动物细胞的原代培养【学习资料】

动物细胞的原代培养细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织（或器官）取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养，使其不断生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。

细胞培养的突出优点，一是便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响；二是细胞培养便于人们对细胞内结构(如细胞骨架等)、细胞生长及发育等过程的观察。

其特点包括：大量实验材料；单一、纯粹细胞类型培养基的成分可控，即生长条件可控/全合成、无血清培养基；易于观察；易于操作。

细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的一种简便易行的实验技术。

一、实验目的了解动物原代细胞培养的基本方法及操作过程；初步掌握无菌操作方法；观察体外培养细胞的生长特征。

二、实验原理原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。

这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分散成单个游离的细胞，在人工培养下，使其不断地生长及繁殖。

直接从身故体内分离的细胞，在体外培养的过程中尚未发生细胞分裂、增殖的细胞即为原代培养细胞；原代培养细胞在一定条件下可以继续增殖，在数量上大量扩增，此时的细胞为继代培养细胞。

细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。

要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。

二是严格控制无菌条件。

三、实验用品1.器材①解剖剪、解剖镊、眼科剪、眼科镊、培养皿、纱布块、移液管、橡皮头、培养瓶、玻璃匀浆器、1.5ml离心管等。

上述器材均需彻底清洗、烤干、包装好，高压灭菌20min，备用。

②倒置显微镜、离心机、酒精灯、酒精棉球、试管架、记号笔、大头针、解剖板等2.试剂完全培养液不完全培养液90%小牛血清10％双抗（链霉素、青霉素）（1万单位/mL）加至约为100单位/mL7.4%NaHCO3调pH至7.0-7.2。

动物细胞原代培养一、【实验目的】1、学习并掌握动物细胞原代培养前各种器具的消毒方法2、学习并掌握动物细胞的机械切割和组织块原代培养方法二、【实验原理】1、原代培养也叫初代培养，是从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。

原代培养的细胞具有很多特点，其最大的优点是组织和细胞刚刚离体，生物学特性未发生很大变化，仍具有二倍体遗传性状，最接近和反映供体体内生长特性，因此原代培养细胞是研究基因表达的理想系统，也很适合做药物测试、细胞分化、疫苗制备等实验研究。

2、原代培养是建立各种细胞系的第一步，因此细胞原代培养技术是从事组织培养工作者应熟悉和掌握的最基本的技术。

3、原代培养最基本的方法，依据切割方式不同，可分为蛋白酶消化法和组织块直接培养法两种。

4、组织块直接培养法是指在无菌条件下，从有机体取下组织，用平衡盐溶液漂洗数次后剪碎，加培养液进行培养的方法。

是常用的、简便易行和成功率较高的方法。

5、依据组织块贴壁方式不同，又可分为薄层培养法和翻转干涸法两种。

本实验采用翻转干涸法。

6、酶消化法是指将组织剪成小块，然后用蛋白酶消化成单细胞悬液后，再接种培养的方法。

7、由于蛋白酶比较贵，以及组织块消化成单细胞的条件要求远较组织块法复杂，因此，采用组织块直接培养法的较多。

三、【实验仪器、试剂及材料】仪器：培养瓶（3个/人）、培养皿（1套/2人）、剪子和镊子（1套/人）、青霉素小瓶（1个/人）、滴管（1-2个/人）、移液管若干、冻存管(2个/人)等：试剂：PBS、MEM（含100IU/ml 青霉素和100ug/ml链霉素）等材料：泥鳅四、【实验步骤及内容】材料的预处理鱼类消毒1.将所需的一定量水（或海水）进行煮沸消毒处理。

