流式细胞术(上)

流式细胞术（FCM）的工作原理及其在免疫学上的应用摘要：流式细胞术(flow cytometry，FCM)是一种可对单细胞进行快速定性、定量分析的新技术。

它借鉴了荧光标记技术、激光技术、单抗技术和计算机技术，具有极高的检测速度与统计精确性，而且从单一细胞可以同时测得多个参数。

随着其分析技术和方法的日臻完善，流式细胞术在临床免疫及科学研究上发挥了非常重要的作用。

本文对流式细胞术的工作原理进行了概括介绍，并对其在免疫学等方面的应用进行了综述，展示了FCM 在免疫学上应用的广阔前景。

关键词：流式细胞术；流式细胞仪；工作原理；免疫学；应用；应用前景流式细胞术(FCM)是70年代发展起来的一种快速对单细胞或微粒定量分析和分选的新技术。

其检测速度之快，统计学精度之高，是其他的方法无可比拟的，可同时从一个细胞中测得多种参数(如DNA、R N A、蛋白质、细胞体积等)进行多参数分析。

流式细胞仪是近代细胞生物学、分子生物学、分子免疫学和单克隆技术、激光技术、电子计算机术等学科高度发展的结晶，在血液学、肿瘤学等学科尤其是在免疫学方面得到广泛应用[1]。

近年来，随着流式细胞免疫学技术的迅速发展，流式细胞术与单克隆抗体技术结合，使细胞表面和细胞内抗原，癌基因蛋白及膜受体的定量检测取得了很大进展。

流式免疫技术克服了普通免疫学方法难以准确定量的不足，形成了流式免疫学独特的科学分支，成为研究细胞免疫学的先进技术之一。

随着科学技术的发展，多种新的荧光探针的不断出现，使FCM技术的应用范围不断扩大，特别是各种各样的荧光探针标记的单克隆抗体和其他蛋白质的出现，为FCM 研究各种组织细胞膜和细胞内抗原、肿瘤性蛋白等开辟了新途径[2]。

1 .流式细胞术与流式细胞仪1.1流式细胞技术：流式细胞技术是以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微球，测量其产生的散射光和发射荧光的强度；经染色的细胞或微球在悬液中以单行流过高强度光源的焦点，当每个细胞或微球经过焦点时，发出一束散射光/或荧光；它们经过过滤及光镜系统收集到达一个光电检测器光电倍增管或一个固态装置），光检测器把散射光定量转化成电信号，经数字转换器进行数字化后而成整数，然后进行电子存储，以后数据可以调出显示和进行分析；并可能将感兴趣的细胞进行分选[3]。

流式细胞术科技名词定义中文名称：流式细胞术英文名称：flow cytometry assay;flow cytometry;FCM其他名称：荧光激活细胞分选法(fluorescence-activated cell sorting,FACS)定义1：一种细胞分选或分析技术。

即以荧光素标记抗体结合相应细胞，用激光束激发单行流动的细胞，根据细胞所携带荧光(强度或类别)进行分选或分析。

测和诊断（三级学科）定义2：一种对悬液中细胞、微生物或细胞器等进行单个快速识别、分析和分离的技术。

用以分析细胞大小、细胞周期、DNA含量、细胞表面分子以及进行细胞分选等。

应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科）定义3：用荧光剂对细胞特定成分染色，利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，并能对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。

应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞生物学技术（二级学科）流式细胞术（Flow CytoMeter，FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。

简介一种在液流系统中，快速测定单个细胞或细胞器的生物学性质，并把特定的细胞或细胞器从群体中加以分类收集的技术。

其特点是通过快速测定库尔特电阻、荧光、光散射和光吸收来定量测定细胞DNA含量、细胞体积、蛋白质含量、酶活性、细胞膜受体和表面抗原等许多重要参数。

根据这些参数将不同性质的细胞分开，以获得供生物学和医学研究用的纯细胞群体。

目前最高分选速度已达到每秒钟3万个细胞。

特点1.测量速度快；2.可进行多参数测量；3.是一门综合性的高科技方法（FCM 综合了光学，电子学，流体力学，细胞化学，免疫学，激光和计算机等多门学科和技术）；4.既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。

流式细胞术的基本原理流式细胞术（Flow cytometry）是一种被广泛用于生物学和医学领域的细胞分析和排序技术。

该技术采用激光离子流和散射光学的原理，快速测定单个细胞的生物学和物理特性。

该技术不仅可以进行细胞计数、大小、形态特征、表面结构、细胞周期、代谢活性、细胞分化和生长状态等分析，还可以进行单细胞分选和纯化以及细胞染色体分析等研究。

基本原理流式细胞术的原理是通过射流将单个细胞迅速送入激光束中，该激光束激发细胞中的荧光染料和标记物或散射光学特性，进而检测细胞的光学信号，并进行信号转换和数字化处理，最终得到单个细胞的特异性指标。

