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2015年版《中国药典》无菌检查法解读杨晓莉;李辉;绳金房;钱维清;胡昌勤【摘要】目的解读2015年版《中国药典》无菌检查法的主要增修订情况.方法对比2015年版《中国药典》无菌检查法与2010年版《中国药典》无菌检查法的主要差异.结果 2015年版《中国药典》无菌检查法在检查内容、检查方法、培养体系及质量控制理念等方面都作了较大修订.结论 2015年版《中国药典》将无菌检查法完善成为更加科学并与国际接轨的检查方法.【期刊名称】《中国药业》【年(卷),期】2015(024)024【总页数】5页(P7-11)【关键词】无菌检查法;2015年版《中国药典》;无菌药品;培养体系;质量控制【作者】杨晓莉;李辉;绳金房;钱维清;胡昌勤【作者单位】陕西省食品药品检验所,陕西西安 710065;陕西省食品药品检验所,陕西西安 710065;陕西省食品药品检验所,陕西西安 710065;上海市食品药品检验所,上海 201203;中国食品药品检定研究院,北京 100050【正文语种】中文【中图分类】R954;R921.2无菌检查法是指用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的方法［1］，是药品微生物检查体系的重要组成部分，药品微生物是关系药品安全性的关键指标之一。
无菌药品的微生物污染是影响药品生产质量和引发临床不良事件的主要因素，近年来发生的“欣弗事件及刺五加事件”等严重药害事件都是无菌药品的微生物污染导致［2］。
目前，美国、欧盟、日本等国家或组织无菌检查法已协调一致［3］。
2010年版《中国药典》及之前版本收录的无菌检查法与国际通用的标准在检查理念、培养体系、方法要求等诸多方面有显著差异。
在国家药品安全规划与标准提高的目标下，2015年版《中国药典》借鉴国外药典先进技术经验，以新的控制理念为指导，结合我国国情对无菌检查法的检测范围及环境要求、培养体系、方法适用性、检查方法、偏差调查与过程控制等方面都做了较大修订，进一步完善了无菌检查法，修订后的无菌检查法正逐步与国际通用标准一致。
1101 无菌检查法无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。
若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。
无菌检查应在无菌条件下进行，试验环境必须达到无菌检查的要求，检验全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区、工作台面及环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度确认。
隔离系统应定期按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。
日常检验还需对试验环境进行监控。
培养基硫乙醇酸盐流体培养基主要用于厌氧菌的培养，也可用于需氧菌培养；胰酪大豆胨液体培养基用于真菌和需氧菌的培养。
培养基的制备及培养条件培养基可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基或成品培养基。
配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
制备好的培养基应保存在2～25℃、避光的环境，若保存于非封闭容器中，一般在3周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。
1. 硫乙醇酸盐流体培养基胰酪胨15.0g 氯化钠2.5g酵母浸出粉 5.0g 新配制的0.1% 刃天青溶液1.0ml无水葡萄糖 5.0g 琼脂0.75gL-胱氨酸0.5g 水1000ml硫乙醇酸钠0.5g（或硫乙醇酸）(0.3ml)除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH，使灭菌后在25℃的pH值为7.1±0.2。
分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2。
灭菌。
在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟），迅速冷却，只限加热一次，并防止污染。
精品 -可编辑- 编号：FAL-YZ-003.1
无菌检查方法 验证报告
编制/日期 审核/日期 评审会签 姓名 部门 职务 评审意见 日期
批准/日期 科技发展有限公司 精品
-可编辑- 目 录 序号 内容 页号 1 目的 1 2 范围 1
3 依据 1 4 职责权限 1 5 验证方法 2 6 验证结论 5 7 附录 6 精品
-可编辑- 无菌检查方法验证报告