2.冷却后，加入青霉素至终浓度1000单位/ml水（或海水），加入链霉素至终浓度1000单位/ml水（或海水）。

3.将实验用鱼放入经处理的消毒水（或海水）中浸泡24小时。

4.用纱布包裹将鱼取出，将其击昏。

实验五动物细胞的原代培养实验五动物细胞的原代培养一、实验目的1．了解原代细胞培养的基本方法及操作过程。

2．学习细胞消化、营养液的配制及酸碱度的调节。

3．初步掌握无菌操作方法。

二、实验原理细胞培养（cell culture）是用无菌操作的方法将动物体内的组织（或器官）取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养，使其不断地生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、分化以及衰老等过程。

细胞培养的突出优点是：便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响；便于人们对细胞内结构（如细胞骨架等）、细胞生长及发育等过程的观察。

因而细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的一种简便易行的实验技术，同时也不可忽略另一个困素，那就是它脱离了生物机体后的一些变化。

细胞培养技术目前已广泛地被应用于生物学的各个领域。

如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等。

为此有必要使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的内基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，对原代细胞（primary culture cell）与传代细胞（subculture cell）有一个基本的了解。

原代细胞培养又称原代培养（primary culture），是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，在体外培养，直到第一次传代为止。

这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分散成为单个游离的细胞，在人工培养下，使其不断地生长及繁殖。

细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。

要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节；二是严格控制无菌条件。

三、实验仪器、材料和试剂1．器材：解剖剪、解剖镊、眼科剪（尖头、弯头）、眼科镊（尖头、弯头）、培养皿、纱布块（或不锈钢网）、玻璃斗、量筒、试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、培养瓶（小方瓶或中方瓶）等。

动物细胞原代培养名词解释1.引言1.1 概述动物细胞原代培养是一种重要的实验手段，被广泛应用于生物学研究领域。

通过原代培养，科研人员可以将动物体内的细胞从组织或器官中分离出来，并在适当的培养条件下培养和繁殖这些细胞。

这种培养方法能够维持细胞的生长和功能，使其能够在体外环境下长期存活。

原代培养的过程可以分为两个主要阶段：细胞分离和细胞培养。

首先，需要将动物组织或器官进行机械或酶解分离，以获得单个的细胞悬浮液。

然后，将这些分离的细胞种植在含有适当培养基和营养物质的培养皿中，提供合适的温度、湿度和氧气条件，使细胞得以生长和分裂。

通过原代培养，科研人员可以获得大量的动物细胞来进行各种实验和研究。

这些细胞可以用于研究细胞的生理功能、细胞周期、细胞信号传导以及疾病模型的建立等。

此外，通过原代培养还可以进行细胞遗传学研究、药物筛选和细胞工程等领域的实验。

总而言之，动物细胞原代培养是一种重要的实验手段，可以为科研人员提供源源不断的动物细胞来进行各种研究。

它为细胞生物学、医学研究以及药物开发等领域的进展提供了坚实的基础，并在解决许多科学问题中扮演着重要的角色。

文章结构指的是文章的组织框架和布局。

它的作用在于使读者能够清晰地理解整篇文章的内容和结构，从而更好地把握文章的主旨和论证思路。

本文按照以下结构进行组织和呈现：1. 引言1.1 概述在这一部分，将对动物细胞原代培养的基本概念和背景进行简要介绍，引起读者的兴趣，并提出研究的意义。

1.2 文章结构（即本节内容）在这一部分，将对整篇文章的结构进行概述，介绍各个章节的内容以及它们在整篇文章中的作用。

1.3 目的在这一部分，明确研究动物细胞原代培养的目的，说明研究的意义和价值，为读者提供清晰的导向。

2. 正文2.1 原代培养详细介绍什么是原代培养，原代培养的步骤和方法，以及原代培养在细胞研究中的重要性和应用领域。

2.2 动物细胞介绍动物细胞的结构和特点，包括细胞膜、细胞质、细胞核等重要组成部分，以及动物细胞在生物学研究和医学领域中的应用。

动物细胞原代培养实验目的：（1）掌握无菌操作方法；（2）掌握原代细胞培养和传代细胞培养技术；（3）熟悉体外培养细胞的观察方法实验原理直接从机体获取的细胞进行的培养称为原代培养。

