柱层析、固相萃取和制备色谱共56页文档

固相萃取技术原理及应用一、固相萃取基本原理与操作1、固相萃取吸附剂与目标化合物之间的作用机理固相萃取主要通过目标物与吸附剂之间的以下作用力来保留/吸附的1）疏水作用力：如C18、C8、Silica、苯基柱等2）离子交换作用：SAX, SCX，COOH、NH2等3）物理吸附：Florsil、Alumina等2、p H值对固相萃取的影响pH值可以改变目标物/吸附剂的离子化或质子化程度。

对于强阳/阴离子交换柱来讲，因为吸附剂本身是完全离子化的状态，目标物必须完全离子化才可以保证其被吸附剂完全吸附保留。

而目标物的离子化程度则与pH值有关。

如对于弱碱性化合物来讲，其pH值必须小于其pKa值两个单位才可以保证目标物完全离子化，而对于弱酸性化合物，其pH值必须大于其pKa值两个单位才能保证其完全离子化。

对于弱阴/阳离子交换柱来讲，必须要保证吸附剂完全离子化才保证目标物的完全吸附，而溶液的pH值必须满足一定的条件才能保证其完全离子化。

3、固相萃取操作步骤及注意事项针对填料保留机理的不同（填料保留目标化合物或保留杂质），操作稍有不同。

1）填料保留目标化合物固相萃取操作一般有四步（见图1）：Ø 活化---- 除去小柱内的杂质并创造一定的溶剂环境。

（注意整个过程不要使小柱干涸）Ø 上样---- 将样品用一定的溶剂溶解，转移入柱并使组分保留在柱上。

（注意流速不要过快，以1ml/min为宜，最大不超过5ml/min）Ø 淋洗---- 最大程度除去干扰物。

（建议此过程结束后把小柱完全抽干）Ø 洗脱---- 用小体积的溶剂将被测物质洗脱下来并收集。

（注意流速不要过快，以1ml/min为宜）如下图1:2）填料保留杂质固相萃取操作一般有三步（见图2）：Ø 活化--除去柱子内的杂质并创造一定的溶剂环境。

（注意整个过程不要使小柱干涸）Ø 上样--将样品转移入柱，此时大部分目标化合物会随样品基液流出，杂质被保留在柱上，故此步骤要开始收集（注意流速不要过快）Ø 洗脱---用小体积的溶剂将组分淋洗下来并收集，合并收集液。

柱层析的分离原理和分离步骤：
柱层析是一种广泛应用于化学和生物学领域中的分离技术，其基本原理是利用混合物中各组分物理化学性质的差异，如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等，使各组分在固定相和流动相之间进行不同的分配和移动速度，从而达到分离的目的。

在柱层析中，固定相通常是由不溶性基质形成，如硅胶、大孔吸附树脂、聚酰胺等，而流动相则是由溶剂组成。

样品被加到柱子上后，用流动相洗脱，在洗脱过程中，样品中的各组分根据其在固定相和流动相中的分配系数不同，经历多次反复的吸附、解吸、再吸附、再解吸过程，最终实现分离。

柱层析的操作方式主要包括常压分离、减压分离和加压分离，其中，常压分离是最简单的分离模式，适用于大于50-100g的产品，但洗脱时间较长；减压分离可以节省填料的使用量，但由于大量的空气通过填料会使溶剂挥发，且有时易分解的化合物难以得到；加压分离可以加快淋洗剂的流动速度，缩短样品的洗脱时间。

