稳.由于DSPE—PEG和DSPG两种磷脂的性质非常相近,且对流动相的水分含量敏感,因此在实验中应对甲醇中的水分含量进行严格的控制,保证磷脂的有效分离.色谱图中各浓度的DPPC峰均有不同程度的拖尾,主要是由于甲醇的洗脱能力较弱导致的.本实验建立的HPLC.CAD检测法完全满足磷脂的分析检测要求,为脂质体制剂的磷脂成分分析检测提供了一套完整的方法,成为脂质体制剂中磷脂的含量和降解产物检测的一种有效手段. REFERENCES[1]SAKAIM,MIYAZAKIA,HAKAMA TAH,eta1.Lysophosphati- dylcholineplaysanessentialroleinthemitogeniceffectofoxi- dizedlowdensitylipoproteinonmurineacrophages[J].,Biol Chem,1994,269(50):31430-31435.[2]GENGWF,NIUCQ,ZHANGT,eta1.Determinationofcompo—sitionofphospholipidbilayerindoxombicinhydrochloridelipo—BonesforinjectionbyHPLC?ELSD[J].Chin,om(中国医药工业杂志),2005,36(6):359-361.[3]IOFFEV,KALENDAREVT,RUBINSTEINI.eta1.Reverse phaseHPLCforpolarlipids.SimpleandselectiveHPLCproce? duresforanalysisofphospholipid-basedderivativesofvalpmic acidandV ariousnon?steroidalanti—inflammatorydrugs[J]., PfmmBiomedAnal,2002.30:391_4O3.[4]NORDBACKJ,LUNDBERGE,CHRISTIEW,eta1.Separation oflipidclassesfrommarineparticulatematerialbyHPLCona polyvinylalcohol?bondedstationaryphaseusingdual—channele. vaporativelight?scatteringdetection[J].MarChem,1998,60: 165.175.[5]ZHANGWN,HEHB,FENGYQ,eta1.Separationofphos. phatidylcholineandphosphatidylethanolaminebyusinghigh—per? formancedisplacementchromatography[J].,ChromatogrA, 2004,1036:145—154.[6]YOONTH,KIMIH.Phosphatidylcholineisolationfromeggyolk phospholipidsbyhigh—performanceliquidchromatography[J]., ChromatogrA,2002,949:209-216.[7]GRIZARDG,SIONB,BAUCHARTD,eta1.Separationandquan—tificationofcholesterolandmajorphospholipids,classesinhumanBoneRbyhigh?performanceliquidchromatographyandlight?scatter? ingdetection[J].,ChrormaogrB,2000,740:101.107.[8]OLIVIERM,OLIVIERR,DIDIERE,eta1.Directlipidquantita. tionofcationiclipoBomesbyreversed?phaseHPLCinlipoplexpmp~ationprocess[J].Eur,mBi~harm,2000,50:353—356.[9]MOREAURA.TheanalysisoflipidsviaHPLCwithaCharged AerosolDetector[J].却池,2006,41(7):727.(收稿日期:2006.12.11)中国药学杂志2007年12月第42卷第23期。