无菌摘取动物的组织（或器官），用生理盐水洗净血污后直接用组织块法培养，或采用酶消化法培养。

在人工培养条件下，使细胞不断增殖生长。

原代培养是建立各种细胞系的第一步，利用原代培养技术可在体外研究各种类型细胞增殖、遗传、变异、分化和去分化。

离体培养的细胞群体增殖达到一定密度时,细胞的生长和分裂速度就会减慢甚至停止，如不及时分离传代培养，细胞将逐渐衰老死亡。

传代培养是指细胞从一个培养瓶以1：2或其他比率转移，接种到另一培养瓶的培养。

贴壁培养细胞的传代通常是采用胰蛋白酶消化，把细胞分散成单细胞再传代，而悬浮型生长细胞的传代则用直接传代法或离心传代法。

实验仪器、材料和试剂：（1）仪器、用具：倒置显微镜、电热恒温水浴锅、天平、CO2培养箱、高压锅、超净工作台、离心机、解剖剪、解剖刀、眼科剪、眼科镊、培养皿、锥形瓶、容量瓶、纱布、培养瓶、移液枪、酒精灯、酒精棉球、试管架等。

（2）材料：小白鼠（3）试剂：1）基础培养基：90%RPMI1640培养液+10%新生牛血清+双抗（青霉素、链霉素100U/ml），调PH至6.8～7.0，0.22μm孔径的滤膜过滤灭菌分装后置4℃冰箱待用。

2）无钙镁PBS（PBS(-)）缓冲液的配制:称取NaCl10.00g,NaHPO4.12H2O1.44g,KCl0.25g,KH2PO40.25g,用四蒸水将试剂溶于500ml烧杯中，磁力搅拌器搅拌直至完全溶解后，用1000ml容量瓶定容，摇匀，分装于200ml 的玻璃瓶中，15磅高压灭菌30min，4℃冰箱保存。

3）称取胰蛋白酶0.25g 和EDTA0.04ｇ，溶入100mlPBS中，常温磁力搅拌器搅拌直至彻底溶解，用0.22μm孔径的滤膜过滤，无菌条件分装成小瓶（4ml/瓶），－20℃冰箱冻存。

动物细胞原代培养和传代培养中的培养方法1. 引言嘿，大家好！今天咱们聊聊动物细胞的培养，听起来可能有点高大上，但其实就像种花一样，只是“花”是细胞，养护的方法也有讲究。