固相萃取柱知识点固相萃取柱是一种常用的分离和纯化技术，广泛应用于化学、生物、环境等领域的样品前处理中。

它基于固体相对溶液中溶质有选择性吸附的原理，通过固相材料填充在柱子中，将待分离的物质吸附在固相上，并通过洗脱，实现物质的分离和纯化。

知识点一：固相材料的选择固相材料是固相萃取柱中的关键组成部分，它决定了固相萃取柱的选择性和吸附能力。

常见的固相材料主要包括硅胶、活性炭、聚酸酯、氨基酸、离子交换树脂等。

不同的固相材料对不同的分析物有不同的选择性和亲合性，因此选择合适的固相材料很重要。

知识点二：固相萃取柱的基本原理知识点三：固相萃取柱的工作原理固相萃取柱的工作原理分为两个过程：吸附过程和洗脱过程。

吸附过程是目标物质从液相中被固相材料吸附的过程，吸附程度取决于固相材料的选择性和目标物质与固相材料之间的相互作用。

洗脱过程是用洗脱剂将吸附在固相材料上的目标物质从固相材料上洗脱下来，洗脱程度取决于洗脱剂和目标物质之间的相互作用。

知识点四：固相萃取柱的使用方法固相萃取柱的使用方法通常包括样品预处理、样品加载、洗脱、回收等步骤。

样品预处理包括对样品的前处理，如样品溶解、提取、浓缩等。

样品加载是将预处理好的样品通过固相柱进行加载，使目标物质被固相材料吸附。

洗脱步骤是将洗脱剂通过柱子冲洗，将目标物质从固相材料上洗脱下来。

回收步骤是将洗脱液收集，可进行进一步的分析和检测。

知识点五：固相萃取柱的应用领域固相萃取柱广泛应用于化学、生物、环境等领域。

在化学领域，固相萃取柱常用于样品前处理，如药物分析、环境污染物分析等。

在生物领域，固相萃取柱常用于样品纯化和富集，如蛋白质纯化、DNA提取等。

在环境领域，固相萃取柱常用于水样、土壤样品的前处理和分析。

总结：固相萃取柱是一种常用的分离和纯化技术，通过固相材料与待分离物质的选择性吸附和洗脱，实现样品的分离和纯化。

固相萃取柱的选择和使用方法对于样品处理和分析结果的准确性和可靠性非常重要。

在2003版的“食品卫生检测方法”标准系列中，有一个较大的改动就是很多项目，尤其是农药项目的前处理普遍使用了固相萃取技术（详见表1 ）。

现针对这一技术的原理、使用和误区进行探讨。

一．固相萃取技术简介固相萃取（Solid Phase Extraction，简称SPE）技术，发展于上世纪70年代，由于其具有高效、可靠、消耗试剂少等优点，在许多领域取代了传统的液－液萃取而成为样品前处理的有效手段。

一些传统的介绍SPE的书籍将其归于一个液相色谱的原理，这其实是引起使用不当的主要源由之一。

把SPE小柱看作一根液相色谱柱，不如把它看成单纯的萃取剂更合适，因为：液相色谱的重点在于分离，而SPE的重点在于萃取。

固相萃取技术在样品处理中的作用分两种：一是净化，二是富集,这两种作用可能同时存在。

固体萃取和液－液萃取相比，其长处在于方便和消耗试剂少，短处在于批次间的重复性难以保证。

出现这种情况的原因在于：液体试剂的重复性好，只要其纯度可靠，不同年代的产品的物理化学性质都是可靠的。

而固体萃取剂就算保证了纯度外，还存在着颗粒度的差异，外形的差异等液体试剂不存在的且难以衡量的因素，不同年代不同批号的萃取性质可能会有较大的区别。

从理论上和厂家宣传来看，固相萃取应该在色谱分析的前处理上得到很好的应用：有机溶剂用得很少，可批量处理样品，既可富集，又能除杂质，给人印象是前处理的革命性进步。

然而现实情况，起码在国内，虽然推广了多年，实际应用还是相当有限。

SPE应用得不广，与我们的使用方式和期望有关，也与它本身的局限有关。

对于供应商来说，从经济利益出发，向来都是忽略固相萃取的局限与不足。

固相萃取可以作为前处理手段的一个很好补充，但是在使用时，一定要清醒知道到它的优点和缺点，注意因地制宜，扬长避短。

二、固相萃取的应用优势在什么项目的前处理适合使用固相萃取技术，即用固相萃取会比普通的溶剂萃取更理想，个人认为有以下几种情况：（一）水中有机物的前处理。

柱层析柱层析操作方法的选择柱层析，又称柱色谱分离,是利用层析柱将混合物各组分分离开来的操作过程称为柱层析。

柱层析是层析技术中的一类，依据其作用原理又可分为吸附柱层析、分配柱层析和离子交换柱层析等。

其中以吸附柱层析应用最广。

以下只介绍吸附柱层析的相关问题。

目前,柱色谱分离的操作方式 ,主要包括常压分离、减压分离和加压分离 3种模式。

常压分离是最简单的分离模式方便、简单 ,但是洗脱时间长。

减压分离尽管能节省填料的使用量,但是由于大量的空气通过填料会使溶剂挥发 ,并且有时在柱子外面会有水汽凝结,以及有些易分解的化合物也难以得到 ,而且还必须同时使用水泵或真空泵抽气。