HPLC.ELSD法测定注射用1,4.丁二磺酸腺苷蛋氨酸注射用溶剂中三.赖氨酸的含量

HPLC.ELSD法测定注射用1,4.丁二磺酸腺苷蛋氨酸注射用溶剂中三.赖氨酸的含量

０ ． ２ ０ ６ ６ － ２ ． ０ ６ ６ ０ ￣ ｇ （ ｒ ＝ ０ ． ９ ９ ９ ７ ， ＝ ５ ） ． Ｔ ｈ ｅ ｍｅ ａ ｎ ｒ ｅ ｃ ｏ ｖ ｅ ｒ ｙ ｗａ ｓ ９ ８ ． ０ ２ ％ｗ ｉ ｔ ｈ Ｒ Ｓ Ｄ ＝ １ ． ０ ５ ％（ ＝ ９ １ ． Ｃ ｏ ｎ ｃ ｌ ｕ ｓ ｉ ｏ ｎ Ｔ ｈ ｅ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ
Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ Ｏ ｂ ｉ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ Ａｎ ＨＰ Ｌ Ｃ ． ． Ｅ Ｌ Ｓ Ｄ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｆ ｏ ｒ ｃ ｏ ｎ ｔ ｅ ｎ ｔ ｄ ｅ ｔ ｅ ｒ ｍｉ ｎ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｌ ． ． １ ｙ ｓ ｉ ｎ ｅ ｉ ｎ ｔ ｈ ｅ ｓ ｏ ｌ ｖ ｅ ｎ ｔ ｕ ｓ ｅ ｄ ｏｒ ｆ ｔ ｈ ｅ ａ ｄ ｅ ｍｅ ｔ ｉ ｏ ｎ ｉ ｎ ｅ １ ． ４ ． Ｂ ｕ ｔ ａ ｎ ｅ ｄ ｉ ｓ ｕ ｌ ｆ ｏ ｎ ａ ｔ ｅ ｏｒ ｆ ｉ ｎ ｉ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｗａ ｓ ｅ ｓ ｔ ａ ｂ ｌ ｉ ｓ ｈ ｅ ｄ ． Ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ Ｔ ｈ ｅ ｄ ｅ ｔ ｅ ｒ ｍｉ ｎ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｗａ ｓ ｐ ｅ ｒ ｆ ｏ ｒ ｍｅ ｄ
ｉ ｓ ｓ ｉ ｍｐｌ ｅ ．ａ ｃ ｃ ｕｒ ａ ｔ ｅ ａ ｎ ｄ ｈａ ｖｅ ｇ ｏ ｏｄ ｒ ｅ ｐｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｉ ｂ ｉ ｌ ｉ ｔ ｙ ，ａ ｎｄ ｉ ｔ ｃ ｏ ｕｌ ｄ ｂｅ ｕ ｓ ｅ ｄ ｔ ｏ ｃ ｏ ｎｔ ｅ ｎｔ ｄｅ ｔ ｅ ｒ ｍｉ ｎ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｌ— ｌ ｙ ｓ ｉ ｎｅ ｉ ｎ ｔ ｈｅ
ｓ ｏ ｌ ｕ ｔ ｉ ｏ ｎ （ ２ ： １ ： ９ ７ 、 ａ ｔ ｒ ｏ ｏ ｍ ｔ ｅ ｍｐ ｅ ｒ ａ ｔ ｕ ｒ ｅ ． Ｅ Ｌ Ｓ Ｄ ｗａ ｓ ｕ ｓ ｅ ｄ ａ ｓ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ ， ｔ ｈ ｅ ｄ ｒ ｉ ｆ ｔ ｔ ｕ ｂ ｅ ｔ ｅ ｍｐ ｅ ｒ ａ ｔ ｕ ｒ ｅ ｗａ ｓ １ ０ ５ ℃ ａ ｎ ｄ ｅ ｌ ｕ ａ ｎ ｔ

HPLC-ELSD测定多西他赛注射用浓溶液中溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰胆碱的含量

HPLC-ELSD测定多西他赛注射用浓溶液中溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰胆碱的含量

Tel: (025)83118526
E-mail: Cherry3359_cn@
*
通信作者：谢俊，男，博士，副
Tel: (025)831185, 2013 November, Vol.30 No.11
中国现代应用药学 2013 年 11 月第 30 卷第 11 期
收稿日期： 2013-03-30
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HPLC-ELSD 测定多西他赛注射用浓溶液中溶血磷脂酰乙醇胺、溶血 磷脂酰胆碱的含量