说白了，细胞也有自己的“家”，咱们得给它们创造个舒适的环境，让它们在里面嗨起来！接下来，我就带你走进这个充满神奇和乐趣的细胞世界。

2. 原代培养2.1 什么是原代培养？原代培养，简单来说，就是从活体动物身上直接提取细胞，然后把它们放在培养皿里，就像把新鲜的花插进水里一样。

你知道吗，这些细胞就像刚从大自然里来的小家伙，特别活泼，适应能力强。

不过，这可不是随便就能搞定的，得有点技术活。

2.2 原代培养的方法首先，咱得准备好一切工具，这可是基础中的基础，不能马虎。

咱们要用到无菌技术，确保培养环境干净得像新洗的碗，不然细胞们就会遭殃。

提取细胞时，通常会用胰酶把它们从组织中“松开”，就像剥开一个大榴莲，里边的果肉才好吃嘛。

然后，把这些细胞放到培养基里。

培养基就像细胞的“快餐”，里面有细胞需要的各种营养物质和生长因子。

要记得，细胞也要“吃好”，才能长得壮壮的，不然就不成气候了。

培养的环境也不能小看，温度、pH值、二氧化碳浓度都得保持稳定。

咱们得把细胞放在适合的温度下，就像给它们开个温暖的“家庭聚会”。

如果环境不合适，细胞就会抗议，甚至罢工！3. 传代培养3.1 什么是传代培养？说到传代培养，那就是把原代培养中的细胞继续繁殖，让它们“生儿育女”。

这就像一个大家庭，越来越壮大，热闹得不得了。

传代培养可以让我们获得更多细胞，方便后续的实验和研究。

3.2 传代培养的方法传代培养的关键在于及时分离细胞，咱不能让细胞们挤在一起，这样容易“打架”。

通常，当细胞长满培养皿后，就需要把它们分离开。

这个过程又得用到胰酶，跟原代培养一样，轻轻松松把它们从皿里“请”出来。

接下来，咱们需要把细胞分到新的培养皿里，再给它们加上新鲜的培养基，确保它们能继续健康成长。

注意，细胞们需要一点时间适应新环境，就像搬家后要习惯新居的味道一样。

动物细胞原代培养一、剪取组织颈椎脱臼法处死小鼠，放在100ml的烧杯中用70％乙醇消毒3min。

用剪刀剪开腹部，取出肾、肝、脾（任意一种脏器）。

1、将小白鼠断颈处死，然后用75%酒精或1‰ 新洁尔灭浸泡消毒，迅速进入无菌室。

2、将小白鼠置超净工作台上，打开腹腔二、清洗在盛有PBS 液平皿中洗涤数次，剔除包膜、结缔组织，将剔除后脏器放入另一盛有PBS 平皿中。

三、剪切将肾、肝、脾剪成1mm3 （剪成肉末状）大小的组织块，再次清洗，洗去残留的血细胞，以备消化。

四、消化1、在50ml离心筒中加入0. 25％胰蛋白酶溶液25ml，在温暖的环境中或置于37 °水浴摇床中轻轻摇动15min，转速约为180r/min。

2、让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌50ml的离心管中，该管内按照每10ml上清加入l ml小牛血清的比例加入牛血清以灭活胰蛋白酶。

