《泌尿外科杂志（电子版)》2016年第8卷第2期SMAD4泛素化调控介导 TGF- p通路信号转导的研究进展卢国良综述夏庆华审校(山东大学附属省立医院泌尿微创中心，山东济南250014)T G F-p超家族蛋白成员作为一种多效细胞 信号分子普遍存在于各种基本生物进程当中，包 括诱导胚胎胚芽层生长、维持成人组织体内稳态 等[1]。
与其多效性相对应的，T G F- p信号通路缺 陷与癌症发生、组织纤维化、生长缺陷密切相关[2]。
T G F-p配体与胞膜上的跨膜激酶受体复 合体结合，导致R- S M A D的丝氨酸C端残基磷酸 化，磷酸化后的R- S M A D s与S M A D4结合转运至 胞核，与转录因子特异性启动子相结合调节基因 表达。
因此，S M A D4作为T G F - p通路上的关键 蛋白，对介导该通路的信号传导具有重要作用[3’4]。
越来越多的研究表明，多种调节机制确保S M A D4蛋白的活动受到严格控制，进而调节细胞 对T G F-p信号通路的反应。
其中某些机制涉及 对信号通路级联反应的磷酸化修饰，比如对 S M A D4蛋白的磷酸化修饰。
S M A D4的磷酸化调 节曾被认为是调控T G F- p信号通路的主要方式 之一，磷酸化的S M A D4是T G F- p信号通路激活 的标志。
最近，泛素化对S M A D4和受体相关型 S M A D S(R- S M A D)功能调节这一重要的作用被广 泛关注[5]。
S M A D4泛素化导致的蛋白酶体降解被 认为是一种调节T G F- p信号通路转导的机制[6];在研究T G F- p信号通路依赖的去泛素酶时发现S M A D4蛋白同时存在单泛素化修饰过程，这提示 S A M D4蛋白持续的单泛素化与去泛素化循环是 T G F- p信号通路转导过程所特有細象[7’8]。
已有体外研究证实在前列腺癌细胞中，单泛素化 S M A D4蛋白水平升高，这提示S M A D4蛋白的泛素 化修饰过程与肿瘤的发生发展存在密切联系[，0]。
因此，笔者将总结S M A D4蛋白泛素化修饰及单泛 素化与去泛素化循环的最新研究进展及其对肿瘤 细胞的影响。
泛素化进入人们的视野始于对哺乳动物H E C T结构域泛素酶smurf1、smurf2的研究，这两 种酶被认为是T G F - p信号通路上负性调控因子[11’12]。
随后，该通路中其他具有生物活性的E3 泛素连接酶被陆续发现。
这其中又包括H E C T结 构域泛素酶—Nedd4L、Wwpl/Tiull和 Aip4/ Itch，RIN G结构域泛素酶---Arkadia、Highwire 和Ectodermin/T i f1 - 7/Trim33。
泛素化作为一'种调节 机制广泛参与到各种细胞生物进程当中，如细胞 周期反应、D N A损伤修复、信号通路转导等[13]。
泛素化是泛素多肽通过三种酶的顺序催化作用，以共价连接方式结合于目的蛋白的过程_泛素 激活酶E1激活泛素多肽，泛素结合酶E2将激活 的泛素多肽转运至目的蛋白，泛素连接酶E3通过 促进泛素结合酶E2同目的蛋白的结合从而提高.综述.泛素多肽的转运效率。
同其他翻译后修饰相比，泛素化是一种可逆 的过程[14]。
泛素多肽可作为单体共价连接于单个 赖氨酸(单泛素化），或者多个泛素多肽共价连接 于多个赖氨酸残基上（多泛素化），亦或多个泛素 多肽串联连接于同一个赖氨酸残基上（聚泛素 化）。
此外，根据泛素多肽内部赖氨酸7种不同的 位置（K48、K63、K29)，多聚泛素链还承担着不同 的功能，从而使泛素化可以广泛参与到各种调节 监管机制当中。
例如:K48位点连接的聚泛素化可 触发蛋白酶体的降解，N F- k B通路中K63位点连 接的聚泛素化可作为蛋白间相互作用的支架，或 参与到表皮生长因子信号通路介导的囊泡分泌过 程当中。
泛素化过程是可逆的，细胞可以通过超 过100种的各类去泛素酶逆转被泛素化修饰的目 的蛋白，从而使系统“复位”或从一种泛素化形式 “切换”到另一种形式[15]。
泛素-溶酶体降解途径是普遍存在于细胞内 降解蛋白的方式之一，在这种机制下，目标蛋白首 先与泛素多肽共价结合，然后转运至溶酶体内被 降解。
S M A D4作为T G F-p信号通路中的关键分 子，也存在泛素化降解的调节过程[16]。
Anita M o r e i等人勺研究证实在S M A D4蛋自分子中存 在M H1和M H2两个结构域。
正常S M A D4分子的 泛素化调节发生在M H2结构域，此结构域内以单 泛素化调节为主，调节过程将在下文内详述。
当S M A D4蛋白发生致癌突变时，错义突变的S M A D4 蛋白的泛素化调节发生在M H1结构域，在此种情 况下，S M A D4蛋白将被聚泛素化进而经溶酶体降 解[17]。
对于参与突变S M A D4蛋白泛素-溶酶体途径降解的麟以及泛素化修饰的地点，Lei Y a n g等 人和Mei W a n等人的研究分别给出了合理的解 释。
在这两个研究中，SCFp -TrCP1是E3泛素连 接酶复合体中 Skp1 - Cullin- F- box protein(S C F)的一种，也是催化S M A D4泛素修饰的主要酶类。