1.目的 通过对培养基无菌性检查、灵敏度检查，对产品的无菌检查方法适用性进行试验，证明该方法适用于产品无菌检查日常检测。 2.范围 适用于本公司产品的无菌检查方法的建立和确认。 3．依据 中国药典（2015年版） GB/T14233.2-2005 医用输液、输血、注射器具检验方法 第2部分：生物学实验方法 4. 职责权限 姓名 部门 分工职责 组长：组织确认或验证工作，批准方案和报告 负责编制方案、实施、总结报告及微生物检测 负责设备样品提供, 配合实施方案的工作 负责微生物检测 5. 验证方法 实验前的准备 a仪器设备 精品
-可编辑- 设备名称 设备编号 证书编号 设备 状态 压力蒸汽灭菌器 10-11-53 京海字第12004119号 □未检定 □己检定在有效期内
激光尘埃粒子计数器 Y09-3016 H212C-O1040 □未检定 □己检定在有效期内 温湿度计 JWS-A3 B812Z-A0571号 □未检定 □己检定在有效期内 微压差表 B10093624 B712C-E0083号 □未检定 □己检定在有效期内 微压差表 B10090070 B712C-E0076号 □未检定 □己检定在有效期内 细菌培养箱 SPX-100B-Z 京海字第11042604号 □未检定 □己检定在有效期内
霉菌培养箱 MLX-150-1 京海字第11042605号 □未检定 □己检定在有效期内 确认人： 日期： b操作环境 微生物限度检查应在环境洁净度10000 级下的局部洁净度100 级的单向流空 气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。 c稀释液和试剂： PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 d器具 无菌注射器 仪液器 YT－603集菌仪 精品 -可编辑- 5.1培养基的适用性检查 无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基及胰胳大豆胨肉汤培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。 培养基：硫乙醇酸盐 批号20140408 生产厂家：青岛日水生物技术有限公司 胰胳大豆胨肉汤培养基 批号20151023 生产厂家：青岛尼赛欣合生物技术有限公司
5.1.1无菌性检查：每批培养基随机取不少于 5 支（瓶），培养 14 天，应无菌生长。 5.1.2灵敏度检查 菌种：培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过 5 代（从菌种保存中心 获得的冷冻干燥菌种为第 0 代），试验用菌种应采用适宜的菌种保存技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC(B) 26 003〕 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 〔CMCC(B) 10 104〕 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）〔CMCC（B）63 501〕 生孢梭菌(Clostridium sporogenes)〔CMCC(B) 64 941〕 白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC(F) 98 001〕 黑曲霉(Aspergillus niger) 〔CMCC(F) 98 003〕 5.1.3菌液制备 精品 -可编辑- 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉微生物培养基质控品,使用前注入1.1ml稀释液充分溶解后,在漩涡混合器上震荡混匀,制成10-100 cfu/0.1ml菌悬液,3-5天内用完。 5.1.4培养基接种 取每管装量为12ml 的硫乙醇酸盐流体培养基7支，分别接种小于100 cfu 的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌各2 支，另1支不接种作为空白对照，培养3 天； 取每管装量为9ml的胰胳大豆胨肉汤培养基7支,分别接种小于100 cfu 的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2 支，另1 支不接种作为空白对照，培养5 天。逐日观察结果。 5.1.5结果判定 空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。 见附件无菌培养基的适用性检查记录 5.2无菌检查方法验证试验 5.2.1当建立产品的无菌检查法时，应进行方法的验证，以证明所采用的方法适合于本产品的无菌检查。