（小牛血清在共用无菌操作台上取用）3、在离心管中残留未消化组织块中再次加入胰蛋白酶进行消化，重复步骤1和2。

五、制备单细胞悬液1、将混合的细胞悬液离心，1200rpm，5min，弃上清。

2、将沉淀用新鲜的无菌PBS重悬，再1000-1200rpm，5min离心。

3、用PBS反复洗涤细胞直至上清清亮为止,然后再按照（1）进行离心，离心后弃去上清液，将沉淀用少量细胞培养液反复吹打。

制的细胞悬液。

六、接种1、将细胞悬液接种到细胞培养瓶中。

2、用滤器过滤RPMI1640再悬沉淀，并使终体积为20ml。

（RPMI-1640RPMI是Roswell Park Memorial Institute的缩写，代指洛斯维.帕克纪念研究所。

RPMI是该研究所研发的一类细胞培养基，1640是培养基代号。

其中含有10%胎牛血清。

）七、培养1、在培养瓶外做好标记（标明所培养细胞的名称和时间），2、置于CO2的孵箱中培养，3、72h后即可观察。

动物细胞原代培养流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

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动物细胞原代培养流程
1. 取材。

- 从健康动物体内取出所需组织，如肝脏、肾脏等，尽量选择新鲜、无菌的组织材料。

- 取材过程要迅速，减少组织暴露在外界环境中的时间，以降低污染风险。

2. 组织处理。

- 将取出的组织块用平衡盐溶液（如PBS）清洗，去除表面的血液、杂质等。

- 把组织剪成小块，一般为1 - 3mm³大小，便于后续消化。

3. 消化。

- 加入适量的消化酶（如胰蛋白酶或胶原酶），在适宜的温度（通常为37°C）和时间（根据组织类型和酶的活性而定）下进行消化。

- 消化过程中可轻轻摇晃容器，使消化酶与组织充分接触。

4. 终止消化。

- 当组织块变得松散，大部分细胞游离出来时，加入含血清的培养液终止消化。

血清中的某些成分可以抑制消化酶的活性。

5. 过滤。

- 将消化后的细胞悬液通过滤网（如200目滤网）过滤，去除未消化完全的组织块。

6. 离心。

- 将过滤后的细胞悬液进行离心，转速一般为1000 - 1500r/min，离心时间5 - 10分钟。

- 离心后弃去上清液，得到细胞沉淀。

7. 细胞计数与活力检测。

- 用适量的培养液重悬细胞沉淀，然后进行细胞计数（可使用血球计数板等工具）。

- 同时检测细胞活力（如台盼蓝染色法，活细胞不着色，死细胞被染成蓝色）。

8. 接种培养。

- 根据细胞计数结果，将适量的细胞接种到培养容器（如培养瓶、培养皿）中。

- 加入适量的培养液，放入培养箱中，在适宜的温度（37°C）、湿度（95%左右）和二氧化碳浓度（5%）下进行培养。

实验五细胞的原代培养和传代培养1. 实验目的初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程。

2. 实验指导细胞培养(cell culture)是从机体中将细胞取出后，在模拟生物体内生理条件下使其在体外生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命活动过程的方法。

进行细胞生物学、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。

近年来，广泛应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成为一种重要的生物学技术。

细胞培养一般可分为原代培养和传代培养。

所谓原代培养，是指由体内取出组织或细胞进行的首次培养，也叫初代培养。

原代培养离体时间短，遗传性状和体内细胞相似，适于做细胞形态、功能和分化等研究。

一般动物和人的所有组织都可以用于培养，但幼体组织和细胞(如胚胎组织、幼仔的脏器等)更容易进行原代培养。

传代培养则是为了使体外培养的原代细胞或细胞株在体外持续生长、繁殖。

细胞持续生长繁殖就必须传代，并由此获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞。

培养的贴壁细胞形成单层汇合后，由于密度过大、生存空间不足而引起营养枯竭。

将培养的细胞分散，从容器中取出，以1：2或1：3以上的比例转移到另外的容器中继续进行培养，即为传代培养。

要使细胞在离体情况下生长繁殖，培养条件必须尽可能接近体内，除营养物质外，温度、PH值、生长因子等也至关重要。

此外，还应避免细菌及其他微生物的污染，重金属离子及有毒化学物质及放射线的影响。

贴壁细胞通过质膜表面的粘着蛋白贴附于培养瓶表面。

加入消化液可使粘着蛋白部分水解，从而使培养的细胞游离。

但消化时间不可过长，否则可能导致细胞解体死亡。

常用的消化液为胰蛋白酶和EDTA。

二者可分别使用，也可共同使用。

钙离子是二者的抑制剂，故实验中消化结束时，加入含有钙离子的全培养液，即可终止消化。

细胞的一代是指细胞从接种到分离再培养的一段时间，与细胞世代或倍增不同，在一代中细胞倍增3～6次。

细胞传代后一般经过三个阶段：游离期、指数生长期和停止期。

实验三动物细胞原代培养及观察一、实验目的1.学习并掌握动物细胞原代培养前各种器具的消毒方法。

2.学习并掌握动物细胞的机械切割和组织块原代培养方法。

二、实验原理原代培养也叫初代培养，是从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。

原代培养的细胞具有很多特点，其最大的优点是组织和细胞刚刚离体，生物学特性未发生很大变化，仍具有二倍体遗传性状，最接近和反映供体体内生长特性，因此原代培养细胞是研究基因表达的理想系统，也很适合做药物测试、细胞分化、疫苗制备等实验研究。

原代培养是建立各种细胞系的第一步，因此细胞原代培养技术是从事组织培养工作者应熟悉和掌握的最基本的技术。

原代培养最基本的方法，依据切割方式不同，可分为蛋白酶消化法和组织块直接培养法两种。

组织块直接培养法是指在无菌条件下，从有机体取下组织，用平衡盐溶液漂洗数次后剪碎，加培养液进行培养的方法。

是常用的、简便易行和成功率较高的方法。

依据组织块贴壁方式不同，又可分为薄层培养法和翻转干涸法两种。

本实验采用翻转干涸法。

酶消化法是指将组织剪成小块，然后用蛋白酶消化成单细胞悬液后，再接种培养的方法。

由于蛋白酶比较贵，以及组织块消化成单细胞的条件要求远较组织块法复杂，因此，采用组织块直接培养法的较多。

三、主要仪器与试剂1.实验仪器：培养瓶、培养皿、剪子和镊子、青霉素小瓶、滴管、移液管若干、冻存管、乳胶头2.实验试剂及材料：PBS、MEM（含100IU/ml 青霉素和100ug/ml链霉素）、泥鳅四、实验步骤（一）材料的预处理1.将所需的一定量水（或海水）进行煮沸消毒处理。