杨俊，谢俊*(金陵药业股份有限公司技术中心，南京
摘要：目的
210009)
建 立 同 时 测 定 多 西 他 赛 注 射 用 浓 溶 液 中 的 溶 血 磷 脂 酰 乙 醇 胺 (LPE) 、 溶 血 磷 脂 酰 胆 碱 (LPC) 含 量 的 采用 YMC Pack PVA-Sil(150 mm×2 mm，5 μm)色谱柱，以三氯甲烷为流动相 A、甲醇-水(93.5∶6.5) LPE 和 LPC 峰面积的对数与相应的浓度的对数呈良好的线性关系，线性范
制剂直接将药物溶解于吐温 80 中制得(药物∶吐 温 80=1∶26)， 临用前用含乙醇为 13%的专用溶剂 复溶。近年来，随着现代药剂学的发展和对肿瘤 研究的不断深入，国内外学者研制了多种多西他 赛的新型给药系统，如纳米粒、聚合物胶束、微 乳、脂质体等。本实验室应用磷脂囊泡增溶特性 设计了多西他赛新型药物给药系统。本品系遵照 磷脂囊泡自发形成原理，通过两亲性表面活性剂 ( 磷脂 ) 和非离子型表面活性剂的复配方式实现本 品在水性介质中快速形成纳米分散体系，故将其 命名为多西他赛注射用浓溶液(2 mL∶40 mg)。该 给药体系属热力学稳定体系，可显著提高难溶性 药物的有效载药量。 本品处方中有大量的大豆磷脂。由于大豆磷 脂富含不饱和脂肪酸，在制剂制备、贮藏过程中 易被氧化、水解，从而产生一系列过氧化脂质， 影响其生理活性。溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂 酰胆碱是大豆磷脂的主要分解产物。鉴于大豆磷 脂分解产物的以上特性，且本品为注射剂，更应严 格控制其分解产物的量。故笔者参考有关文献[1-2]， 采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器，对多西他 赛注射用浓溶液中的溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷 脂酰胆碱进行了检查。 1 仪器与试药 Waters 2690 高效液相色谱仪(美国 Waters 公 司)，Alltech 2000 型蒸发光散射检测器；XWK-Ⅲ 无油空气泵(天津市津分分析仪器制造有限公司)。 磷脂酰胆碱对照品 (PC ，含量 99% ，批号： 110M5210V)， 磷脂酰乙醇胺对照品(PE， 含量 98%， 批号： 017K5205) ，磷脂酰肌醇对照品 (PI ，含量 99%，批号：BCBB4609)，鞘磷脂对照品(SM，含 量 98%，批号：BCBF4085V)，溶血磷脂酰胆碱对 照品(LPC，含量 99%，批号：011M5205V)，溶血 磷脂酰乙醇胺对照品 (LPE ，含量 99% ，批号： 120M1719V)，均为 Sigma 公司产品。三氯甲烷、 甲醇、甲酸及三乙胺均为色谱纯。 多西他赛注射用浓溶液(自制，批号： 20120223，规格：2 mL∶40 mg)；大豆磷脂(上海 太伟药业股份有限公司，批号：20110703)。 2 2.1 方法与结果 色谱条件 色谱柱：YMC Pack PVA-Sil(150 mm×2 mm，

HPLC测定多烯磷脂酰胆碱胶囊中的溶血磷脂酰胆碱

HPLC测定多烯磷脂酰胆碱胶囊中的溶血磷脂酰胆碱
华西药学杂志 W C J· P S
2010，25（2） ∶215 ～ 216
HPLC 测定多烯磷脂酰胆碱胶囊中的溶血磷脂酰胆碱
曾令高
（ 重庆市药品检验所，重庆 401121）
摘要： 目的 采用 HPLC － ELSD 测定多烯磷脂酰胆碱胶囊中溶血磷脂酰胆碱的含量。方法 色谱柱为硅胶（250 mm × 4. 6
polyene hosphatidylcholine lysophosphatidyl choline
1 实验部分
1. 1 仪器与试药 1100 高 效 液 相 色 谱 系 统 （ 美 国 安 捷 伦 ） ；
UV2201 紫外可见分光光度计（ 日本岛津） 。多烯磷 脂酰胆碱对照品（ 德国 Lipoid，790539 － 1） ；溶血磷 脂酰胆碱对照品（ 美国 Sigma，055K5201 ） ；多烯磷 脂酰胆碱胶囊（ 市售） ；正己烷、异丙醇为色谱纯；水 为重蒸馏水；其他试剂为分析纯。 1. 2 方法与结果 1. 2. 1 色谱条件及分离结果 色谱柱采用硅胶色 谱柱（250 mm × 4. 6 mm，5 μm） ；流动相 A 为正己 烷 － 异丙醇（3∶4） ，流动相 B 为正己烷 － 异丙醇 －
A
B
C
D
E
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40 t/min
0 10 20 30 40
图 2 酸破坏（ A） 、碱破坏（ B） 、热破坏（ C） 、氧化破坏（ D） 和光破坏（ E） 样品溶液的色谱图 Fig 2 The exclusion sample solution of destroyed by acid（ A） ，by alkali（ B） ，by heat（ C） ，by H2 O2 （ D） and under strong light（ E）

211018619_HPLC_法测定前列地尔注射液中溶血磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰乙醇胺的含量

211018619_HPLC_法测定前列地尔注射液中溶血磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰乙醇胺的含量

第52卷第3期 辽 宁 化 工 Vol.52，No. 3 2023年3月 Liaoning Chemical Industry March，2023收稿日期： 2022-08-04 作者简介： 张硕（1987-），女，满族，辽宁省沈阳市人，主管药师，2011年毕业于沈阳药科大学药学专业，研究方向：药品研发。

HPLC 法测定前列地尔注射液中溶血磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰乙醇胺的含量张硕1，付永慧2，武立华1，孙银玲1，陈阳1（1. 远大生命科学（辽宁）有限公司，辽宁 沈阳 110171; 2. 蓬莱诺康药业有限公司，山东 蓬莱 265600）摘 要：研究了HPLC -ELSD 法测定前列地尔注射液中溶血磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰乙醇胺的含量。