若本产品的组分或原检验条件发生改变时，检查方法应重新验证。验证时，按“中国药典2015版四部1101无菌检查法”的规定进行操作。对每一试验菌应逐一进行验证。 5.2.2菌种及菌液制备 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉同培养基灵敏度检查。 5.2.3薄膜过滤法 5.2.3.1FAL胶无菌检测:使用YT－603集菌仪，滤膜孔经不大于0.45µｍ。 A样品组：取1ml医用胶缓慢滴入100ml氯化钠蛋白胨缓冲液中，使其固化成白色胶膜充分冲洗振荡1分钟，制成样品组供试液，取一幅二联式集菌培养器，精品 -可编辑- 将样品组供试液平均通过每只集菌培养器过滤，再用100ml氯化钠蛋白胨缓冲液冲洗，然后通过集菌仪每只集菌培养器加入100ml胰胳大豆胨肉汤培养基或硫乙醇酸盐培养基，后每只加入10～100cfu试验菌，做为样品组。
B中和剂对照组：取一幅二联式集菌培养器，将100ml氯化钠蛋白胨缓冲液平均通过每只集菌培养器过滤，然后通过集菌仪每只集菌培养器加入100ml胰胳大豆胨肉汤培养基、或硫乙醇酸盐培养基，后每只加入10～100cfu试验菌，做中和剂对照组。 C阳性对照组（菌液组）：取一幅二联式集菌培养器，通过集菌仪每只集菌培养器加入100ml胰胳大豆胨肉汤培养基、或硫乙醇酸盐培养基，后每只加入10～100cfu试验菌，做为阳性对照组。 D阴性对照：另取一幅二联式集菌培养器，通过集菌仪一只通过100ml胰胳大豆胨肉汤培养基，另一只通过100ml硫乙醇酸盐培养基， 作为阴性对照。 5.2.3结果判断 样品组与中和剂对照组微生物生长浓度相似，表明中和剂的中和方式有效消除了样品的抑菌性（即有效性），如对照组与阳性对照的微生物浓度相似，表明样品预处理，消除样品抑菌性的方法，检测程序和培养条件等均不影响微生物生长（即无毒性）。阴性对照无菌生长。否则实验无效。 6.验证结论 通过培养基无菌性检查、培养基灵敏度检查、无菌检查方法验证，结果表明，制定的无菌检查方法适用本公司的产品。 精品
-可编辑- 无菌检查方法验证试验记录 编号：ZJ/JL-8.2.4-4-10 序号： 样品名称： 样品批号： 检测日期： 样品数量： 试验方法：依据《中国药典》2015年版 四部 1101 无菌检查法：方法验证试验 □ 薄膜过滤法 □ 直接接种法
硫乙醇酸盐流体培养基：（30～35℃ 培养3天） 1样品组 2中和剂对照组 3菌液组 现象描述 培养天数 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
金黄色葡萄球菌 铜绿假单孢菌 生孢梭菌 阴性对照 精品 -可编辑- 注：“+”为生长，“-”为不生长 胰酪大豆胨豆汤培养基：（20～25℃ 培养5天）
1样品组 2中和剂对照组 3菌液组 现象描述 培养天数 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 枯草芽孢杆菌
白色
念珠菌 黑曲霉 阴性对照 工作台环境（CFU/皿） 碟号 24小时 48小时 平均菌落数 结论
1 2 3
结论： 检验者： 复核者： 复核日期： 无菌培养基的适用性检查记录
编号：ZJ/JL-8.2.4-4-9 培养基：1. 硫乙醇酸盐流体培养基 批号：_______________ 检验日期： 2. 胰酪大豆胨豆汤培养基 批号：_______________ 完成日期： 以上均为符合药典规定的干燥培养基。 一、培养基的无菌性检查 培养温度：硫乙醇酸盐流体培养基 ℃ 胰酪大豆胨豆汤培养基 ℃ 培养基 名称 管数 培养时间（天） 备注 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 精品 -可编辑- 硫乙醇酸盐流体 培养基 1 2 3 4 5
胰酪大豆胨豆汤培养基 1 2 3 4 5 结论 注：“+”为生长，“-”为不生长 二、培养基的灵敏度检查 1. 菌液制备： （1）金黄色葡萄球菌新鲜肉汤培
养物 [CMCC(B)26003] 第_____代
注入1.1ml稀释液充分深解后，在漩涡混合器上震荡混匀. 至_______含菌量
_______CFU/0.1ml
（2）枯草芽孢杆菌新鲜肉汤培养物1ml [CMCC(B)63501]第_____代
注入1.1ml稀释液充分深解后， 在漩涡混合器上震荡混匀. 至_______含菌量
_______CFU/0.1ml
（3）铜绿假单胞菌新鲜肉汤培养物1ml [CMCC(B) 10104]第_____代
注入1.1ml稀释液充分深解后， 在漩涡混合器上震荡混匀. 至_______含菌量
_______CFU/0.1ml
（4）生孢梭菌新鲜硫乙醇酸盐培养物 [CMCC(B)64941]第_____代
注入1.1ml稀释液充分深解后， 在漩涡混合器上震荡混匀. 至_______含菌量
_______CFU/0.1ml