2.冷却后，加入青霉素至终浓度1000单位/ml水（或海水），加入链霉素至终浓度1000单位/ml水（或海水）。

3.将实验用泥鳅放入经处理的消毒水（或海水）中浸泡24小时。

4.用纱布包裹住将泥鳅取出，将其击昏。

（二）原代培养1.将欲取材部位如心脏、鳍、肝脏、肌肉等剪下，放入已灭菌的培养皿中。

2. 用75%酒精漂洗一次后，去除皮下脂肪和结缔组织。

动物细胞的原代及传代培养一、试验目的1、了解动物细胞原代培养的原理及基本方法，掌握组织块法及消化培养法的操作过程，掌握无菌操作的技术要领；2、了解传代培养方法及操作过程，学习观察体外培养细胞的形态及生长情况。

二、实验原理动物细胞的原代培养是指把直接从动物获得的细胞、组织或器官在体外培养直至第一次传代为止。

要求在严格无菌的条件下对动物进行切割成组织块或经消化液使组织细胞游离为单个细胞，然后在人工配制的营养液内使其不断地生长和繁殖。

传代培养是指将细胞从一个培养瓶以1：2或1：2以上的比例转移、接种到另一培养瓶的培养过程。

三、实验材料和试剂鸡胚，HeLa细胞实验器材：无菌工作台，细胞培养箱，离心机，无菌解剖器材，培养皿，培养瓶，滴管等。

实验试剂：平衡盐液，细胞消化液，培养液四、实验步骤（一）动物细胞的原代培养1、取材①将鸡蛋用酒精消毒，用剪刀敲破鸡蛋的圆端，剥壳去膜，倒掉壳内的液体；②拉出鸡胚，剪去头后置于装有Hank液的培养皿内，用Hank液清洗；③然后用镊子小心拔掉鸡胚的毛，将拔完毛的鸡胚。

2、组织块培养法①剪取背部及大腿部的皮肤肌肉组织十余块于培养皿中，用剪刀剪成1mm3大小的组织块；②用弯头吸管吸取组织块送入培养瓶底部，均匀排列；③翻转培养瓶后吸取3管培养液，滴入到培养瓶内（注意：吸管不能碰到瓶口）；④标记在培养瓶写上“原代”，写上姓名和学号。

3、消化培养法①剪取十余块组织块放入干净的培养皿中，吸取3-5管消化液，放入37℃的培养箱中消化10-20min，到组织变成松散、粘稠状，然后加入1管营养液（停止消化）；②取一只干净的细管将组织块打散，放置一段时间，用吸管吸取上清液于离心管中，离心10min；③倒掉上清液，用营养液悬浮沉淀，转入干净的培养瓶中，加入适量的培养液，37℃的培养箱中培养；④标记在培养瓶写上“消化”，写上姓名和学号。

（二）动物细胞的传代培养①取已长成单层HeLa细胞的培养瓶，倒掉培养液，加入3管消化液，37℃条件下消化2-5min，在显微镜下观察细胞单层出现缝隙，倒去消化液，停止消化；②加入3-4管培养液，用弯头吸管反复吹打壁上的细胞层（尽量不形成气泡），添加2-4管培养液；③用吸管吸取一半左右细胞悬液，分装到另一个培养瓶中；④作标记，注明细胞代号、日期和操作者姓名；⑤37℃静置培养，24小时后即可观察。