采用低温型蒸发光散射检测器（雾化气为氮气，雾化气压力为 25 psi，漂移管温度为40 ℃），Ultimate Diol 色谱柱（4.6 mm×250 mm, 5 μm ）；以甲醇-水-冰醋酸-三乙胺（85∶15∶0.5∶0.05）为流动相A，以正己烷-异丙醇-流动相A（20∶48∶32）为流动相B，柱温为40 ℃，梯度洗脱。

结果表明：溶血磷脂酰胆碱在0.02～0.20 mg ·mL -1（R =0.999 9，n =6），溶血磷脂酰乙醇胺在0.01～0. 1 mg ·mL -1 （r =0.999 8，n =6）成良好线性关系；定量限分别0.02 mg ·mL -1和0.01 mg ·mL -1，检测限分别为0.006 mg ·mL -1和 0.003 mg ·mL -1；平均回收率（n =9）分别为101.4%（RSD =2.4%）和98.8%（RSD =1.9%）。

所建立的HPLC 方法可用于前列地尔注射液中溶血磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰乙醇胺含量的测定。

关 键 词：HPLC；前列地尔注射液；溶血磷脂酰胆碱；溶血磷脂酰乙醇胺；含量 中图分类号：O657 文献标识码： A 文章编号： 1004-0935（2023）03-0457-04前列地尔，又叫前列腺素E1，化学名 (1R, 2R, 3R)-3-羟基-2(E)-(3S)-3-羟基-1-辛烯基-5-氧代环戊烷庚酸，是一种前列腺素。

HPLC_ELSD测定猪肺表面活性物质及其冻干粉中7种磷脂组分含量

HPLC_ELSD测定猪肺表面活性物质及其冻干粉中7种磷脂组分含量

分进行分析研究的文献报道较少, 有封志纯等 [ 2 3] 采 用薄层扫描法测定了猪肺 表面活性物质中 的鞘磷
脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺及磷脂 酰甘油等成分; 武荣等 [ 4] 采用 HPLC UV, 203 nm 处 检测, 对前体脂质体型猪肺表面活性物质的 6种磷 脂成 分 进 行 了 分 析; B rouw ers 等 [ 5] 采 用 H PLC ELSD, 对猪肺表面活性物质中磷脂酰胆碱的分子种 进行了分析。但对本品来说, 薄层扫描法或 H PLC UV均存在定量准确度较差的缺点, 而且对本品中 7 种磷脂组分的分离, 笔者目前未见文献报道。
Y E X iao m in2, T IAN Song jiu1* , L I H ui yi1, ZHANG Q i m ing1 ( 1 N ational Institu te for the Control of Pharmaceu tical and
B iolog ical Products, B eij ing 100050, China; 2 W uhan Institute for D rug Control, W uhan 430012, China )
磷脂组分的含量, 专属性强、准 确度高。
关键词: 高效液相色谱 蒸发光散射检测器; 猪肺表面活性物质; 冻干粉; 磷脂
中图分类号: R 917
文献标识码: A
文章编号: 1001- 2494( 2007) 12- 0938- 05
D eterm ination of Seven Phospholipid Com ponen ts in Porcine Pulm onary Surfactant and Its Lyophilized Pow der by HPLC ELSD M ethod

