第七章色谱分离技术凝胶筛分

凝胶色谱法 添加摘要 凝胶色谱法又叫凝胶色谱技术，是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。

凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。

凝胶色谱法主要用于高聚物的相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试。

目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。

凝胶色谱法-分类根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，又可分为凝胶过滤色谱（GFC ）和凝胶渗透色谱（GPC ）。

凝胶过滤色谱一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。

凝胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂主要是水。

凝胶渗透色谱法主要用于有机溶剂中可溶的高聚物 (聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等) 相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。

凝胶色谱不但可以用于分离测定高聚物的相对分子质量和相对分子质量分布，同时根据所用凝胶填料不同，可分离油溶性和水溶性物质，分离相对分子质量的范围从几百万到100以下。

近年来，凝胶色谱也广泛用于分离小分子化合物。

化学结构不同但相对分子质量相近的物质，不可能通过凝胶色谱法达到完全的分离纯化的目的。

凝胶色谱系统凝胶色谱仪凝胶渗透色谱技术原理凝胶色谱法-分子筛效益一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。

大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。

小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。

凝胶色谱法添加摘要凝胶色谱法又叫凝胶色谱技术，是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。

凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。

凝胶色谱法主要用于高聚物的相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试。

目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。

凝胶色谱法-分类根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，又可分为凝胶过滤色谱（GFC和凝胶渗透色谱（GPC。

凝胶过滤色谱一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。

凝胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂主要是水。

凝胶渗透色谱法主要用于有机溶剂中可溶的高聚物（聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等）相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。

凝胶色谱不但可以用于分离测定凝胶色谱仪高聚物的相对分子质量和相对分子质量分布，同时根据所用凝胶填料不同，可分离油溶性和水溶性物质，分离相对分子质量的范围从几百万到100以下。

近年来，凝胶色谱也广泛用于分离小分子化合物。

化学结构不同但相对分子质量相近的物质,不可能通过凝胶色谱法达到完全的分离纯化的目的。

---------------------------- 愆虫凝胶渗透色谱技术原理凝胶色谱法-分子筛效益一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。

大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。

小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。

凝胶净化色谱
凝胶净化色谱是一种常用的生物分离技术，可用于分离、纯化和富集蛋白质、DNA、RNA等生物大分子。

该技术基于溶液中物质的分子大小、电荷、亲疏水性等物理化学特性，利用凝胶的孔隙结构和交联程度实现分离和纯化。

凝胶材料包括琼脂糖、聚丙烯酰胺、琥珀酸纤维素等，不同材料具有不同的孔隙结构和交联程度，可以选择不同的材料实现不同的分离效果。

凝胶净化色谱可分为大小分离色谱、离子交换色谱、亲和色谱等多种类型，其具有分离效果好、操作简便、纯化度高等优点，被广泛应用于生物化学、分子生物学、药物研发等领域。

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凝胶色谱层析是一种基于分子大小差异进行分离的色谱技术，也称为凝胶层析或凝胶过滤。

其定义如下：
凝胶层析是一种利用多孔凝胶作为分离介质的色谱技术。

在凝胶层析中，样品混合物被流动相带入凝胶柱或凝胶片中。

由于不同大小的分子在凝胶层中的扩散速率不同，大分子先被流动相冲出柱体，而小分子后流出。

因此，大小不同的分子被分离。

关于其分离原理，可以这样理解：
凝胶色谱的分离原理基于分子在凝胶基质中的不同扩散速率。

样品在多孔凝胶柱中随着流动相的移动，待分离的组分沿凝胶颗粒间的孔隙移动。

大分子由于尺寸较大，只能通过凝胶颗粒间的孔隙，因此移动路径较短，先流出色谱柱。

而小分子由于尺寸较小，可以扩散进入凝胶颗粒内部，因此迁移路径长，后流出色谱柱。

这样，不同大小的分子就实现了分离。

以上内容仅供参考，建议查阅专业生物化学书籍或者咨询专业人士以获取更准确的信息。

第七章凝胶层析定义：将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相，由于流经体积的差异，使不同分子量的组份得以分离的层析（色谱）方法，又叫扩散层析，排阻层析，分子筛层析第一节基本原理一.分离原理凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，内部具有网状筛孔，利用球状凝胶内的筛孔，使分子流过填充凝胶的管柱时，大分子无法进入凝胶筛孔，而只流经凝胶及管柱间的孔隙，很快就可以流出管柱，较小的分子因为进入凝胶内的筛孔，故在管柱内的停留时间较长，由此区分大小不同的分子，亦可与已知大小的分子作比较而定出一分子的分子量。