柱子规格的选择市场上有各种规格的柱层析分离柱。

柱子长了 ,相应的塔板数就高 ,分离就好。

目前市场上的柱子 ,其径高比一般在1: 5～15范围 ,在实际使用时 ,填料量一般是样品量的30～50倍,具体的选择要根据样品的性质和含量进行具体分析。

如果所需组分和杂质的分离度较大 ,就可以减少填料量,如果 Rf相差不到0.1,就要加大柱子,增加填料量。

装柱柱层析色谱柱的填装主要有湿法和干法两种,湿法省事,一般用淋洗剂溶解样品,也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等,但溶剂越少越好,不然溶剂就成了淋洗剂了。

柱子底端的活塞一定不要涂润滑剂,否则会被淋洗剂带到淋洗液中 ,可以采用聚四氟乙烯材料的阀门。

另一种是将玻璃管下端拉细，套上一段弹性良好的管子。

这段管子必须是不能被淋洗剂溶解的，普通橡皮管一般不可充作此用，因为橡皮易被氯仿、苯、THF等溶剂溶胀，而聚乙烯管子对大多数溶剂是惰性的，所以常常使用。

干法和湿法装柱没什么实质性差别,只要能把柱子装实就行。

装完的柱子应该有适度的紧密(太密了淋洗剂流速太慢) ,并且一定要均匀,不然样品就会从一侧斜着流动。

同时柱中不能有大气泡,大多数情况下有些小气泡没太大的影响,因为只要加压气泡就可消失。

但是柱子更忌讳的是开裂 ,开裂会影响分离效果 ,甚至报废。

1、使用阳离子固相萃取柱前为什么要用甲醇和水活化要是使用的是高聚物基质的阳离子柱，可直接上样，不用活化，要是使用的是硅胶基质的阳离子柱，活化是为了打开键合在硅胶上的碳基团链，使之充分发生作用，甲醇是为了与碳链互溶，用水过度是为了能和样品溶液相溶。

2、固相萃取技术原理及应用一、固相萃取基本原理与操作1、固相萃取吸附剂与目标化合物之间的作用机理固相萃取主要通过目标物与吸附剂之间的以下作用力来保留/吸附的1）疏水作用力：如C18、C8、Silica、苯基柱等2）离子交换作用：SAX, SCX，COOH、NH2等3）物理吸附：Florsil、Alumina等2、p H值对固相萃取的影响pH值可以改变目标物/吸附剂的离子化或质子化程度。

对于强阳/阴离子交换柱来讲，因为吸附剂本身是完全离子化的状态，目标物必须完全离子化才可以保证其被吸附剂完全吸附保留。

而目标物的离子化程度则与pH值有关。

如对于弱碱性化合物来讲，其pH值必须小于其pKa值两个单位才可以保证目标物完全离子化，而对于弱酸性化合物，其pH值必须大于其pKa值两个单位才能保证其完全离子化。

对于弱阴/阳离子交换柱来讲，必须要保证吸附剂完全离子化才保证目标物的完全吸附，而溶液的pH值必须满足一定的条件才能保证其完全离子化。

3、固相萃取操作步骤及注意事项针对填料保留机理的不同（填料保留目标化合物或保留杂质），操作稍有不同。

1）填料保留目标化合物固相萃取操作一般有四步（见图1）：Ø 活化---- 除去小柱内的杂质并创造一定的溶剂环境。

（注意整个过程不要使小柱干涸）Ø 上样---- 将样品用一定的溶剂溶解，转移入柱并使组分保留在柱上。

（注意流速不要过快，以1ml/min为宜，最大不超过5ml/min）Ø 淋洗---- 最大程度除去干扰物。

（建议此过程结束后把小柱完全抽干）Ø 洗脱---- 用小体积的溶剂将被测物质洗脱下来并收集。