HPLCELSD法测定黄芪及其注射液中黄芪皂苷ⅣⅢⅠ的含量


［#］ 中国药典 )**4 年版， 二部 ［ .］ 附录 ),& ’ ’ )**4： ［$］ ［日］ 藤 昭， 相 泽 益 男， 井 上 彻， 著’ 电化学测定方法 ［ (］ 姚建年， 译 ’ 北京： 北京大学出版社， ’ 陈震， )**4： *6 ’ ［%］ 刘永辉 ’ 电化学测试技术 ［ (］ 北京航空学院出版社， ’ 北京： )*+&： 745 ’ ［&］ 朱元保， 沈子琛 ’ 电化学数据手册 ［ (］ 湖南科学技术出 ’ 长沙： 版社， )*+4： &8& ’ ［’］ 9" )*++， ［ .］ :;2<=0! ’ )*++： ,) ’ ［(］ 许瑞庭编著 ’ 实用药物分析化学 ［ (］ 浙江科学技术出 ’ 杭州： 版社， )**&： 8+& ’ ［)］ 9" )**8 :;2<=0 ! ［ .］ ’ )**8： 77， 75， 7,， ),&， 465， 474 ’ ［!*］ 河北省卫生厅 ’ 河北省药品标准 )**) 年版 ［ .］ ’ 8*7 ’ ［!!］ 河北省卫生厅 ’ 河北省药品标准 )**) 年版 ［ .］ ’ 8*5 ’ ［!"］ 中 国 药 典 )**6 年 版， 二部 ［ (］ ’ )**6：,47， 45+， 5&+， 8,&， &7&， 7,6 ’ ［!#］ 卫生部部颁标准 （试行） （ @ ? ))8） （&） ［ .］ >. ? )8) ? *5 ’ ［!$］ AB0C0DE322 "F， !<G3D HI， $D;GG=0J >I， !" #$ ’ (0K32 CBJLBJE ［ F］ K0JL0JMB0G ;N /3DB;<G 3JKBCB;KBMG ’ % &’#( ) &’#( )#*+$ ， )*55， )+： ,&* ’ ［!%］ 中国科学院长春应用化学研究所 ’ 分析技术词典， 离子选择性 电极分析分册 ［ (］ 科学出版社， ’ 北京： )*+4： 84 ’ （收稿日期： &666O)&O)5）

HPLC_ELSD法测定酶解磷脂中甘油磷脂酰胆碱含量的研究

＊通讯 作 者：汪 勇，男，１９７７ 年 出 生，研 究 员，主 要 从 事油脂生物炼制教学与科研工作。
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｓ ６．３μｇ／ｍＬ （Ｓ／Ｎ＝３），ａｎｄ ｔｈｅ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｉｓ １３．０μｇ／ｍＬ （Ｓ／Ｎ＝１０）．Ｔｈｅ ａｖｅｒ－ ａｇｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ ｏｆ ＧＰＣ ｉｓ １０２．５％ ， ＲＳＤ＝２．２％ （ｎ＝３），ａｎｄ ｔｈｅ ｔｉｍｅ ｏｆ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｓ
试剂：蒸 馏 水；磷 脂 酶 Ａ１（１０ ０００ Ｕ／ｍＬ，诺 维 信 酶 制 剂 公 司 ）；卵 磷 脂 （＞９０％ ，阿 拉 丁 试 剂 公 司 ）； 甘 油 磷 脂 酰 胆 碱 标 准 品 （＞９９．８％ ，上 海 伊 耀 精 细 化 工厂）；ＰＣ３５（磷脂酰 胆 碱 含 量 ≥３５ ％ 的 磷 脂 产 品， 广 州 海 莎 生 物 科 技 有 限 公 司 ）；甲 醇 （色 谱 纯 ，蓝 白 试 剂 公 司 ）。 １．２ 色 谱 分 析 条 件
的含量，该方法精 灵 敏 度 高，稳 定 性 好，但 是 检 测 成 本高在一 定 程 度 上 限 制 了 方 法 的 应 用。 刘 秋 等［１２］ 利用高效液相色谱－蒸发光散射检测方法测定甘油 磷脂酰胆碱 的 含 量，色 谱 柱 为 Ｄｉｏｌ正 相 硅 胶 柱，流 动相 为 甲 醇 和 水。 该 方 法 具 有 将 ＧＰＣ 与 其 他 组 分 有效分离，灵敏度 高，分 析 时 间 短 等 优 势，并 且 采 用 硅胶上键合１，２－二羟基丙基官能团的 Ｄｉｏｌ色谱柱 也在一定程度上降低了水对色谱柱柱效和寿命的影 响。但是作为正相 柱，强 极 性 的 水 对 色 谱 柱 的 损 害 是不可避免，所以长 期 使 用 必 然 导 致 色 谱 柱 柱 效 下 降 ，影 响 检 测 结 果 准 确 性 ，同 时 卵 磷 脂 和 甘 油 磷 脂 酰 胆碱都是极易吸潮 的 物 质，流 动 相 中 水 分 会 与 ＰＣ、 ＧＰＣ 结合，在检 测 器 的 漂 移 管 中 无 法 挥 发，使 得 检 测结果偏大。