一般状况下，凝胶不会吸附成份，所有欲分离物质都会被洗出，这是凝胶层析法与其它层析法不同的地方。

凝胶层析分离的基本原理如下：凝胶层析介质分离的分子主要分3部分。

第——部分是全排阻分子，也可称之为上限分子，是不能起筛分作用的大分子。

第二部分是部分渗透分子，称为分离分子，是凝胶介质有效分离的分子。

第三部分是全渗透分子，称之为下限分子，是不能起筛分作用的小分子。

如图2—27所示。

从图2—27可以看出，A—B之间为该凝胶的有效分离范围．可分离相对分子质量范围是103一105，高于相对分子质量为105的是全排阻分子，低于相对分子质量为105的是全渗透分子。

二.参数的表示方法及其意义1.表示方法(1)柱床体积凝胶层析介质经溶胀、装柱、沉降、体积稳定后，所占层析柱内的总体积，称为柱床体积或床体积，以Vt(totle volume)表示，单位为m1。

(2)外水体积存在于柱床体积内凝胶颗粒之外、颗粒之间的空隙所占有的那—部分水相体积或溶剂体积，称之为外水体积或外体积、空隙体积，以Vo(outer volume)表示，单位为ml(3)内水体积是凝胶吸水溶胀后，存在于凝胶颗粒内所占有的那一部分水相体积或溶剂体积，称之为内水体积或内体积，以V i(inner volume)表示，单位为ml。

(4)凝胶体积是凝胶颗粒自身的体积．也就是床体积减去外水体积和内水体积后所占有的体积，称为胶体积或称干胶体积，以Vg(gel volume)表示，单位为ml。

吸附色谱分配色谱凝胶过滤色谱的分离原理吸附色谱、分配色谱和凝胶过滤色谱是常用的分离技术，它们分别基于不同的分离原理。

本文将详细介绍这三种色谱的分离原理和应用。

一、吸附色谱的分离原理吸附色谱是一种根据样品组分与固定相之间吸附平衡差异进行分离的技术。

其基本原理是样品中的组分在固定相上发生吸附作用，不同组分的吸附性质不同，从而实现分离。

常见的吸附色谱方法有气相色谱和液相色谱两种。

1. 气相色谱气相色谱是利用气体作为流动相，以吸附剂涂覆在固定相上进行分离的技术。

样品进入色谱柱后，根据样品组分与吸附剂的亲和性进行分离。

亲和性较强的组分在吸附剂上停留时间长，而亲和性较弱的组分则快速通过柱床。

通过测量样品组分在柱床中停留时间的长短，可以得到分离结果。

2. 液相色谱液相色谱是以液体作为流动相，将样品溶解在流动相中进行分离的技术。

根据不同的吸附剂、固定相和流动相，液相色谱又可分为几十种不同的分离方式，如反相色谱、离子交换色谱等。

二、分配色谱的分离原理分配色谱是根据样品组分在液相和固定相之间均匀分配的原理进行分离。

该技术适用于有机化合物的分离。

分配色谱依赖于样品分子在两个不相溶相中的平衡分配系数差异，即液相中样品分子在固定相和溶液中的平衡浓度比。

常见的分配色谱方法有液液分配色谱和气液分配色谱两种。

1. 液液分配色谱液液分配色谱是利用两种不相溶的液体相来进行分离的技术。

样品先溶解在一个氢溶剂中，再与另一个极性溶剂进行分离。

样品分子在两种液体相之间均匀分配，根据各自的溶解度、极性等特征，实现不同组分的分离。

2. 气液分配色谱气液分配色谱是将气体作为流动相，液体作为固定相进行分离的技术。

样品在气相和液相之间的分配系数不同，导致分离效果。

常见的气液分配色谱方法有蒸气压色谱和气相色谱。

三、凝胶过滤色谱的分离原理凝胶过滤色谱是一种利用凝胶材料的孔隙大小和形状特征分离不同分子量的技术。

凝胶材料通常是多孔的，通过孔隙对样品分子进行筛分。

凝胶色谱层析
凝胶色谱层析（Gel Chromatography）是一种常用的分离和分析
生物大分子的技术。

它基于不同分子的大小和形状差异，通过凝胶的
分子筛效应来实现分离。

凝胶色谱层析通常包括以下步骤：
1. 凝胶的选择：选择适当的凝胶，如琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶，根据待分离物质的大小和性质选择合适的凝胶孔径。