Lei Y a n g的研究证明在急性粒细胞白血病中，S iRN A沉默SCFp -TrCP1的达会引起错义突变的S M A D4蛋白水平上升，而Mei W a n的研究表明 在S C F p-TrCP1缺失的胰腺癌细胞当中，错义突 变的S M A D4蛋白水平以及总S M A D4蛋白水平均 高于S C F p-TrCP1正常胰腺癌细胞，免疫组化显 示在胰腺导管腺癌细胞中S M A D4蛋白也处于一 个较低的水平，而这正是由于与SCFp -TrCP1结 合后泛素化修饰造成的[18]。
该研究认为突变S M A D4的泛素化降解过程并不是-个偶然发现，通过对胰腺癌细胞内大量突变S M A D4蛋白的系 统检测显示大部分突变蛋白都存在蛋白稳定性下 降，结构降解的现象，并且与SCFp -TrCP1相互作 用增强。
此前有报道指出Skp2作为S C F复合体 中另一种E3连接酶也可与多种蛋白底物结合并 对其进行泛素化修饰，但Anita M o r e S的研究显示 在人肾上腺293T细胞中转染突变S M A D4质粒，利用免疫共沉淀实验检测显示突变的S M A D4分 子与SCFSKp2之间并无明显相互作用，因此认为 SCFSKp2并无E3连接酶活性也不能催化S M A D4 蛋白的泛素化降解过程[19]。
但Min Liang等人的 研究结果与此相反，在他的研究中认为突变的S M A D4蛋白正是由于与SCFSKp2的快速结合，从 而导致S M A D4突变蛋白的持续降解[20]。
作为T G F - p信号通路的重要转导蛋白，S M A D4需要与磷酸化的R- S M A D s形成异源二聚 复合物转运至核内行使功能。
与S M A D4突变分 子的调控机制相比，S M A D2分子也存在类似于S M A D4分子调控机制，S M A D2分子M H1结构域 的突变会导致其迅速被泛素化降解[21]。
JingXu 等人的研究证实了这一观点。
然而，令人意外的 是S M A D2分子M H1结构域突变并不会影响通路 上游分子对其磷酸化修饰，也不会阻止其与S M A D4分子的结合，相反，S M A D2突变分子的降《泌尿外科杂志（电子版)》2016年第8卷第2期解发生于核内，从而降低了 293T细胞对于T G F- p 信号通路刺激的敏感性。
这提示S M A D4分子 M H1结构域突变是否也具有类似的调控作用[22]。
最近，Hadrien D e m a g n y的一项研究对此提供了一 个合理的解释，W n T通路中的G S K3对S M A D4蛋 白的顺序性磷酸化可引起SCFp-T r C P l催化的聚 泛素化修饰过程，S M A D4的顺序磷酸化位点介于 M H1与M H2结构域之间，而SCFp-T r C P l可以识 别磷酸化的S M A D4并与之结合。
但该研究并未 明确指出被磷酸化的S M A D4蛋白是否突变。
进 一步研究发现，W n T通舰过G S K3诱导的磷酸化 S M A D4蛋白与T G F-p信号通路实现交互。
这也 提示笔者对S M A D4分子的调控存在多种通路多 种机制共同作用，S M A D4分子的泛素化修饰可能 是由于某种“扳机”分子的激活引起的[23]。
近十年来，随着对诸如D N A修复、组蛋白调 控、膜受体信号转导、肿瘤抑制分子调控等诸多领 域的大量观察研究，单泛素化作为一种通用的调 节蛋白功能的机制，而非蛋白破坏的提示信号受 到越来越多的关注[24’25]。
同磷酸化相比，单泛素 化可调节蛋白活性和亚细胞定位、构成或覆盖蛋 白-蛋白相互作用表面、可被用作非依赖目的蛋 白水平的时间或空间上的调控机制并可以被去泛 素酶快速逆转。
研究表明Tifl- 7是保护动物外 胚层发育所必需的，此外胚层位于动物胚胎区，介 于Nodal和T G F - p信号通路诱导产生的内胚层 与中胚层之间。
在外胚层内，Ecto/Tifl- y限制 B M P信号通路作用，使外胚层细胞均衡地分化为 表皮细胞和神经谱系。
相应的，Ecto/Tifl- 7同时制约着人獅胞对T G F- p和B M P信号通路的 反应[26]。
作为T G F-p通路的转导因子，S M A D4可与 Ecto/Tifl- 7结合，并被其泛素化。
非洲爪蟾的 Ecto/Tifl- y敲出实验证明，对促进S M A D4的核 外转运以及维持结肠癌S M A D4等位基因Rl00T 的不稳定性来说，Ecto/Tifl-y是必需的。
与此 观察结果相一致的是Ecto/Tifl-y的R I N G区域 突变也会导致其对S M A D4的抑制特性消失，因此 Ecto/Tifl-y作为S M A D4的泛素连接酶可起到 拮抗S M A D4的作用[7’28]。
S M A D4的泛素化过程 作为调节T G F- p信号通路关键一步的作用随后 被去泛素化酶F A M/UsP9x所证实，F A M/UsP9x是 维持S M A D4活性所必需的酶[9]。
在Sirio Dupont 等人的研究中，F A M/U sp9x通过逆转单泛素化的 S M A D4激活T G F- p信号通路，以此对抗Ecto/Tifl-y对该通路的抑制作用。
在包括非洲 爪蟾胚胎细胞在内的几种细胞中，S M A D4可被部 分单泛素化，并受内源性Ecto/Tifl-y和F A M/ Usp9x水平的影响。