HPLC—ELSD法测定大豆磷脂中磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰胆碱含量-论文

酰 乙醇胺 （ 脑磷脂 ， Ｐ Ｅ） 、 磷脂酰肌醇 （ Ｐ Ｉ ） 及磷脂酰 丝
因此 ， 本研 究采用高效液相色谱 一蒸发光散射 检测（ ＨＰ Ｌ Ｃ － Ｅ Ｌ Ｓ Ｄ）法 测 定 大 豆 磷 脂 中 Ｐ Ｃ和 Ｌ Ｐ Ｃ
。
剞
胺 酸（ Ｐ Ｓ） 等组成 ” 。 由于其具乳 化、 分散 、 湿润及 改
善 食 品起 泡性 与操 作性 能 ， 被 广泛 应用 于糖 果、 巧 克
含量， 用 正相 硅胶 色谱 柱进行 检测 ， 并对 色谱柱 选择 进 行优 化 ， 以达 到快 速 、 准确 分析 检测 Ｐ Ｃ和 Ｌ Ｐ Ｃ含
量 目的 。 １材 料 与 方 法 １ ． １ 材料与试 剂
力、 饼 干、 肉类制 品、 速溶食 品、 奶类及奶制 品、 人造 奶 油等食 品 ㈤。
大 豆改性 磷脂 （ 含Ｐ Ｃ ２ ７ ％， Ｌ Ｐ Ｃ ３ ０ ％） ：广州市
海 莎生物有限公司 ； Ｐ Ｃ（ 含量 ＞ ９ ９ ％） ： Ｓ ｉ ｇ ｍａ公 司； Ｌ Ｐ Ｃ（ 含量 ＞ ９ ９ ％） ： Ｓ ｉ ｍ ａ公司 ； ｇ 正 己烷、 甲醇和 异 丙 醇均为色谱纯 ， 冰醋酸 为分析纯 。
ｒ ｅ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎｓ ｈ ｉ ｐ ｂ ｅ ｔ ｗｅ ｅ ｎ ｔ ｈｅ ｃ ｏ ｎ ｃ ｅ ｎ ｔ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｐ ｈｏｓ ｐｈ ａ ｌ ｉ ｐ ｉ ｄｓ ａ ｎｄ ｔ ｈｅ ｐｅ ａ ｋ ａ ｒ ｅ ａ ｗａ ｓ ｅ ｘｉ ｓ ｔ ｅ ｄ ｗｈ ｅ ｎ ｔ ｈ ｅ
液 相 色谱 法等 方法 ｎ 。 叫 ， 其 中使 用 最多 的为 ＨＰ Ｌ Ｃ 法 。由于大豆磷 脂中 Ｌ Ｐ Ｃ对紫外吸收较弱 ， 响应值差 异 很 大， 结 果 不稳 定；而 蒸发 光散 射检 测 器（ Ｅ Ｌ Ｓ Ｄ） 对 无 紫外 吸 收 及紫 外 吸 收较 弱成 分 检 测效 果 良好

HPLC法测定注射用前列地尔杂质前列腺素A1的方法学研究

HPLC法测定注射用前列地尔杂质前列腺素A1的方法学研究发表时间：2016-07-16T15:33:19.057Z 来源：《健康世界》2016年第11期作者：田建民1 陈青连1 冯洁2 [导读] 本方法简便、快速、灵敏，可有效检测前列腺素A1。

1杭州澳亚生物技术有限公司杭州 310018；2白杨街道社区卫生服务中心杭州 310018 摘要：目的验证HPLC法测定注射用前列地尔杂质前列腺素A1的方法。

方法采用 C18（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱，以乙腈-0.02mol/L磷酸二氢钾溶液（pH4.9）（40：60）为流动相，检测波长为214nm。

结果方法的专属性及耐用性良好；在前列腺素A1进样量为14.55～232.80ng范围内与色谱峰面积线性关系良好；平均回收率在99.6%～101.5%之间，相对标准差RSD为0.65%。

结论本方法简便、快速、灵敏，可有效检测前列腺素A1。

关键词：前列地尔；前列腺素A1；HPLC前列地尔是一种疗效确切的血管扩张药，是一种人体生理物质，有抑制血小板聚集、血栓素A2生成、动脉粥样脂质斑块形成及免疫复合物的作用，并能扩张外周和冠脉血管。

本研究拟对高效液相色谱法测定注射用前列地尔的有关物质前列腺素A1方法学的专属性进行验证。

1 仪器与试药仪器：Agilent 1200 高效液相色谱仪；色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；前列地尔对照品：中国食品药品检定研究院 140659-201203；前列腺素A1对照品：中国食品药品检定研究院 140790-201001；注射用前列地尔：杭州澳亚生物技术有限公司 13102023、13103123、13103125。

2 方法与结果参照《中国药典》2010年版二部注射用前列地尔标准的前列腺素A1检查项色谱条件进行。

2.1色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.02mol/L磷酸二氢钾溶液（pH4.9）（40：60）为流动相；检测波长为214nm；进样量为50μl。