2. 柱子的制备：将凝胶填充到柱子中，确保凝胶均匀且无气泡。

3. 上样：将待分离的混合物加载到柱子的顶部。

4. 洗脱：使用适当的洗脱液，通常是缓冲液，将混合物通过柱子
进行洗脱。

大分子物质由于不能进入凝胶的孔径，会首先被洗脱出来，而小分子物质则会被凝胶保留较长时间。

5. 检测：在洗脱过程中，通过检测柱子出口处的洗脱液，可以监
测不同物质的洗脱时间和浓度。

6. 收集和分析：根据洗脱时间和检测结果，收集不同组分的洗脱液，并进行进一步的分析和鉴定。

凝胶色谱层析的优点包括分离效果好、操作简单、可重复性高，适用于分离和分析蛋白质、核酸、多糖等生物大分子。

它是生物化学、分子生物学和生物技术等领域中常用的分离和分析技术之一。

凝胶色谱柱分离案例
案例：分离复杂蛋白质混合物
背景：假设我们有一个复杂的蛋白质混合物，需要对其进行分离和纯化，以便进一步的功能和结构研究。

方法：通过凝胶色谱柱进行分离和纯化。

凝胶色谱是一种常见的蛋白质分离技术，基于蛋白质在凝胶柱中的不同亲和性来实现分离。

凝胶柱具有特定的静态和动态属性，可以选择性地吸附和洗脱特定的蛋白质组分。

步骤：
1. 准备样品：将复杂的蛋白质混合物溶解在适当的缓冲液中，并去除悬浮物。

2. 准备凝胶柱：选择合适的凝胶色谱介质和柱子，根据样品的特性和目标蛋白质进行选择。

常用的凝胶介质包括离子交换柱、分子筛柱和亲和柱等。

3. 样品加载：将样品加载到柱子中，通过重力流动或者使用液相色谱系统进行加载。

4. 柱洗脱：根据凝胶柱的性质和样品的特性，使用适当的缓冲液进行柱洗脱。

洗脱液可以是梯度缓冲液，也可以是特定的洗脱缓冲液，以达到分离目的。

5. 分馏和采集：根据柱洗脱过程中的吸光度或者其他检测方法，将感兴趣的分馏部分进行采集和进一步分析。

6. 纯化：对采集的蛋白质进行纯化，可以使用其他纯化技术，如电泳、冷冻干燥等，以获得高纯度的目标蛋白质。

效果：通过凝胶色谱柱的分离和纯化，我们可以将复杂的蛋白质混合物分离为不同的组分，从而方便进行后续的功能和结构研究。

第七章凝胶层析一、填空题1、凝胶层析的分离原理有、、。

这三种分离原理是互相补充的，在通常情况下起主导作用；的作用随流速增加而加强；只有在流速很高时才起作用。

2、琼脂糖凝胶的一个特征是分离的分子量范围非常大，其分离范围随着凝胶浓度上升而，颗粒强度随浓度上升而。

3、凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。

一般来说，细粒凝胶柱流速低，洗脱峰窄，分辨率，多用于等。

粗粒凝胶柱流速高，洗脱峰平坦，分辨率，多用于等。

4、在作分级分离时，为了提高分辨率，多采用比样品体积大倍以上的柱体积，以上的柱比，较吸液量、较粒的凝胶固定相。

5、溶质通过色谱柱时造成的峰加宽效应包括、、、。

6、葡聚糖凝胶的孔径大小取决于，其越小，凝胶孔径越；而琼脂糖凝胶的孔径却依赖于。

二、选择题1、凝胶层析中，有时溶质的Kd>1，其原因是（）A.凝胶排斥B.凝胶吸附C.柱床过长D.流速过低2、凝胶层析中，有时小分子溶质的Kd<1，其原因是（）A.水合作用B.凝胶吸附C.柱床过长D.流速过低3、在凝胶层析中样品各组分最先淋出的是（）A.分子量最大的B.体积最大的C.分子量最小的D.体积最小的4、为了进一步检查凝胶柱的质量，通常用一种大分子的有色物质溶液过柱，常见的检查物质为蓝色葡聚糖，下面不属于它的作用的是（）A.观察柱床有无沟流B.观察色带是否平整C.测量流速D.测量层析柱的外水体积5、在选用凝胶层析柱时，为了提高分辨率，宜选用的层析柱是（）A.粗且长的B.粗且短的C.细且长的D.细且短的三、名词解释1、全排阻：2、类分离：3、分级分离：4、柱比：5、操作压：6、全渗入：7、分离度R s：四、问答题1、试述公式V e=V0+K d V i 各字母的物理意义。

2、利用凝胶层析如何测定蛋白质的分子量？3、凝胶层析的应用主要有哪些？并说明其原理。