流式细胞术的主要组成部分包括样品处理系统、流式细胞分析系统和数据分析系统。

样品处理系统：将细胞样品经过预处理、染色或标记，使其适用于流式细胞分析。

常用的样品预处理方法包括：细胞分离、染色、去除细胞碎片和去除红细胞等。

对于需要分选的细胞，还需要使用细胞排序技术分离目标细胞。

流式细胞分析系统：该系统包括激光、光电倍增管、光学透镜、光学滤波器、样品输送系统和电子系统等。

通过激光激发样品中的荧光染料或标记物，分析细胞的光学特性。

常用的荧光染料包括：FITC、PE、APC、PerCP、Cy5等。

常用的标记物包括：抗体、细胞因子、小分子荧光探针、DNA荧光探针等。

通过修改流式细胞分析仪的配置，可实现不同荧光染料和标记物的测定。

数据分析系统：流式细胞仪测定数据的处理和分析是采用计算机系统完成的。

数据分析的常用指标包括：细胞计数、细胞孔径（大小）、荧光强度（比例和强度）、散射特性等。

一般情况下，在细胞的某个特定荧光标记物上测定的强度与其他群体相比，该指标被用来区分并描述细胞。

流式细胞术的应用流式细胞术被广泛应用于生物医学研究和诊断中。

以下是一些常见的应用领域：1. 分析细胞表面和胞内蛋白表达：通过荧光共轭的抗体和标记物来测定单个细胞膜和胞内蛋白的表达量和分布，从而确定细胞分化状态和生理状态。

流式细胞术流式细胞术(flow cytometry)是利用流式细胞仪(flow cytometer)快速定量分析细胞群的物理化学特征以及根据这些物理化学特征精确分选细胞的新技术。

流式细胞仪通过接收激光照射后液流内细胞的散射光信号和荧光信号反映细胞的物理化学特征，如细胞的大小、颗粒度和抗原分子的表达情况等。

原理：流式细胞术是特定波长的激光束直接照射到高压驱动的液流,产生的光信号被多个接收器接收,一个是在激光束直线方向上接收到的散射光信号(前向角散射),其他是在激光束垂直方向上接收到的光信号,包括散射光信号(侧向角散射)和荧光信号。

液流中悬浮的直径从0.2~150μm的细胞能够使激光束发生散射光,细胞上结合的荧光素被激光激发后能够发射荧光。

散射光信号和荧光信号被相应的接收器接收,根据信号的强弱波动就能反映出每个细胞的物理化学特征。

三大要素：流式细胞术有三大要素,分别为流式细胞仪、样品细胞和荧光染料或者荧光素偶联抗体。

流式细胞术是在流式细胞仪上操作的,流式细胞仪根据其功能的不同可以分为分析型流式细胞仪和分选型流式细胞仪,前者只能流式分析,不能分选纯化目标细胞,后者能够同时进行流式分析和流式分选。

检测对象：流式细胞术检测的对象是细胞,而且是呈独立状态的悬浮于液体中的细胞,即单细胞悬液。

流式细胞术不能直接检测组织块中的细胞，要检测脏器或组织中的细胞,必须先用各种方法将脏器或组织制备成单细胞悬液,然后标记上荧光素偶联抗体,才能被流式细胞仪检测。

流式细胞术不能直接检测分子,但是用人工合成的颗粒代替细胞,然后将该分子的抗体与人工颗粒结合，可以间接检测分子,如用CBA法检测细胞因子等。

流式细胞术可以定量检测样品细胞的物理化学特征,其定量是以光信号为基础的,通过分析接收到的激光照射到细胞后的散射光信号和荧光信号完成定量分析。

样品细胞只有标记荧光染料或者荧光素偶联抗体进而被激光照射后才能发射荧光信号,从而得到样品细胞表达某抗原分子强弱情况等化学特征,否则只能通过分析散射光信号得到样品细胞体积大小和颗粒度等物理特征。

流式细胞术一. 流式细胞术概述流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,•它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。

它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA 含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度＞95%。

在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。

国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)。

流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。

BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL, B-D•公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。

EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur 是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能外,还具有细胞分选功能,•多用于科学研究。

二.流式细胞仪主要技术指标1．流式细胞仪的分析速度：一般流式细胞仪每秒检测1000～ 5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。

2．流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上<600个荧光分子,两个细胞间的荧光差＞5%即可区分。

3．前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～０.5μm。

4．流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，,一般流式细胞仪能够达到<2.0%,这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。