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表 1 梯度洗脱程序表 Tab 1 Gradient elution program
时间（ time） / min 0. 01 3. 00 3. 01 8. 00 8. 01
12. 00 12. 01 15. 00
流动相（ mobile phase）
A/%
B/%
25
75
50
50
100
0
100
0
0
100
本文采用改进后的 HPLC － ELSD 法测定前列 地尔注射液中溶血磷脂酰胆碱含量，采用梯度洗脱 的方法，将溶血磷脂酰胆碱与杂质完全分离，主成分 峰形理想，结果准确，能够有效地评价和控制制剂的 质量。 1 仪器与试药
仪器： Waters 2695 高 效 液 相 色 谱 仪，Waters 2420 蒸发光检测器。
0
100
25
75
25
75
取对照品溶液，进样 5 μL，按原标准方法及本 方法依法测定，色谱图见图 1。由图 1 可见，改进后 的方法获得的色谱图峰形良好，可用于溶血磷脂酰 胆碱的定性、定量分析。
图 1 原标准方法（ A） 与改进方法（ B） 溶血磷脂酰胆碱色谱峰形比较图 Fig 1 Comparison diagram of lysophosphatidylcholine chromatographic peak by the original standard method （ A） and the improved method （ B） 1． 溶血磷脂酰胆碱（ lysophosphatidycholine）
关键词： 前列地尔； 溶血磷脂酰胆碱； 杂质检测； 高效液相色谱； 蒸发光散射检测（ ELSD） ； 梯度洗脱； 标准改进
中图分类号： Ｒ917
文献标识码： A

文章编号： 0254 － 1793（ 2014） 07 － 1291 － 05
Method improvement of lysophosphatidylcholine determination of alprostadil injection by HPLC － ELSD
第一作者 Tel： 13386877070； E － mail： lnyjwqy@ sina． com
— 1292 —
药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2014，34（ 7）
碱 峰 为 双 肩 峰 ，系 由 现 行 等 度 洗 脱 方 法 无 法 对 溶血磷脂酰胆碱的主成分及结构类似物完全分 离 所 致 ，无 法 准 确 积 分 ，导 致 结 果 的 判 定 缺 少 可 信性。
2. 2 供试品溶液的制备 取 5 支前列地尔注射液内容物混匀，精密量取
1 mL，置 10 mL 量瓶中，加正庚烷 － 异丙醇（ 1∶ 2） 稀 释至刻度，摇匀，即得。 3 色谱条件
采用硅胶柱（ Agilent LiChrosorb 5 Diol 250 mm × 4. 6 mm，二羟基丙基键合硅胶为填充剂） ，以正庚 烷 － 异丙醇 － 水（ 29. 5∶ 59 ∶ 11. 5） 为流动相 A，以正 庚烷 － 异丙醇（ 43∶ 57） 为流动相 B，进行梯度洗脱（ 见 表 1） ，流速 1. 0 mL·min －1 ，蒸发光散射检测器（ 飘移 管温度 60 ℃ ，载气流量 3. 2 L·min －1 ） ，柱温 35 ℃ 。
碱中的主要成分磷脂酰胆碱（ phosphatidylcholine， PC） 发生水 解，失 去 脂 肪 酸 后 生 成 的 杂 质［2］。如 果 其 浓 度 增 高，可 使 红 细 胞 膜 溶 解，可 以 诱 发 炎 症反应，增加氧化应激，干 扰 血 管 内 皮 功 能，破 坏 斑块稳定性［3］。按现行标准（ 国家食品药品监督 管理局标准 YBH01852009 ） 检 验 ，采 用 HPLC － ELSD 法 测 定 ，在 试 验 过 程 中 发 现 溶 血 磷 脂 酰 胆
样品： 某 企 业 提 供； 批 号： 20120510 （ 规 格： 2 mL ∶ 10 μg ） 、20120701 （ 规 格 2 mL ∶ 10 μg ） 、 20120701（ 规格 1 mL： 5 μg） 2 溶液的制备 2. 1 对照品溶液的制备
精密称取溶血磷脂酰胆碱对照品 10. 10 mg，置 50 mL 量瓶中，加正庚烷 － 异丙醇（ 1∶ 2） 溶解并稀释 至刻度，摇匀，即得。
4. 2 分离度考察试验 溶血磷脂酰胆碱为磷脂酰胆碱的降解产物，故
以溶血磷脂酰胆碱和磷脂酰胆碱的混合溶液考察系 统的分离度。取磷脂酰胆碱对照品 20. 12 mg，加溶 剂正 庚 烷 － 异 丙 醇 （ 1 ∶ 2 ） 10 mL 溶 解，摇 匀，取 1 mL，加溶血磷脂酰胆碱对照品溶液 1 mL，混匀，进 样 5 μL。溶血磷脂酰胆碱与磷脂酰胆碱色谱峰能 够完全分开，色谱图见图 3。 4. 2 专属性考察 4. 2. 1 酸破坏溶液 取样品 1 mL，置 10 mL 量瓶 中，加三氟乙酸 1 滴，摇匀，室温放置 30 min，加三乙 胺 1 滴，加 正 庚 烷 － 异 丙 醇 （ 1 ∶ 2 ） 至 刻 度，摇 匀， 即得。 4. 2. 2 碱破坏溶液 取样品 1 mL，置 10 mL 量瓶
图 3 分离度考察色谱图 Fig 3 The separation degree of chromatogram 1． 磷脂酰胆碱 （ phosphatidylcholine） 2． 溶血磷脂酰胆碱 （ lysophosphatidycholine）
中，加三乙胺 1 滴，摇匀，60 ℃ 水浴放置 2 h，放冷， 加三氟乙酸 1 滴，加正庚烷 － 异丙醇（ 1∶ 2） 至刻度， 摇匀，即得。 4. 2. 3 氧化破坏溶液 取样品 1 mL，置 10 mL 量 瓶中，加 30% 过氧化氢溶液 0. 1 mL，80 ℃ 水浴放置 5 h，放冷，加正庚烷 － 异丙醇（ 1 ∶ 2 ） 至刻度，摇匀， 即得。 4. 2. 4 高温破坏溶液 取样品 1 mL，置 10 mL 量 瓶中，110 ℃ 加热 3 h，放冷，加正庚烷 － 异丙醇（ 1∶ 2） 至刻度，摇匀，即得。 4. 2. 5 光照破坏溶液 取样品 1 mL，置 10 mL 透 明量瓶中，4500 lx 下照射 8 d，加正庚烷 － 异丙醇 （ 1∶ 2） 至刻度，摇匀，即得。
WANG Quan － yi，JIAO Xiao － man
（ Institute for Drug Control of Liaoning Province，Shenyang 110023，China）
Abstract Objective： To develop a new method for lysophosphatidycholine （ LCP） determination of alprostadil injection． Methods： The assay was carried out on a Silica gel column （ dihydroxypropyl bonded silica as a filler） with the mobile phase of n － heptane － isopropanol － water（ 29. 5 ∶ 59 ∶ 11. 5 ） and n － heptane － isopropanol（ 43 ∶ 57 ） at a gradient with a flow rate of 1. 0 mL·min －1 ． The column temperature was 35 ℃ ． The drift tube temperature of the evaporative light scattering detector was 60 ℃ and the carrier gas flow rate was 3. 2 L·min － 1 ． Ｒesults： The linear range of lysophosphatidycholine was good between 0. 2 － 1. 8 μg（ r = 0. 9995 ） ，and the average recovery was 100. 2 % （ n = 9 ） ； the repeatability，specificity，stability of the test solution were good， and there was no interference among the components． Conclusion： The new HPLC method is good in the aspect of selectivity，sensitivity and accuracy，and can be used to replace the detection method for lysophosphatidycholine in alprostadil injection． Key words： alprostadil； lysophosphatidycholine（ LCP） ； impurity detection； HPLC； ELSD； gradient elution； standard improvement
剂） ，以正庚烷 － 异丙醇 － 水（ 29. 5∶ 59∶ 11. 5） 为流动相 A，以正庚烷 － 异丙醇（ 43 ∶ 57） 为流动相 B，进行梯度洗脱，流速为 1. 0 mL·min － 1 ，蒸发光散射检测器（ 飘移管温度 60 ℃ ，载气流量 3. 2 L·min － 1 ） ，柱温为 35 ℃ 。结果： 溶血磷脂酰胆碱进样量
试药： 溶血磷脂酰胆碱对照品（ 来源： Sigma； 批 号： BCBD9043V； 纯度： 99. 0% ） ，磷脂酰胆碱对照品 （ 来 源： Doosan Corporation； 批 号： CP21010； 纯 度： 100. 0% ） ，正庚烷（ 来源： 天津市科密欧化学试剂有 限公司； 批号： 120762 － 5； 色谱纯） ，异丙醇（ 来源： 天津市四友精细化学品有限公司； 批号： 401302 － 02887； 色谱纯） ，三氟乙酸、三乙胺、过氧化氢均为 分析纯，水为超纯水。